Optische kaart brengen van Intra-sarcoplasmareticulum Ca 2+ En Transmembrane potentieel in de Langendorff-geperfuseerde Rabbit Heart
10 september 2015
Dit artikel beschrijft de gedetailleerde protocol en de apparatuur die nodig is voor dual optische kaart brengen van transmembraan potentiaal (V m) en gratis intra-sarcoplasmatisch reticulum (SR) Ca 2+ in de Langendorff-doorbloed konijn hart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van Vm en SR Ca 2+ dynamiek in het intacte hart.
Het algemene doel van deze procedure is om gelijktijdig optisch de vrije intra sarcoplasmatisch reticulum, calcium en transmembraanpotentiaal in het intacte geïsoleerde LOR geperfuseerde konijnenhart in kaart te brengen. Dit wordt bereikt door eerst het konijnenhart uit te snijden en de aorta te canuleren voor retrograde lanor perfusie. De tweede stap is het elimineren van samentrekking door een excitatie-contractie ontkoppeling toe te voegen aan de perfu eight.
Vervolgens wordt de perfusie omgeschakeld naar een kleine volume recirculerende lus en wordt een calciumindicator met lage affiniteit toegevoegd bij kamertemperatuur. De laatste stappen zijn het verwarmen van het hart tot 37 graden Celsius met behulp van de grote volume profusie lus en het toevoegen van de spanningsgevoelige kleurstof. Dus tijdens het experiment worden veranderingen in calcium en transmembraanpotentiaal gemeten door het hart te exciteren met blauw licht en het uitgezonden licht te meten met hoge snelheid CM OS camera's.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het onderzoekers in staat stelt om direct het sarcoplasmatisch reticulum of SR voor korte calciumdynamiek te onderzoeken zonder interferentie van transmembraan calcium signalen. Deze methode kan ook helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de rol van SR calcium behandeling bij het bijdragen aan aritmieën, omdat het transmembraanpotentiaal gelijktijdig met SR calcium wordt geregistreerd. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat optische SR calcium signalen zeer lage amplitude hebben. Daarom is de juiste belasting van de calciumindicator essentieel. Voor dit protocol is het noodzakelijk om vers gemaakte tyro-oplossing bij de hand te hebben.
Vier liter is voldoende. Meng de geconcentreerde stockoplossingen niet zonder verdunning. Bereid ook de andere oplossingen van tevoren voor zoals aangegeven in het tekstprotocol. Spuit de voorraad tyros met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide en pas de gasstroom aan om de pH van de oplossing zeer dicht bij 7,4 te brengen.
De oplossing moet op kamertemperatuur zijn. Bereid het recirculerende L andorf perfusiesysteem voor door een inline nylonfilter met 11 micron poriën te plaatsen om de perfusate te filteren. Spuit nu het hoofd profusiesysteem vol met ongeveer twee liter van de geoxideerde tyros.
Het totale volume van twee liter omvat de oplossing in de reservoir. Bereid vervolgens een korte profusielijn voor die het oplossingsreservoir omzeilt om een kleine volume recirculerende profusie lus voor flu oh vijf N am te creëren. Het totale volume in het kleinere recirculatiesysteem zou ongeveer 150 milliliter moeten zijn.
Om het drukbewakingssysteem voor te bereiden, sluit een druktransducer aan op de profusielijn en sluit de uitgang van de transducer aan op een trans bridge versterker. Schakel nu het dataverzamelsysteem in. Stel het in om continu het ECG en de profusiedruk te monitoren.
Pas vervolgens de baseline perfusiedruk aan op nul millimeter kwik. Richt ten slotte de optische mapping camera uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, zet het konijn vast en anesthesieer het met pentobarbital, samen met een bolus van 1000 eenheden heparine.
Bedek de ogen om het konijn te kalmeren. Begin met een middenlijnsnede om het borstbeen en de ribben bloot te leggen met behulp van schaar met stompe punten. Snijd door het borstbeen tussen het xiphoïd en meibum.
Open vervolgens voorzichtig het borstbeen zonder het hart te beschadigen en spreid de ribben om het hart bloot te leggen. Verwijder vervolgens de volledige hart-longblokkering door alle omliggende vaten en weefsels weg te snijden. Breng de hart-longblokkering over in ongeveer 100 milliliter ijskoud tyro-oplossing.
In het uitgesneden weefselblok, lokaliseer de aorta en snijd de opgaande aorta net proximal van de drie takken van de aortaboog. Canuleer vervolgens de aorta met de acht gauge canule die is bevestigd aan het profusiesysteem. Bevestig de aorta aan de canule met een stuk USP nul zijdedraad.
Nadat de canule is bevestigd, dissecteer voorzichtig de trachea, longen en epicardiale vet weg. Identificeer vervolgens de mitralisklep en gebruik voorzichtig scherpe pincetten en schaar om een klepje te beschadigen of te verwijderen. Oplossing congestie in de linker ventrikel kan dus niet optreden.
Ga verder door het hart horizontaal in de perfusiekamer onder te dompelen met de voorste kant omhoog. Plaats de canule op een stuk sard. Bevestig de canule met U-vormige pinnen die door het stuk sard zijn gestoken en in de siliconen bodem van de perfusieschaal.
Dit zal voorkomen dat het hart beweegt. Tijdens beeldvorming kan een kleine insectenspeld worden gebruikt om de apex te stabiliseren indien nodig, meet de hoeveelheid tyro-oplossing die tijdens de canuleringen is gebruikt en vervang deze door verse oplossing om het totale circulerende oplossing op twee liter te houden. Dompel nu de ECG-elektroden volledig in het bad aan beide zijden van het hart, maar niet in contact met het hart.
Controleer vervolgens of dit een normale afleiding één ECG-morfologie oplevert. Houd ondertussen de aortadruk op 60 tot 70 millimeter kwik door de perfusiestroom tussen 25 en 35 milliliter per minuut aan te passen. Schakel nu de kamerverlichting uit en voeg 0,3 tot 0,6 milliliter BLEs statin stockoplossing toe aan de PERFU acht voor een eindconcentratie van 10 tot 20 micromolar.
Na 10 tot 15 minuten moeten de hartcontracties stoppen. Schakel vervolgens over naar het kleine volume profusiesysteem. Een van de sleutels tot succesvol SR calcium beeldvorming is de juiste belasting van de flow vijf N am kleurstof.
Dit vereist een kleine volume perfusie om een hoge kleurstofconcentratie en kamertemperatuur condities te bereiken. Om D esterificatie van de D in het cytosol te voorkomen, bereid nu 500 microliter flu O vijf N am belastingoplossing voor en meng het met 500 microliter wegoplossing. Voeg het vervolgens toe aan de PERFU acht.
Laat het downloaden 45
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor dubbele optische mapping van het transmembraanpotentiaal en vrij intra-sarcoplasmatisch reticulum calcium in het Langendorff-geperfuseerde konijnenhart. Deze methode maakt directe observatie en kwantificering van deze dynamiek in het intacte hart mogelijk.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Cardiovasculaire fysiologie
- Optische beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de cardiale dynamiek is cruciaal voor het bestuderen van de hartfunctie.
- Het transmembraanpotentiaal en de calciumspiegels zijn belangrijke indicatoren voor de gezondheid van het hart.
- Optische mapping biedt een niet-invasieve methode om deze parameters te bestuderen.
- De Langendorff-perfusietechniek maakt studies aan het geïsoleerde hart mogelijk.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor gelijktijdige optische mapping van V m en SR Ca 2+.
- Om het begrip van de cardiale elektrofysiologie te vergroten.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers in dit vakgebied.
Gebruikte methoden
- Het excideren van het konijnenhart en het canuleren van de aorta voor retrograde perfusie.
- Het gebruik van een excitatie-contractie-ontkoppelaar om contracties te elimineren.
- Het overschakelen op een recirculerende perfusielus met een calciumindicator met lage affiniteit.
- Het opwarmen van het hart en het toevoegen van een spanningsgevoelige kleurstof voor optische mapping.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle simultane meting van V m en SR Ca 2+ dynamiek.
- Aantoonde de effectiviteit van de optische mapping-techniek.
- Bood inzichten in de relatie tussen calcium en het transmembraanpotentiaal.
- Stelde een betrouwbaar protocol vast voor toekomstige studies.
Conclusies
- De dubbele optische mapping-techniek is effectief voor het bestuderen van cardiale dynamiek.
- Deze methode kan het onderzoek naar cardiale fysiologie bevorderen.
- Toekomstige toepassingen kunnen studies naar hartaandoeningen omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Deze methode maakt directe, simultane meting mogelijk van het calciumgehalte in het sarcoplasmatisch reticulum en het transmembraanpotentiaal in intact hartweefsel, wat mechanistisch inzicht biedt in excitatie-contractiekoppeling en aritmogene substraten. Door de ruimtelijke en temporele dynamiek van SR Ca2+-huishouding in een fysiologisch relevant model te ontrafelen, ondersteunt het de validatie van targets en risicoreductie bij de ontdekking van cardiovasculaire geneesmiddelen. De aanpak slaat een brug tussen moleculaire mechanismen en fenotypes op weefselniveau, waardoor het voorspellend vertrouwen bij preklinische beoordelingen van veiligheid en werkzaamheid wordt vergroot.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de SR Ca2+ vracht en de releasedynamiek te kwantificeren onder pathofysiologische stress, zoals bèta-adrenerge stimulatie.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie mogelijk van targets die betrokken zijn bij de calciumhuishouding, waardoor mechanische ambiguïteit bij de vroege targetselectie wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor met dual-readout capaciteit voor het beoordelen van compound-effecten op zowel de elektrofysiologie als de calciumhomeostase.
- Operationele waarde: Ondersteunt assay-standaardisatie door gelijktijdige monitoring van Vm en SR Ca2+, waardoor de reproduceerbaarheid bij het screenen van ionkanaal- en calciummodulatoren wordt verbeterd.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt moleculaire verstoringen aan aritmogene fenotypes op weefselniveau, wat systeemmodellering die relevant is voor de ziekte mogelijk maakt voor de afstemming van translationele biomarkers.
- Operationele waarde: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door pro-aritmische signalen in een vroeg stadium van de preklinische evaluatie te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-optimalisatie tot preklinische veiligheidsprofielering, in het bijzonder voor verbindingen die cardiac ionkanalen of calciumregulerende eiwitten beïnvloeden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door bidirectionele relaties tussen Vm en SR Ca2+ onder pacing en farmacologische uitdagingen te onthullen.
- Screening: Biedt assay-klaarheid en kwantitatieve resultaten die vergelijking van testverbindingen met controlecondities in een gestandaardiseerd formaat mogelijk maken.
- Analytics: Levert spatiotemporele metingen met een hoge resolutie van calciumtransiënten en actiepotentiaal-dynamiek, wat vergelijkende analyse tussen experimentele groepen mogelijk maakt.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt bevindingen aan preklinische continuïteit door het modelleren van aritmogene substraten die in ziektestadia worden waargenomen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor cardiale veiligheidsfarmacologie en studies naar het werkingsmechanisme over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door directe observatie van de SR Ca2+-huishouding en de electrofysiologische gevolgen daarvan.
- Operationele waarde: Standaardisatie en reproduceerbaarheid via dual-parameter optical mapping in een gecontroleerd Langendorff-geperfuseerd systeem.
- Strategische waarde: Verbeterde go/no-go-beslissingen door het detecteren van calcium-gemedieerde aritmogene triggers voordat er kostbare mislukkingen in een laat stadium optreden.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen op basis van hun effecten op de SR-calciumstabiliteit en de transmembraanstabiliteit.
Overwegingen voor de implementatie
- Expertise in optische mapping, perfusietechnieken en het hanteren van fluorescente kleurstoffen is vereist voor een succesvolle signaalacquisitie.
- De instrumentatie omvat high-speed CMOS-camera's, LED-excitatiesystemen en perfusie-opstellingen die geschikt zijn voor recirculatie en modi met grote volumes.
- Standaardisatie tussen teams is afhankelijk van consistente kleurstoflading, temperatuurbeheersing en pacing-protocollen in alle laboratoria.
- Aanpassing aan andere modelsystemen (bijv. rat, menselijk weefsel) kan optimalisatie van de indicatorconcentratie en perfusieparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de lage signaalamplitude van SR-calciumindicatoren, waardoor zorgvuldige kleurstoflading en minimalisering van cytosolische interferentie noodzakelijk zijn.
