Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Het algemene doel van deze procedure is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te genereren met behulp van keratinocyten die zijn afgeleid van haar. Dit wordt bereikt door eerst haren van een donor te isoleren. De tweede stap is om de haren te plaatsen om keratinocytengroei te vergemakkelijken.

Vervolgens worden de keratinocyten in vitro onderhouden en uitgebreid. De laatste stap is om de keratinocyten te herprogrammeren tot humane geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een episomale herprogrammeringsmethode. Uiteindelijk kunnen humane IPS-cellen worden geïsoleerd en gekenmerkt met behulp van immunohistochemie om de expressie van pluripotente markers te tonen.

Het algemene voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals retrovirale of lentivirale methode, is dat door gebruik te maken van episomale factor, we ongewenste transgene vermijden. Ze integreren in het genoom in de stamcellen die worden gegenereerd Begin door een flacon extracellulaire matrixoplossing op ijs te ontdooien. Overnacht. De volgende ochtend gebruikt u voorgekoelde pipettentips om 200 microliter van de oplossing toe te voegen aan 12 milliliter gekoeld DM F 12-medium.

Voeg een milliliter van de verdunde extracellulaire matrixoplossing toe aan elke put van een 12-putsplaat en incubeer de plaat een nacht bij 37 graden Celsius om de putten met matrix te coaten. Verzamel vervolgens primair menselijk haar van het hoofd van de donor door uw vingers dicht bij de wortel van het haar te plaatsen en het haar in een snelle en soepele beweging uit te plukken.

Controleer om te bevestigen dat elk verzameld haar een intacte haarfollikel bevat. Plaats de follikel onder een dissectiemicroscoop en bepaal de groeifase van elk haar. Verzamel vijf tot 10 antigeenharen van elke persoon om keratineuze ijs te extraheren.

De antigeenfase, in tegenstelling tot de T-fase, bevat meerdere lagen epitheel. Plaats de haarbreuken in een petrischaal met 10 milliliter antibioticummengsel gedurende vijf minuten en was ze vervolgens vijf minuten bij kamertemperatuur in PBS. Grijp vervolgens het haar met steriele pincetten en gebruik een paar steriele schaar om de overtollige haarschacht af te snijden, waardoor een haarfragment met een intacte haarfollikel en ongeveer 0,5 tot een centimeter haarschacht overblijft.

Breng voorzichtig een haarfragment in elke put van de met extracellulaire matrix beklede plaat. Gebruik de steriele pincetten om ongeveer 100 tot 200 microliter serumvervanger druppelsgewijs toe te voegen aan elke put met haarstalen.

Plaats vervolgens de plaat in de incubator en laat de follikels een nacht bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide hechten de volgende dag. Voeg voorzichtig nog eens 100 tot 200 microliter serumvervanger, medium druppelsgewijs toe om de haarstalen vochtig te houden. Controleer de haarstalen dagelijks om te bevestigen dat de haarfollikels succesvol aan de plaat zijn gehecht.

Eenmaal gehecht, voeg voorzichtig nog eens 500 microliter medium toe aan de put. Ververs het medium om de twee dagen. Bewerk een zeswandige plaat met collageen.

Typ een met een pre-behandeling zoals een coatingmatrixkit bij 680 microliter van het verdunningsmedium uit de kit in elke put, gevolgd door 6,8 microliter van de coatingmatrixoplossing. Schud de plaat voorzichtig om een uniforme coating te garanderen. Laat de gecoate plaat 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen voordat de keratinocyten worden geplaatst.

Verwijder de coatingoplossing, dissocieer keratinocyten in cultuur tot een enkele celsuspensie door 500 microliter 0,25% tripsine per put toe te voegen en de platen gedurende twee tot vijf minuten bij 37 graden Celsius te incuberen. Zodra de cellen loslaten van de plaat, inactiveer de trypsine met 500 microliter serumbevattend medium en verzamel de cellen in een steriele 15 milliliter buis. Verwijder het haarfragment met gesteriliseerde pincetten, pellet de cellen en resus.

Schors ze op in vers keratinocyten groeimedium plaat 40.000 keratinocyten in één put van de collageen beklede plaat in aanwezigheid van keratinocyten medium. Ververs het medium elke dag en passeer de cellen wanneer de cultuur ongeveer 80%confluënt is. Codeer een zeswandige plaat met gelatine door twee milliliter 0,1%gelatineoplossing in elke put toe te voegen, laat de gelatine gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur coaten. Ondertussen dissocieer keratinocyten die passage zes of lager zijn tot een enkele celsuspensie door één milliliter 0,25% tryin per put toe te voegen en de cellen gedurende twee tot vijf minuten te incuberen.

Bij 37 graden Celsius inactiveer de trypsine met één milliliter medium dat serum bevat en verzamel de cellen in een 15 milliliter buis. Pellet de cellen en schors ze opnieuw op in keratinocyten medium. Plateer vervolgens 100.000 tot 150.000 keratinocyten per put in een gelatiniseerde zesputsplaat en incubeer ze een nacht. De volgende dag, dag nul, controleer de plaat om ervoor te zorgen dat de cellen 50 tot 60%confluënt zijn.

Voer een transfectie uit van de episomale herprogrammeringsvectoren op de keratinocyten met behulp van een verhouding van acht microliter transfectiemiddel tot twee microgram totaal plasma-DNA zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. De volgende dag, dag één, ververs het keratinocytenmedium en controleer de transfectie-efficiëntie door de percentage groen fluorescerende eiwitpositieve cellen onder een fluorescerende microscoop te schatten. Een transfectie-efficiëntie van 60 tot 70% wordt verwacht op dag twee.

Herhaal de transfectie om de transfectie-efficiëntie te verhogen tot meer dan 90%. Codeer vervolgens een 10 centimeter schaal met vijf milliliter 0,1%gelatine gedurende ten minste 20 minuten. Plateer 4 miljoen mitotisch geïnactiveerde feedercellen per 10 centimeter schaal in FBS-medium zoals beschreven in Conrad Al all en laat de cellen overnacht in een 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxide bezinken en hechten op dag drie. Oogst de