Snel

Het algemene doel van deze procedure is om een snelle in situ hybridisatie uit te voeren op met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel. Dit wordt bereikt door eerst hersenweefselcoupes te dehydrateren en de coupes te behandelen met reagentia voor voorbehandeling één, twee en drie. De tweede stap is het hybridiseren van de coupes met primaire oligonucleotide-sondes en vervolgens met tweede, derde en vierde sondes.

Voeg vervolgens fast red substraat toe om het doel-RNA te detecteren. De laatste stap is het kwantificeren van het mRNA-signaalniveau met Image J-software. Uiteindelijk kunnen veranderingen in de RNA-genexpressie worden verkregen door de experimentele groep en de controlegroep met elkaar te vergelijken.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat deze relatief eenvoudig, goedkoop en reproduceerbaar is, en minder dan twee dagen in beslag neemt om te voltooien. Dit werk is ontwikkeld door mijzelf en John Jay Lenan van de Ross University School of Veterinary Medicine en Jean Soza en RU Tao van het College of Medicine, Florida Atlantic University. Bij deze procedure voor dehydratie worden vier objectglaasjes genomen uit de objectglashouders die bewaard zijn in de vriezer van -80 °C.

Wijs de secties toe aan de tests van P-P-I-B-D-A-P-B en HT twee A-genen, en markeer en label deze met een balpen. Dompel de objectglazen vervolgens vijf minuten onder in 100% alcohol bij kamertemperatuur. Droog de objectglazen daarna vijf minuten in de zuurkast. Pipetteer voor de voorbehandeling 20 µL van het voorbehandelingsreagens 1 op elke sectie en plaats de objectglazen op een rekrail in een bevochtigingsbak.

Schud de vochtbak voorzichtig op een horizontale schudder met een lage snelheid gedurende 10 minuten. Was de coupes vervolgens twee keer met dubbel gedestilleerd water gedurende twee minuten. Dompel de coupes onder in een bekerglas van 1000 milliliter met 450 milliliters van het voorbehandelingsreagens twee.

Kook vervolgens de objectglazen in totaal vijf minuten bij 100 °C om de RNA-structuur te herstellen. Was de objectglazen daarna twee keer gedurende twee minuten met dubbel gedestilleerd water. Plaats de objectglazen vijf minuten in 100% alcohol.

Droog de objectglaasjes vervolgens gedurende vijf minuten. Teken in de zuurkast met een hydrofobe pen een cirkel rond het geselecteerde gebied in de weefselsectie. Pipetteer daarna 10 µL van het voorbehandelingsreagens drie in elk geselecteerd gebied om de penetratie van de probe te verhogen en sluit de bevochtigingsbak af met een deksel.

Plaats vervolgens het plateau in de hybridisatieoven die is uitgerust met een horizontale schudmachine. Stel de oventemperatuur in op 40 °C en schud het plateau voorzichtig gedurende 30 minuten. Was de coupes daarna twee keer gedurende twee minuten per keer met dubbel gedestilleerd water. Pipetteer in deze stap 10 µL P-P-I-B-D-A-P-B of HTR two A-sonde op de geselecteerde gebieden.

Dek vervolgens de vochtbak af met een deksel om verdamping van het reagens te voorkomen. Schud de coupes voorzichtig op de horizontale schudmachine bij een lage snelheid terwijl ze twee uur lang bij 40 °C in de oven worden geïncubeerd. Was de coupes daarna twee keer gedurende telkens twee minuten met wasbuffer en pipetteer 10 µL van reagens amplificatie één op elk geselecteerd gebied.

Schud en incubeer de slides 30 minuten lang bij 40 °C. Was de slides vervolgens tweemaal gedurende twee minuten per keer met wasbuffer en pipetteer 10 µL van reagens twee voor amplificatie op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides 15 minuten lang bij 40 °C.

Was daarna de objectglazen twee keer gedurende twee minuten met wasbuffer. Pipetteer elke keer 10 µL van het amplificatiereagens drie op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de objectglazen 30 minuten bij 40 °C.

Was de preparaten vervolgens twee keer gedurende twee minuten met wasbuffer. Pipetteer 10 µL van het amplificatiereagens vier op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de preparaten 15 minuten bij 40 °C.

Was daarna de objectglazen twee keer gedurende twee minuten met wasbuffer. Pipetteer 10 µL van amplificatiereagens vijf op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de objectglazen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

Was daarna de slides tweemaal gedurende twee minuten met wasbuffer. Pipetteer 10 µL van amplificatiereagens zes op elk geselecteerd gebied. Schud en incubeer de slides gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.

Was de objectglazen vervolgens opnieuw tweemaal met wasbuffer gedurende telkens twee minuten. Pipetteer nu 10 µL van het rode reagens op elk geselecteerd gebied, plaats de objectglazen in de bevochtigingsbak op de horizontale schudder bij kamertemperatuur en schud voorzichtig op lage snelheid gedurende 10 minuten. Was de objectglazen daarna tweemaal met dubbel gedestilleerd water gedurende 10 minuten.

Droog de coupes telkens 15 minuten in de oven bij 60 graden Celsius. Plaats de coupes daarna gedurende vijf minuten in xyleen in de zuurkast. Pipetteer vervolgens 20 microliters xyleen-gebaseerd montage-medium op elk geselecteerd gebied en dek dit af met een dekglas.

Sleep in deze stap het afbeeldingsbestand naar het hoofdvenster ImageJ. Ga naar de menubalk en selecteer Image. Selecteer vervolgens Type uit het vervolgkeuzemenu en kies 8-bit.

Selecteer vervolgens 'adjust' en kies daarna voor 'threshold' om het dialoogvenster te openen. Pas de waarde van de onderste balk in het dialoogvenster aan zodat de ongewenste achtergrond wordt verwijderd. Ga naar de menubalk en selecteer 'Analyze', en kies vervolgens 'analyze particles' om een tweede dialoogvenster te openen.

Stel de partikelgrootte in op 10. Selecteer vervolgens 'toon omtrekken' en selecteer 'toon resultaten' en 'samenvattingsvakken'. Klik ten slotte op OK om de partikelgegevens in de dialoogvensters te bekijken.

Voer voor de berekening in de spreadsheet de gegevens in het Excel-blad in en bepaal het gemiddelde aantal partikels in de zoutoplossingsgroep als basislijn. Bereken vervolgens het percentage van elke sectie en maak op basis daarvan een grafiek. Hier zijn de lichtmicroscopische beelden van de hybridisatiesignalen, aangegeven door de rode stippen.

Weefsels werden gefixeerd met paraformaldehyde in diep geanestheseerde ratten die vooraf waren behandeld met saline en MDMA. De gebruikte oligonucleotidesondes zijn D-A-P-B-P-P-I-B en HT two A. Deze figuur toont het effect op de genexpressie van HT two A in de hypothalamus bij ratten die vooraf met MDMA waren behandeld, waarbij een reductie van 20% in de expressie van HT two A werd waargenomen. Deze techniek maakt het voor onderzoekers in het vakgebied van de neurowetenschappen eenvoudiger om de genexpressie van boodschapper-RNA te meten, met behulp van in situ hybridisatie op met paraformaldehyde gefixeerd hersenweefsel.