Long Tumor cel aanwerving Assay
26 februari 2019
Dit manuscript beschrijft een methode om te kwantificeren tumor cel accumulatie in de longen in een diermodel van uitzaaiing van de tumor.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de tumor biologie veld over de moleculaire mechanismen van metastase. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de rekrutering van tumorcellen binnen een afgelegen orgaan kan worden kwantificeren. Begin met het gebruik van een niet-enzymatische cel dissociatie reagens om fluorescerende eiwit-uitdrukkende Lewis longcarcinoom, of LLC, cellen uit hun cultuur container volgens standaard protocollen te verwijderen.
Breng de resulterende celoplossing in een conische buis van 15 milliliter voor centrifugatie en was de pellets twee keer in vijf milliliter PBS per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, filter de cellen door een 40-micrometer porie cel zeef, en verdun de suspensie tot een keer 10 tot de zes cellen per milliliter concentratie. Laad vervolgens de cellen in een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 29 meter en injecteer 100 microliter cellen in de staartader van elke acht-tot-10-week-oude, C57-Black-6, mannelijke muis.
Gebruik op het juiste experimentele eindpunt een schaar om de huid van het ventrale oppervlak van elke muis te verwijderen en snijd de ribben en het middenrif om de borstholte bloot te leggen. Gebruik een 25-gauge gevleugelde infuus naald en slang te spoelen 15 milliliter PBS door de rechter ventrikel, en verwijder het hart en de thymus. De luchtpijp vastpakken met tangen, optrekken, de bindweefsels rond de luchtpijp ontleden, om de longen te oogsten.
Was vervolgens de longen in PBS, en los een kwab voor visualisatie van de fluorescerende cellen in situ onder een fluorescentie microscoop. Om het longweefsel te verteren, eerst de staartkwab met een schaar in blokjes gesneden en de longstukken in een spuit van 10 milliliter plaatsen. Sluit de spuit met de zuiger en zuig vijf milliliter spijsverteringsoplossing in de spuit, waarbij de zuiger in en uit de spuitschacht wordt verplaatst totdat het longweefsel door de hele oplossing wordt verspreid.
Doseer de longdrijfmest in een buis van 50 milliliter en verteer het weefsel op een wederkerige shaker gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en 150 rpm. Aan het einde van de incubatie trituraat het resterende weefsel totdat de longcellen volledig zijn verspreid, en de buis terug te keren naar de shaker voor een extra 30 minuten. Vervolgens filteren de cellen door een 40-micrometer porie zeef, en het verzamelen van de cellen door centrifugatie.
Om de geïsoleerde longcellen te analyseren door flow cytometrie, resuspend de pellet in twee milliliter rode bloedcel lyse buffer voor een minuut bij kamertemperatuur, en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Centrifuge de pellet vervolgens twee keer in vijf milliliter verse PBS aangevuld met 1% runderserum albumine per wasbeurt. Na de tweede centrifugatie, resuspend de pellet in een milliliter verse PBS plus BSA, en filter de cellen door een nieuwe 40-micrometer porie zeef voor kwantificering van de tumorcellen door stroom cytometrie.
De longen presenteren veel GFP-LLC cellen twee uur na injectie, met de overgrote meerderheid van de cellen verdwijnen uit de longen binnen 24 uur. Houd er rekening mee dat fluorescerende vlekken die in het rode filter worden gedetecteerd, moeten worden uitgesloten van het aantal cellen. Om het aantal GFP-LLC in de longen te bevestigen, kan een van de lobben worden gebruikt voor flow cytometrische analyse zoals aangetoond.
Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat een bevroren sectie procedure is een meer nauwkeurige methode voor het observeren van de exacte locatie van tumorcellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een methode om de accumulatie van tumorcellen in de longen te kwantificeren in een diermodel voor tumormetastase. Deze techniek maakt het mogelijk om de rekrutering van tumorcellen binnen een afgelegen orgaan te kwantificeren, wat inzicht biedt in de moleculaire mechanismen van metastasering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Celbiologie
Achtergrond
- Het begrijpen van tumormetastase is cruciaal voor kankeronderzoek.
- Het kwantificeren van de accumulatie van tumorcellen kan belangrijke biologische inzichten opleveren.
- Het gebruik van diermodellen is gebruikelijk bij het bestuderen van kankerprogressie.
- Cellen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, vergemakkelijken het volgen en kwantificeren.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het kwantificeren van de accumulatie van tumorcellen in de longen.
- Het onderzoeken van de rekrutering van tumorcellen in een metastasemodel.
- Het verbeteren van het begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan metastase.
Gebruikte methoden
- Gebruik van een niet-enzymatisch reagens voor cel-dissociatie.
- Centrifugeren en wassen van celpellets in PBS.
- Filtreren van cellen door een celzeef met een poriegrootte van 40 µm.
- Injecteren van de verdunde celsuspensie in de staartvene van muizen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een effectieve kwantificering van de accumulatie van tumorcellen mogelijk.
- De haalbaarheid van het in vivo volgen van tumorcellen is aangetoond.
- Er zijn inzichten verkregen in de dynamiek van de rekrutering van tumorcellen.
- Het heeft bijgedragen aan het begrip van metastatische processen.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol instrument voor het bestuderen van tumorbiologie.
- Het verbetert de mogelijkheid om metastase in diermodellen te onderzoeken.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om therapeutische targets te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze assay maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van de rekrutering van tumorcellen naar verafgelegen organen, wat bijdraagt aan mechanische risicoanalyse bij de ontdekking van geneesmiddelen die zich richten op metastasering. Door de stappen van primaire tumorinvasie over te slaan, ligt de focus op stromale interacties en extravasatiegebeurtenissen die cruciaal zijn voor de preklinische validatie van targets. De methode biedt een reproduceerbare, schaalbare readout voor het evalueren van anti-metastatische verbindingen in vivo.
Strategische toepassingen in BioPharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen over de bijdrage van het stroma aan metastasering in verafgelegen organen.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk door de accumulatie van tumorcellen in de longen na injectie te kwantificeren.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door de effecten van verbindingen op de dynamiek van de rekrutering van tumorcellen te meten.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten via flowcytometrie voor screeningscampagnes van verbindingen.
- Reproduceerbaarheid: Maakt gebruik van gedefinieerde celconcentraties en injectievolumes om een consistente modellering van metastase te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Compatibel met multi-well processing en high-content analyse voor het verminderen van risico's bij targets.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelevantie: Modelleert longmicrometastasen om orgaanspecifieke kolonisatiemechanismen te bestuderen.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie van anti-metastatische middelen.
- Risico-gecorrigeerde Beslissingen: Informeert go/no-go-criteria op basis van de reductie in het aantal gelabelde tumorcellen.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Posities binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwit-hypotheses tot lead-optimalisatie, waardoor een kwantitatieve evaluatie van metastase-modulerende verbindingen mogelijk wordt.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische onderzoeken naar tumor-stroma-interacties in metastatische niches.
- Screening: Levert fluorescentiegebaseerde kwantitatieve resultaten voor hit-validatie in metastase-assays.
- Analytics: Genereert telbare tumorcelgegevens via flowcytometrie voor dosis-respons- en statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij biomarkerstrategieën door de verspreiding van gelabelde cellen in vivo te volgen.
- Bedrijfsbrede hergebruik: Vestigt een herbruikbaar platform voor projectoverschrijdende studies naar metastasemechanismen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in metastasepaden door kwantificeerbare orgaanspecifieke rekrutering.
- Operationele waarde: Standardiseert de afgifte van tumorcellen en weefselverwerking voor reproduceerbare interlaboratoriumvergelijkingen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige risicoreductie van therapeutica gericht op metastasering mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van preklinische gegevens over metastaseresuppressie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in injecties via de staartvene van muizen en technieken voor weefseldissociatie.
- Afhankelijk van flowcytometrie-instrumentatie en fluorescentiecompensatiecontroles.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor celpreparatie over verschillende onderzoeksteams heen.
- Omvat optimalisatie van de celstroom om verwarrende signalen door excessieve longaccumulatie te voorkomen.
- Beperkt tot het kwantificeren van longaccumulatie; legt geen primaire tumorinvasie of latere metastatische uitgroei vast.
