Name: Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca 2+ En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Leer duale optische mapping van transmembraanpotentiaal en sarcoplasmatisch reticulum calcium in het geïsoleerde konijnenhart. Deze methode maakt directe observatie van cardiale elektrofysiologie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de US National Institutes of Health (R01 HL 111600) en de American Heart Association (12SDG9010015).

Alle procedures waarbij dieren werden goedgekeurd door de Animal Care en gebruik Comite van de University of California, Davis, en gehandeld op grond van de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health. 1. Voorbereiding <ol><li> Bereid twee geconcentreerd (25X) voorraden van gemodificeerde oplossing Tyrode op voorhand en bewaar bij 4 ° C: (1) Stock I (in mm: NaCl 3205, CaCl2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl2 26,25) en (2) Stock II (in mm: NaHCO3 500). <ol><li> Vers bereiden 2 L Tyrodes oplossing van de volgende samenstelling (mM): NaCl 128,2, CaCl2 1,3, KCl 4,7, MgCl2 1,05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO3 20 en glucose 11,1 door het combineren van 1840 ml gedeïoniseerd (DI) water, 80 ml Stock I, 80 ml van Stock II, en 4 g glucose. Niet direct mengen Stock I en II Stock; voeg dem tot 1840 ml DI om neerslag te voorkomen. </li></ol></li><li> Bereid voorraadoplossing van de excitatie-contractie ontkoppelaar blebbistatin bij 10 mg / ml in watervrij di- methylsulfoxide (DMSO) vooraf en bewaar de stock oplossing bij 4 ° C. </li><li> Bereid voorraadoplossingen van fluorescente kleurstoffen: (1) spanningsgevoelige kleurstof RH237 (1 mg / ml in DMSO) en (2) lage-affiniteit calcium indicator Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Gebruik de voorbereidingen onmiddellijk ontleding met daaropvolgend verlies van laadvermogen vermijden. </li><li> Vul het recirculerende Langendorff perfusie systeem geoxygeneerde (95% O2, 5% CO 2) Tyrode&#39;s oplossing. Stel de stroom van O2 / CO2 om de pH van de Tyrode-oplossing bij 7,4 ± 0,05 houden. Gebruik een in-line geweven nylon net filter (poriegrootte: 11 pm) om continu te filteren het perfusaat. <ol><li> Prime de perfusie-systeem bij KT, zoals daaropvolgende loading Fluo-5N AM wordt uitgevoerd bij kamertemperatuur. Voor Fluo-5N AM laden, gebruik dan een klein volume van recirculatie perfusaat (~ 150 ml). Na kleurstof laden, gebruik dan een groter volume van perfusaat (1-2 L, zie figuur 1C). </li></ol></li><li> Zet data-acquisitie systeem en voor te bereiden voor de continue bewaking van ECG en perfusie druk. Bereid druk-monitoring systeem: Sluit een druksensor om de perfusie lijn en toezicht op de perfusie druk met een transbridge versterker. Stel de basislijn perfusiedruk tot 0 mmHg wanneer het hart niet is bevestigd aan het perfusie systeem. </li><li> Lijn de optische mapping camera&#39;s om de ruimtelijke afstemming tussen de V m en SR Ca 2 + signalen te verzekeren. <ol><li> Ten eerste, de focus van de camera door een liniaal of een object met tekst de perfusie schaal. Draai het in kaart brengen van camera&#39;s in een live view mode en de scherpstelling totdat de tekst is helder en duidelijk. Verwerven van een enkel beeld frame uit elke camera. </li><li> Bedekkingdeze beelden en stel de transparantie van de bovenste afbeelding zodat beide beelden zichtbaar zijn. De tekst in de afbeeldingen moet exact overlappen. Indien niet perfect uitgelijnd, stel de hoek van de dichroïsche spiegel of de positie van elke camera tot de twee beelden worden uitgelijnd. </li></ol></li></ol> 2. Oogsten, perfusie en Dye-laden van Rabbit Heart <ol><li> Bevestig het konijn in een goedgekeurd konijn restrainer. Diep verdoven via een intraveneuze injectie (marginale oor ader) natrium pentobarbital (50 mg / kg) en heparine (1000 IU). <ol><li> Als het konijn toont gebrek aan nociceptieve reflexen, maak een middellijn incisie in de huid van het borstbeen en ribben bloot. Dwars door het borstbeen met stompe-tip chirurgische schaar van de xyphoid naar de manubrium. Zorg het hart niet te beschadigen tijdens het openen van het borstbeen. Verspreid de ribben naar het hart bloot te leggen. </li><li> Snel accijnzen het hele hart-long block door snel snijden van alle schepen en bindweefsel. Immediately plaats de hart-long blok in oplossing ijskoude Tyrode&#39;s. </li></ol></li><li> Zoek de aorta voor retrograde perfusie. Snijd de aorta ascendens net proximaal van de drie onderdelen van de aortaboog. De aorta canule met een 8 G canule verbonden met het perfusie systeem. Gebruik een stuk van USP 0 zijden hechtdraad om de aorta te beveiligen op de canule. </li><li> Ontleden de luchtpijp, de longen, en epicardiale vet van het hart zorgvuldig. Met een scherpe pincet en dissectie schaar, zoek de mitralisklep en zorgvuldig beschadigen of een folder om de oplossing van de congestie in de linker hartkamer te voorkomen verwijderen. </li><li> Dompel het hart in de met glas ommantelde perfusie kamer horizontaal met het voorste oppervlak van het hart omhoog voor beeldvorming. Bevestig de canule een stuk Sylgard met U-vormige pinnen op het silicium bodem van de schaal om beweging van het hart in kaart brengen (figuur 1D) te voorkomen. Indien gewenst, plaatst u een klein insect pin aan de top van het hart voor stabilization. </li><li> Positie elektrocardiogram (ECG) elektroden in het bad aan de rechter- en linkerkant van het hart. Volledig onderdompelen elektroden in het bad en zorgen dat ze niet in contact met het oppervlak van een hart-volume uitgevoerd analoog aan een ECG Lead configuratie I verschaffen. Controleer of een normale Lead ik ECG morfologie. Stel de stroom (25 - 35 ml / min) waardoor de aorta druk wordt gehandhaafd op 60 - 70 mmHg. </li><li> Schakel verlichting in de kamer en voeg 0,3-0,6 ml blebbistatin voorraad oplossing (stap 1.2) naar het perfusaat (uiteindelijke concentratie 10-20 uM). <ol><li> Schakel ruimte lichten om photoinactivation van blebbistatin voorkomen. Indien nodig kan een kleine spot of koplamp worden gebruikt om de taak verlichting. Opmerking: Blebbistatin is een myosine ATPase-remmer en een excitatie-contractie ontkoppelrail. Omdat Fluo-5N laden vergt uitgebreide (60 min) RT (onderkoeling) (zie stappen 2,8-2,10), cardiale energieproductie kan worden aangetast. Therefore, toevoeging van blebbistatin in het perfusaat vóór het laden kleurstof kan de vraag naar energie 16 te verminderen en bewegingsartefacten elimineren tijdens de daaropvolgende optische opnames 17. </li></ol></li><li> Wanneer samentrekking van het hart heeft opgehouden (10 - 15 min, gecontroleerd op de aorta druk opname), over te schakelen naar het kleine volume recirculatie perfusie-systeem (zie stap 1.4.1). </li><li> Bereiden en laad Fluo-5N AM laden oplossing: Voeg 0,25 ml van Fluo-5N AM stockoplossing (stap 1.3) tot 0,25 ml warm 20% Pluronic F127. Voeg 0,5 ml warm Tyrode&#39;s oplossing aan het mengsel, meng en voeg de kleine volume recirculatie perfusie systeem. </li><li> Continu toezicht perfusie druk en ECG en pas de stroom indien nodig. Dye laden duurt ongeveer 1 uur bij RT. 45 min na het laden begonnen, zet het circulerend waterbad beginnen opwarmen het perfusie systeem perfusaat tot 37 ° C. </li><li> Na 60 min van Fluo-5N AM laden, SWItch de perfusie aan het grotere volume recirculatie perfusie-systeem (zie stap 1.4). </li><li> Verdun 50 pi spanning gevoelige kleurstof RH237 voorraadoplossing (stap 1,3) in 1 ml warm Tyrode&#39;s oplossing en voeg langzaam (gedurende ~ 5 min) in een injectiepoort proximaal aan de canule. </li></ol> 3. Optical Mapping <ol><li> Tijdens de laatste momenten van de kleurstof laden, plaatst u het hart en de focus van de optische mapping camera&#39;s om de juiste gezichtsveld te zorgen voor het experiment. </li><li> Indien gewenst, plaats een bipolaire pacing elektrode op het epicardiale oppervlak van het hart voor pacing. </li><li> Een plastic of glazen dekglas op het oppervlak van de perfusie kamer om bewegingsartefacten te verminderen op het vloeistofoppervlak die aanwezig kunnen zijn als gevolg van hercirculatie van het perfusaat. Opmerking: Als alternatief voor een dekglas, een schone plastic 50 mm petrischaal deksel. </li><li> De focus van de lichtgeleiders gelijkmatig verlichten het oppervlak van het hart met excitation licht. Gebruik blauw licht emitterende diode (LED) lichtbronnen en het licht verder te filteren met een 475-495 nm banddoorlaatfilter (Figuur 1A). </li><li> Verzamel uitgezonden fluorescentie met een macroscoop en twee complementaire metaal-oxide-halfgeleider (CMOS) optische mapping camera&#39;s. Splits het uitgezonden licht met een dichroïsche spiegel bij 545 nm. <ol><li> Lang doorlaatfilter langere golflengte deel met het signaal Vm bij 700 nm. Banddoorlaatfilter kortere golflengte eenheid met het SR Ca 2 + signaal vanuit 502 - 534 nm (figuur 1A). Stel de frequentie van optische data-acquisitie tot 0,5-1 kHz. </li></ol></li><li> Voor elke optische opname, eerste inleiding van de gewenste pacing protocol, zet de excitatie licht, en het verzamelen van 1-4 sec van de gegevens. Indien gewenst, synchroniseert het tempo protocollen en data-acquisitie. Opmerking: Het is niet mogelijk om opnieuw laden van de Fluo-5N AM, dus de signaal-ruisverhouding (SNR) wordt decrease gedurende het experiment door lekkage kleurstof uit de SR. Beperk experimentele protocol om 1-2 uur tot hoge SNR waarden te waarborgen. </li><li> Na het experiment was het perfusie systeem in de volgorde DI water, 70% reagens alcohol en opnieuw met DI water. </li><li> Filtreer elke dataset met een ruimtelijk Gaussiaanse filter (radius 3 pixels) met in de handel verkrijgbare software pakketten volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Eventueel ruimtelijk uitlijnen Vm en SR Ca 2 + datasets. Als in stap 1.6, overlay beelden van elke camera en controleer of de anatomische structuren van het hart (bijv., Coronaire vaatstelsel, randen van de atria of ventrikels) of andere items in het gezichtsveld (dwz, canule, pacing elektrode) exact overlap. Zo niet, ruimtelijke uitlijning van de datasets noodzakelijk. </li><li> Verschuiven de top transparante afbeelding in de x- en y-richting tot exacte overlap is bereikt, met vermelding van het aantal pixelshet beeld moet worden verschoven in elke richting. De gehele dataset overeenkomt met de bovenste afbeelding (ofwel V m of SR Ca 2+) moet dan worden verschoven door de bepaald aantal pixels in elke richting om nauwkeurige afstemming tussen de V m en SR Ca 2+ datasets te verzekeren. </li></ol>

<ol><li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22tissues.+Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li>
<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li>
<li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai%282%2B%29+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li>
<li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBers%2C+DM+%22Excitation-Contraction+Coupling+and+Cardiac+Contractile+Force%22">Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force</a>. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).</li>
<li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li>
<li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li>
<li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+scraps%3A+local+depletions+of+free+%5BCa2%2B%5D+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2%2B+reserve%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li>
<li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+Ca%282%2B%29+content+regulates+intracellular+Ca%282%2B%29+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts%3A+effect+of+exogenous+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li>
<li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li>
<li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+release+determines+Ca2%2B+alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+in+the+intact+heart%3A+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li>
<li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+Changes+During+Hypoxia%2C+Ischemia%2C+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li>
<li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+rhythm+%3A+the+official+journal+of+the+Heart+Rhythm+Society%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li>
<li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li>
<li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure%3A+mechanisms+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li>
<li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2%2B+ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De sleutels tot succesvolle Fluo-5N dye geladen zijn de kleine aantallen recirculatie perfusie setup, die zorgt voor een hoge Fluo-5N concentratie zonder dat grote hoeveelheden kleurstof, de lengte van de beschikbare tijd (1 uur), en het uitvoeren van het laden bij kamertemperatuur. Als het laden wordt uitgevoerd bij fysiologische temperaturen, cellulaire enzymatische activiteit snel splitst het -AM tag wanneer de kleurstof passeert de celmembraan, het vangen van de kleurstof moleculen in het cytoplasma en niet waardoor...

Duaal optisch meten van intracellulair Ca2+ en transmembraanpotentiaal (Vm) in het intacte Langendorff-geperfuseerde hart is een hoofdonderdeel geworden van onderzoeken in cardiale elektrofysiologie, inclusief mechanismen van aritmie en excitatie-contractiekoppeling1-4. Deze aanpak heeft ongekende kennis opgeleverd over normale en abnormale elektrofysiologie en, belangrijker nog, over de bidirectionele relatie tussen Vm en intracellulair Ca2+. Echter, optisch meten van intracellulair Ca2+ met hoog-affiniteit fluorescente indicatoren (zoals Rhod-2 en Fluo-4) rapporteert alleen over bulkveranderingen in intracellulair Ca2+ en is niet in staat om te onderscheiden of deze veranderingen te wijten zijn aan transmembraan Ca2+ flux, afgifte en heropname in intracellulaire opslagplaatsen, of in de meeste gevallen, een combinatie van beide. Verder hebben hoog-affiniteit Ca2+ indicatoren langzame on-off kinetics en rapporteren mogelijk niet nauwkeurig snelle veranderingen in Ca2+ concentratie5.
Elke actiepotentiaal veroorzaakt een stijging van intracellulair Ca2+, bekend als de intracellulair Ca2+ transitie (CaT). In het zoogdierhart is ongeveer 70 – 90% van de totale CaT te wijten aan afgifte van Ca2+ uit het sarcoplasmatisch reticulum (SR) via opening van ryanodine receptoren (RyRs)6. Binnen het SR is ongeveer de helft van de totale Ca2+ gebonden aan calsequestrin (CSQ) en andere intra-SR buffers7, die een belangrijke rol spelen in SR Ca2+ homeostase8,9. De hoeveelheid vrij SR Ca2+ bepaalt de drijvende kracht voor SR Ca2+ afgifte evenals het gating van RyR, en heeft daarom een significant effect op de intracellulair CaT. Verder kunnen veranderingen in SR Ca2+ afgifte of heropname, op hun beurt, Vm beïnvloeden via de elektrogene Na+-Ca2+ uitwisseling, wat aritmogene gevolgen kan hebben. Daarom, in aanvulling op de CaT, kan monitoring van vrij SR Ca2+ belangrijke inzichten bieden in contractiele en elektrofysiologische disfunctie.
In de afgelopen jaren hebben onderzoekers significante vooruitgang geboekt in het meten van SR Ca2+ in geïsoleerde cardiale myocyten en vanaf een enkele locatie op het intacte hart. Een van deze methoden vereist snelle pulsen van cafeïne om RyRs te openen en de SR Ca2+ inhoud wordt vervolgens afgeleid of berekend vanuit de onmiddellijke stijging van intracellulair Ca2+10. Een andere intrigerende aanpak gebruikt laag-affiniteit Ca2+ indicatoren, zoals Fluo-5N11 of Mag-Fluo412, die binden aan vrij SR Ca2+. Deze indicatoren hebben dissociatieconstanten (Kd) in het bereik van 10 – 400 μM en vertonen daarom minimale fluorescentie in het cytosol vergeleken met het SR lumen, waar de Ca2+ concentratie ([Ca2+]SR) in de millimolare reikwijdte is. Door gebruik van laag-affiniteit Ca2+ indicatoren zijn verschillende aspecten van SR Ca2+ cyclus onderzocht op het niveau van de geïsoleerde myocyte, inclusief fractionele SR Ca2+ afgifte en de mechanismen van Ca2+ alternans13,14. Echter, om de heterogene aard van SR Ca2+ cyclus in het intacte hart en de rol van SR Ca2+ in ruimtelijk distincte aritmische fenomenen volledig te begrijpen, zijn methoden voor beeldvorming van SR Ca2+ over het epicardiale oppervlak van het intacte hart vereist15.
Dit artikel beschrijft de methodologie voor duaal optisch meten van vrij SR Ca2+ en Vm in het intacte Langendorff-geperfuseerde konijnenhart met de laag-affiniteit Ca2+ indicator Fluo-5N. Naast het onthullen van SR Ca2+ kenmerken ruimtelijk over het epicardiale oppervlak van het hart, heeft deze aanpak het voordeel van gelijktijdige monitoring van Vm, wat onderzoek naar de bidirectionele relatie tussen Vm en SR Ca2+ mogelijk maakt.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Component van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>Voor oxygenatie en pH van Tyrode's oplossing</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Excitatie-contractie ontkoppler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Spanningsgevoelige kleurstof</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Laag-affiniteit Ca2+ indicator; Alternatief: Invitrogen F-14204; Lading moet bij kamertemperatuur worden uitgevoerd</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>Voor Ca2+ indicator lading; Opwarmen tot de oplossing helder is voor gebruik</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Voor het oplossen van blebbistatine en kleurstoffen</td></tr><tr><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &#956;m in-line filter</td></tr><tr><td>Druktransducer</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>Voor het meten van perfusiedruk</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Versterker</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>Voor het omzetten/versterken van druksignalen; PowerLab kan ook worden gebruikt met een geschikte BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>Voor continue registratie van druk- en ECG-signalen</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Macroscopische optische opstelling. Details: 0.63X objectief (NA = 0.31), 2X condenserend objectief, resulterend zichtveld = 3.1 cm x 3.1 cm, focusdiepte = ~ 1.5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optical mapping camera's</td></tr><tr><td>Precision LED Spot Light</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED lichtbron</td></tr></tbody></table>

optische kaart brengen van intra-sarcoplasmareticulum ca<sup&gt; 2+</sup&gt; en transmembrane potentieel in de langendorff-geperfuseerde rabbit heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Het beheer van sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca2+ speelt een sleutelrol in normale excitatie-contractiekoppeling en afwijkend SR Ca2+-beheer is bekend als een belangrijke rol in bepaalde soorten hartritmestoornissen. Omdat hartritmestoornissen ruimtelijk verschillende, emergente fenomenen zijn, moeten ze op weefselniveau worden onderzocht. Methoden om SR Ca2+ rechtstreeks in het intacte hart te onderzoeken, blijven echter beperkt. Dit artikel beschrijft het protocol voor dubbel optisch karteren van transmembraanpotentiaal (Vm) en vrij intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in het Langendorff-geperfuseerde konijnenhart. Deze aanpak maakt gebruik van de Ca2+-indicator met lage affiniteit Fluo-5N, die minimale fluorescentie heeft in het cytosol waar de intracellulaire [Ca2+] ([Ca2+]i) relatief laag is, maar aanzienlijke fluorescentie vertoont in het SR-lumen waar [Ca2+]SR in de millimolaire bereik ligt. Naast het onthullen van SR Ca2+-kenmerken ruimtelijk over het epicardiale oppervlak van het hart, heeft deze aanpak het duidelijke voordeel van gelijktijdige monitoring van Vm, waardoor onderzoek mogelijk is naar de bidirectionele relatie tussen Vm en SR Ca2+ en de rol van SR Ca2+ in aritmogene fenomenen.

Figuur 1A toont een schematisch diagram van de optische configuratie voor dual Vm en SR Ca 2+ mapping. Met deze opstelling is er volledige spectrale scheiding van de Vm en SR Ca 2 + signalen (Figuur 1B). Een diagram van de tweevoudige-loop perfusie systeem voor Fluo-5N loading dye is geïllustreerd in figuur 1C. Figuur 1D toont de horizontale richting van het hart in de perfusie schaal. Representatieve Vm en SR Ca <s...

Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig de vrije calciumconcentratie in het sarcoplasmatisch reticulum en de transmembraanpotentiaal optisch in kaart te brengen in het intacte, geïsoleerde en doorloopde rabbit heart. Dit wordt bereikt door eerst het konijnenhart uit te nemen en de aorta te canuleren voor retrograde perfusie met Langendorff-oplossing. De tweede stap is het uitschakelen van de contractie door een middel voor excitatie-contractie-ontkoppeling aan het perfusaat toe te voegen.Vervolgens wordt de perfusie overgeschakeld naar een recirculatiecircuit met een klein volume en wordt er bij kamertemperatuur een calciumindicator met een lage affiniteit toegevoegd. De laatste stappen bestaan uit het opwarmen van het hart naar 37 °C met behulp van het perfusiecircuit met een groot volume en het toevoegen van de voltagesensitieve kleurstof. Tijdens het experiment worden veranderingen in het calciumgehalte en het transmembraanpotentiaal dus gemeten door het hart te exciteren met blauw licht en het uitgezonden licht te meten met hogesnelheids-CMOS-camera's.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat onderzoekers hiermee dir

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een hoge temporele en ruimtelijke resolutie techniek om optisch image actie potentiaal beweging op het oppervlak van de Langendorff-geperfuseerde rattenharten met behulp van een potentiometrische kleurstof (di-8-ANEPPS).

Optisch in kaart brengen van Langendorff-geperfuseerde Rat Hearts

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van de methodologie en de resultaten van gelijktijdige endocardiale en epicardiale optische in kaart brengen van de elektrische prikkeling in de intacte linker atrium van een Langendorff-doorbloed schapen hart tijdens stretch-geïnduceerde atriumfibrilleren.

High-Resolution endocardiale en epicardiale Optical Mapping in een Schaap Model van Stretch-Induced atriale fibrillatie

Dit artikel beschrijft de basisprocedures voor het uitvoeren van optische in kaart brengen van experimenten in de Langendorff-geperfuseerde konijn hart met behulp van het panoramische imaging systeem, en de dubbele (spanning en calcium) beeldvormende modaliteit.

Multiparametrische Optische kaart brengen van de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart

Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.

Optische kaart brengen van actiepotentialen en Calcium Transiënten in de muis Hart

Hier presenteren we een protocol voor optische kaart brengen van de elektrische activiteit van de muis rechteratrium en vooral de sinusknoop, bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie.

Hoge-resolutie optische kaart brengen van de Muis sinusknoop

Dit protocol beschrijft de elektrofysiologische evaluatie van lymfkliertest atria met behulp van een optische mapping systeem met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie, met inbegrip van dubbele opnamen van de membraan spanning en Ca2 + voorbijgaande onder geprogrammeerd stimulatie door middel van een speciale elektrode-katheter.

Elektrofysiologische beoordelingvan lymfkliertest Atria met hoge resolutie optische Mapping

We presenteren de methodologie voor het isoleren van Murine myocyten en het verkrijgen van spannings-of calcium sporen tegelijk met sarcomere inkorten van sporen met fluorescentie fotometrie met gelijktijdige metingen van digitale cellen geometrie.

Optische beeldvorming van geïsoleerde Murine ventriculaire Myocyten

Het doel van deze studie was het vaststellen van een methode voor het onderzoeken van de cardiale dynamiek met behulp van een translationeel diermodel. De beschreven experimentele aanpak omvat Dual-emission optocardiografie in combinatie met een elektrofysiologisch onderzoek om elektrische activiteit te beoordelen in een geïsoleerd, intact varkens hart model.

Optocardiografie en elektrofysiologie studies van ex vivo Langendorff-perfused Hearts

Dit protocol beschrijft de procedure voor het doorsnijden en kweken van menselijke cardiale plakjes voor preklinische geneesmiddelentesten en beschrijft het gebruik van optische mapping voor het opnemen van transmembranespanning en intracellulaire calciumsignalen gelijktijdig van deze plakjes.

Preklinische Cardiale Elektrofysiologie Beoordeling door Dual Voltage en Calcium Optical Mapping van human organotypic cardiale plakjes

Dit protocol introduceert dual-dye optische mapping van muizenharten verkregen van wildtype en knock-in dieren die zijn aangetast door catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie, inclusief elektrofysiologische metingen van transmembraanspanning en intracellulaire Ca2+ transiënten met hoge temporele en ruimtelijke resolutie.

Dual-Dye optische mapping van harten van RyR2R2474S Knock-in muizen van catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie

Leer duale optische mapping van transmembraanpotentiaal en sarcoplasmatisch reticulum calcium in het geïsoleerde konijnenhart. Deze methode maakt directe observatie van cardiale elektrofysiologie mogelijk.

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca 2+ En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart (Video) | JoVE Journal

Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca

Meer video's verkennen