Name: Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Leer hoe je integratie-vrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen genereert uit haar-afgeleide keratinocyten met behulp van episomale vectoren. Deze methode biedt een veilig alternatief voor virale transductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Harene Ranjithakumaran en Stacey Jackson bedanken voor technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Health and Medical Research Council (R.C.B. Wong, A. Pébay), de Universiteit van Melbourne (R.C.B. Wong), Retina Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay) en het Ophthalmic Research Institute of Australia (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay); Australian Research Council Future Fellowship (A. Pébay, FT140100047), Cranbourne Foundation Fellowship (R.C.B. Wong); intramurale financiering van de National Institutes for Health (R.C.B. Wong, S.S.C. Hung) en operationele infrastructuurondersteuning van de regering van Victoria.

De collectie van menselijk haar steekproef van individuen vereist ethische goedkeuring door het menselijk onderzoek ethische commissie in de ontvangende instellingen en moet worden gedaan in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. 1. Isolatie van keratinocyten uit geplukt Hair <ol><li> Thaw extracellulaire matrix (ECM) oplossing (dat wil zeggen, Matrigel) op ijs O / N. </li><li> Met voorgekoeld pipetpunten, voeg 200 ul ECM oplossing 12 ml koud DMEM / F12 medium. Coat een 12-wells plaat met 1 ml verdunde ECM oplossing in elk putje. Incubeer de gecoate plaat O / N bij 37 ° C. Was de beklede plaat met voorverwarmde DMEM / F12-medium vóór gebruik. </li><li> Verzamel primaire menselijke haren uit het hoofd van het individu door het plaatsen van de vingers dicht bij de wortel van het haar en het plukken van het haar in een snelle en vloeiende beweging. Controleer bevestigen dat elke verzamelde haar bevat een haarfollikel intact en bepaalt de groeifase van het haar under een dissectie microscoop (Figuur 1). <ol><li> Verzamel 5-10 anagene haren van ieder individu om keratinocyten te halen. Werkwijze geplukt haren zo spoedig mogelijk succesvolle afleiding van keratinocyten waarborgen. Opmerking: Figuur 1 illustreert de morfologie van haren in verschillende fasen van de groeicyclus. Anagene haren in de groeifase, een zichtbare buitenlaag van epitheel rond de lengte van het haar, zogenaamde ORS. Anderzijds, telogen haar vertegenwoordigt haar in de rustfase en heeft geen zichtbare ORS, maar een duidelijke klompje cellen die de wortel van het haar, zogenaamde telogene bobbel. </li></ol></li><li> Plaats de haarmonsters in een petrischaal met 10 ml van antibiotica Mix te wassen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Met behulp van gesteriliseerde schaar en pincet, afgesneden overmatige haarschacht, waardoor er een haar-fragment met een intact haarfollikel en rond 0,5-1 cm van de haarschacht. </li><li> Zorgvuldig transfer 1 haar fragment in elk putje van de ECM-gecoate plaat met behulp van een tang. </li><li> Met behulp van een pipet 1 ml, voeg ongeveer 3 druppels Knockout Serum Vervangende (KSR) medium (~ 100-200 ul) om het haar monsters. Let op: Houd het haar fragmenten in nauw contact met de plaat oppervlak mogelijk te maken voor bevestiging en de daaropvolgende keratinocyten uitgroei. Schade aan het medium toevoegen van deze stap kan het haar veroorzaakt fragmenten te drijven en vermindert de kans op succesvolle hair attachment. </li><li> Incubeer de haarmonsters in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 en laat de haarzakjes O bevestigen / N. De volgende dag, voeg voorzichtig nog 3 druppels KSR medium (~ 100-200 ul) aan de haarmonsters vochtig. </li><li> Observeer het haar monsters dagelijks te bevestigen dat de haarzakjes met succes hebben aangesloten. In het algemeen bevestiging van de haarzakjes blijkt binnen 1-3 dagen. Dikke haren zijn meestal gemakkelijker te hechten vergeleken met fijne haartjes, zoals fijne haartjes hebben een hogereneiging om te drijven die het hechtingsproces belemmeren. <ol><li> Zodra het haar aan de beklede plaat zijn bevestigd, voeg 500 pl KSR medium naar de bron. Wees extra voorzichtig bij het toevoegen van het medium als haren monsters niet goed kan zijn bevestigd. Vanaf dit punt, verandert de media om de 2 dagen. Opmerking: Keratinocyte uitwassen moet zichtbaar zijn van de ORS regio van het haar fragment na 3-7 dagen (Figuur 2A-B). Laat de keratinocyten te groeien tot 14 dagen vóór passage van de cellen zoals beschreven in de volgende paragraaf. </li></ol></li></ol> 2. Onderhoud en passage van keratinocyten <ol><li> Pre-coat een 6-wells plaat met de bekledingsmatrix Kit. Voeg 680 ul van het verdunningsmiddel uit de set aan elk putje, gevolgd door 6,8 pi matrixoplossing Coating. Schud de plaat om een ​​gelijkmatige verdeling van de coating Matrix oplossing op de plaat te garanderen. </li><li> Laat de beklede platen incuberen gedurende 30 min bij kamertemperatuur. VerwijderenCoating Matrix oplossing vóór de beplating van keratinocyten. </li><li> Dissociëren keratinocyten in een enkele celsuspensie met 500 pi 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactivatie van het trypsine met 500 pl medium dat serum (bijvoorbeeld, foetaal runderserum (FBS) gemiddeld) en verzamelen in een steriele 15 ml buizen. Verwijder het haar fragment gebruikt gesteriliseerde pincet. </li><li> Bepaal het aantal geoogste cellen met een hemocytometer. </li><li> Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 200 x g. Was de cellen met PBS en herhaal centrifugeren. Zuig het PBS en resuspendeer de cel pellet in verse Keratinocyte medium. </li><li> Plaat naar beneden 4 × 10 4 keratinocyten in een put van ECM-gecoate plaat in de aanwezigheid van Keratinocyte medium. Bewaar de keratinocyten in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 (figuur 2C). Wijzig de media elke dag en passage cellen wanneer de cultuur is ~ 80% confluent, which kan ongeveer 2-7 dagen duren, afhankelijk van de passage nummer en proliferatie snelheid van de keratinocyten. De afgeleide keratinocyten moet worden uitgebreid om voldoende bevroren voorraden te genereren met behulp van standaard slow-bevriezing cryopreservatie methodes 16. Opmerking: De beschreven kweekomstandigheden ondersteunen de uitbreiding van homogene bevolking van keratinocyten met typische geplaveide morfologie (figuur 2C). Af en toe, kan een paar gedifferentieerde keratinocyten, met grote en platte morfologie en replicatieve potentieel hebben verloren, worden waargenomen in cultuur. Karakterisering van keratinocyten kan door immunokleuring met behulp van antilichamen tegen cytokeratine 14 zoals eerder beschreven 17. Gevestigde cellijnen keratinocyt moet worden getest mycoplasma na 1-3 passages in de handel verkrijgbare kit. </li></ol> 3. Generatie van hiPSCs uit keratinocyten behulp Episomaal Vectoren <ol><li> Pre-coat a 6-well plaat met0,1% gelatine (2 ml / putje). Laat gelatine coaten ten minste 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Herprogrammering experiment gebruikt keratinocyten uiterlijk passage 6. keratinocyten dissociëren tot een enkele celsuspensie met 1 ml van 0,25% trypsine per putje gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Inactiveer trypsine met 1 ml medium met serum (bijv FBS media) en laat in een 15 ml buis. </li><li> Centrifugeer cellen gedurende 3 minuten bij 200 xg en resuspendeer cellen in Keratinocyte medium. Plaat 1 × 10 5 -1,5 × 10 5 keratinocyten per putje in een verstijfselde plaat O / N. </li><li> Op de volgende dag (dag 0), controleer dan de plaat om ervoor te zorgen cellen 50-60% confluent. Opmerking: Als keratinocyten minder dan ~ 50% confluent ze misschien niet goed groeien na transfectie. </li><li> Op dag 0, voert transfectie van episomale vectoren herprogrammering van de keratinocyten, met een verhouding van 8 ul transfectie reagens 2 ug totaal plasmide DNA.<ol><li> Neem 0,5 ug van elk van de 4 plasmiden (pCXLE-eGFP, pCXLE-hOct3 / 4-shP53F, pCXLE-hSK, pCXLE-HUL) en verdund in 100 ui verlaagde serum medium (bijv OPTI-MEM). Opmerking: Het plasmide pCXLE-eGFP wordt gebruikt om de efficiëntie van de transfectie in keratinocyten volgen en is niet vereist voor een succesvolle herprogrammering. </li><li> Voeg 8 pi transfectie reagens om de verdunde DNA. Meng door flicking de buis. Laat het DNA reactiemengsel onverstoorde rusten bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Vervang de Keratinocyte medium met vers medium. </li><li> Voeg voorzichtig de DNA reactiemengsel te keratinocytkweek en incuberen in een 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 4 uur. Opmerking: Het is niet aan te raden om een ​​langdurige transfectie O / N presteren in keratinocyten als ze vertonen lage overlevingskans na transfectie. </li><li> Na 4 uur na transfectie vervangen keratinocyt medium door vers medium. </li></ol></li><li> Op dag 1 (1 dag post-transfection), verander de keratinocyten medium en check transfectie-efficiëntie van het schatten van het percentage eGFP positieve cellen onder een fluorescentiemicroscoop. Typisch&gt; 60-70% transfectie efficiëntie waargenomen voor primaire keratinocyten met dit protocol. </li><li> Op dag 2, herhaalt transfectie zoals beschreven in stap 3.5. Twee achtereenvolgende transfecties zouden typisch de&gt; 90% transfectie efficiëntie. Keratinocytkweek bereikt meestal samenloop tegen het einde van de tweede transfectie. <ol><li> Bereid een 10 cm schotel van muis embryonale fibroblasten (MEF) feeder voor elke herprogrammering reactie. Bereid mitotisch geïnactiveerd MEF feeders zoals eerder beschreven 18. </li><li> Pre-coat een 10 cm schaal met 5 ml 0,1% gelatine gedurende tenminste 20 minuten. Plate 4 × 10 6 mitotisch geïnactiveerde MEF per 10 cm schotel in FBS medium. Laat de cellen bezinken en bevestigen O / N in een 37 ° C incubator met 5% CO 2. </li></ol></li><li> Op dag 3, harvest de keratinocyten met 0,25% trypsine, zoals beschreven in stap 3.2 en 3.3. Resuspendeer de keratinocyten in KSR medium en plaat 90% van de keratinocyten van 1 putje van een 6-wells plaat in een 10 cm MEF feeder schotel met KSR medium. </li><li> Vanaf dag 4, verandert de KSR medium elke dag. <ol><li> Ook na dag 18, vervangen kweekmedium elke tweede dag. Let op: Niet-geherprogrammeerd keratinocyten zal ophouden te vermenigvuldigen, terwijl iPSC kolonies met gedefinieerde grens die menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) lijken zal ontstaan ​​vanaf dag 14-21. </li></ol></li><li> Isoleer iPSC kolonies door handmatige dissectie van Day 21 en later. Vermijd iPSC kolonies die nauw met elkaar zijn geclusterd en alleen halen iPSC kolonies die duidelijk gescheiden zijn van anderen. Opmerking: iPSC kolonies kan eerder worden opgehaald, maar de kolonie met gedefinieerde grenzen misschien niet duidelijk in eerdere tijdstippen zijn, gezien de kleine kolonie grootte. Herprogrammering efficiëntie kan variëren tussen diffErent patiënt keratinocyten en wordt ook beïnvloed door andere factoren zoals het aantal passages of proliferatiesnelheid van keratinocyten. <ol><li> Voor handmatige dissectie van iPSC kolonies, gebruik dan een 26G naald om iPSC kolonies snijden onder een dissectie microscoop. Snijd een iPSC kolonie in kleine stukjes rond 300-600 micrometer in lengte. Breng de stukken van de ene iPSC kolonie in een nieuwe MEF feeder plaat (2,5 × 10 4 MEF / cm2) om een klonale lijn van hiPSCs vast te stellen. Aanvankelijk elkaars cultuur iPSC klonale lijn in een putje van een 12 well plaat of orgelcultuur gerechten, vervolgens uit te breiden naar 6 well plaat formaat. </li><li> Handhaaf opgericht klonale lijnen van hiPSCs in KSR medium op MEF feeders. Nadat de kweek bereikt 70-80% confluentie met iPSC kolonies ~ 1,5 mm in diameter, doorgang hiPSCs toepassing van standaard werkwijzen enzymatische passage (Accutase, Dispase of Collagenase IV) volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol></li><li> Karakteriseren opgericht iPSC lijns om pluripotentie en hun vermogen om te differentiëren in cellen representatief voor de drie kiemlagen in vitro en / of in vivo 13,19 bevestigd. Ook routinematig proef opgericht iPSC lijnen voor mycoplasma met behulp van commercieel verkrijgbare kits te zorgen dat ze zijn pathogeen vrij. Routinematig monitoren genomische stabiliteit van iPSC lijnen door karyotypering of array-gebaseerde copy number variation (CNV) analyse. </li></ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nat Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, U141-U141 (2008).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from urine.</a> J Am Soc Nephrol. 22, 1221-1228 (2011).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Peters, A., Zambidis, E. Chapter 16. Generation of nonviral integration-free induced pluripotent stem cells from plucked human hair follicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+A+%22Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%3A+Lineage-Specific+Differentiation+Protocols.Springer+Protocols+Handbooks%22">Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells: Lineage-Specific Differentiation Protocols.Springer Protocols Handbooks</a>. Ye, K., Jin, S. , Springer. 203-227 (2012).</li>
<li>Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratching+the+surface+of+skin+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scratching the surface of skin development.</a> Nature. 445, 834-842 (2007).</li>
<li>Limat, A., Noser, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+single+keratinocytes+from+the+outer+root+sheath+of+human+scalp+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles.</a> J Invest Dermatol. 87, 485-488 (1986).</li>
<li>Piao, Y., Hung, S. S., Lim, S. Y., Wong, R. C., Ko, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+keratinocytes+by+simple+transfection+of+episomal+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from keratinocytes by simple transfection of episomal vectors.</a> Stem Cells Transl Med. 3, 787-791 (2014).</li>
<li>Higgins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+hair+follicle+dermal+papilla+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human hair follicle dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells.</a> J Invest Dermatol. 132, 1725-1727 (2012).</li>
<li>Muchkaeva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Hair+Follice+Dermal+Papilla+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+naturae%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Hair Follice Dermal Papilla Cells.</a> Acta naturae. 6, 45-53 (2014).</li>
<li>Naaldijk, Y., Friedrich-Stockigt, A., Sethe, S., Stolzing, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+cooling+rates+for+fibroblast+and+keratinocyte+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen%22%5BJournal%5D)">Comparison of different cooling rates for fibroblast and keratinocyte cryopreservation.</a> J Tissue Eng Regen. , (2013).</li>
<li>Sporl, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+membrane+cholesterol+reveals+new+insights+into+epidermal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of membrane cholesterol reveals new insights into epidermal differentiation.</a> J Invest Dermatol. 130, 1268-1278 (2010).</li>
<li>Conner, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. N., et al. 23, Unit 23 22(2001).</li>
<li>Pebay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+sphingosine-1-phosphate+and+platelet-derived+growth+factor+in+the+maintenance+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Essential roles of sphingosine-1-phosphate and platelet-derived growth factor in the maintenance of human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 23, 1541-1548 (2005).</li>
<li>Myung, P., Ito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bulge+in+hair+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bulge in hair regeneration.</a> J Clin Invest. 122, 448-454 (2012).</li>
<li>Alonso, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hair+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The hair cycle.</a> J Cell Sci. 119, 391-393 (2006).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Soares, F. A., Sheldon, M., Rao, M., Mummery, C., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+coordination+of+large-scale+human+induced+pluripotent+stem+cell+initiatives%3A+Wellcome+Trust+and+ISSCR+workshops+white+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">International coordination of large-scale human induced pluripotent stem cell initiatives: Wellcome Trust and ISSCR workshops white paper.</a> Stem cell reports. 3, 931-939 (2014).</li>
<li>McKernan, R., Watt, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+point+of+large-scale+collections+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What is the point of large-scale collections of human induced pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 31, 875-877 (2013).</li>
<li>Utikal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+eliminates+a+roadblock+during+cellular+reprogramming+into+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells.</a> Nature. 460, U1145-U1112 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+rate+of+somatic+cells+affects+reprogramming+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Proliferation rate of somatic cells affects reprogramming efficiency.</a> J Biol Chem. 288, 9767-9778 (2013).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late+passage+human+fibroblasts+induced+to+pluripotency+are+capable+of+directed+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Late passage human fibroblasts induced to pluripotency are capable of directed neuronal differentiation.</a> Cell Transplant. 20, 193-203 (2011).</li>
<li>Huallachain, M., Karczewski, K. J., Weissman, S. M., Urban, A. E., Snyder, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+genetic+variation+in+somatic+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Extensive genetic variation in somatic human tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 18018-18023 (2012).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflict.

Generatie van patiënt-specifieke hiPSCs biedt een unieke benadering voor het bestuderen van de pathogenese van de zieke celtypen in vitro, en biedt ook een platform voor drug discovery om nieuwe moleculen die de ziekte fenotypes kan redden identificeren. Deze ziektemodel benaderingswijze via hiPSCs heeft veelbelovende resultaten opgeleverd voor diverse ziekten, waaronder lange QT-syndroom, ziekte van Huntington, ziekte van Parkinson en amyotrofe laterale sclerose 22. Diverse initiatieven zijn al aan ...

De ontdekking van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) heeft een revolutie op het gebied van regeneratieve geneeskunde, die een haalbare methode voor het genereren van patiënt-specifieke stamcellen 1-3. hiPSCs succes gegenereerd uit verschillende somatische celtypen, waaronder fibroblasten 4,5, 6,7 hematopoëtische cellen, epitheelcellen van nier urine 8 en keratinocyten 9,10. Tot op heden huidfibroblasten en hematopoietische cellen zijn de meest gebruikte cel voor het genereren van patiëntspecifieke iPSCs. Dit is wellicht te wijten aan het feit dat de huid biopten en bloedafname zijn routinematige medische procedures en grote biobanken van de patiënt bloed of huidmonsters hebben in veel landen vastgesteld. In tegenstelling tot bloedcellen en de huid fibroblast die invasief extractie vereisen, keratinocyten vormen een gemakkelijk toegankelijke celtype voor iPSC generatie. Keratinocytes zijn keratine-rijke epitheliale cellen die de buitenkant epidermale barrière van de huid te vormen en zijn ook gevonden in nagels en haren 11. In het bijzonder kunnen keratinocyten te vinden op de buitenste wortelschacht (BHS) van haarfollikels, een uitwendige cellaag die de haarschacht bedekt met de binnenste schede (IRS) cellen (12, figuur 1). Zoals haar collectie is een eenvoudige procedure die de hulp van medisch personeel niet vereist, het biedt een mogelijkheid voor patiënten te verzamelen en sturen hun eigen haar monsters naar laboratoria, die sterk het verzamelen van monsters van patiënten voor iPSC generatie zou vergemakkelijken. Epidermale keratinocyten hebben ook een hogere efficiëntie en snellere herprogrammering herprogrammering kinetiek vergeleken met fibroblasten, waardoor de voordelen van het gebruik keratinocyten als uitgangspunt cellen voor iPSC productie 9,13. Bovendien kan hiPSCs ook opgeroepen met andere celpopulaties in de haarfollikel,waaronder de dermale papilla cellen aan de onderkant van de haarfollikel 14,15. Vorige meldingen van iPSC generatie met behulp van haar afgeleide cellen gebruiken vaak retrovirale of-lentivirale gebaseerde herprogrammering methoden 9,14,15. Echter, deze virale methoden introduceren ongewenste genomische integratie van buitenlandse transgenen tijdens het herprogrammeren. Ter vergelijking, het gebruik van episomale vectoren vertegenwoordigt een mogelijke, niet-virale herprogrammering methode-integratie vrije iPSCs 4 te genereren. We hebben eerder ontwikkelde een eenvoudige, kosteneffectieve en non-virale methode om efficiënt herprogrammeren keratinocyten in hiPSCs middels episomale vectoren 13. Hier geven we een gedetailleerd protocol voor het genereren van uit keratinocyt verkregen hiPSCs, waaronder de afleiding van keratinocyten uit geplukt haren, uitbreiding en onderhoud van de keratinocyten en daaropvolgende herprogrammering hiPSCs genereren.

```html
<table><tbody><tr><td>Antibiotic Mix:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml Antimycotic amphotericin B</td><td>Sigma</td><td>A2942-20ml</td><td>Antibiotic mix is gemaakt in PBS.&nbsp;</td></tr><tr><td>1X Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement (KSR) medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>KSR medium wordt gefilterd met behulp van Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) voor gebruik. bFGF wordt vers toegevoegd aan het medium voor gebruik.</td></tr><tr><td>20% knockout serum replacement (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 met glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&times; MEM niet-essentiële aminozuur</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;0.5&times; Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;0.1 mM &beta;-mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;bFGF (10 ng/ml, vers toegevoegd)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyten medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;EpiLife met 60&nbsp;&micro;M Calcium</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1&times; Human keratinocyte growth supplement (HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS) medium:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>FBS medium wordt gefilterd met behulp van Stericup (Millipore, #SCGPU05RE) voor gebruik.</td></tr><tr><td>10% foetaal bovien serum (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x Penicillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Extracellulaire Matrix (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354234</td><td>Deel Matrigel stock op en bewaar in -80&deg;C volgens de instructies van de fabrikant. De stockconcentratie van Matrigel varieert lichtjes per batch (~9mg/ml). We raden aan om 200&micro;l matrigel te gebruiken voor het coaten van een 12-well plate (~150&micro;g/well).&nbsp;</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Let op dat pCXLE-eGFP alleen wordt gebruikt voor het controleren van de transfectie-efficiëntie en is niet vereist voor herprogrammering.</td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>Transfectiereagens Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine (van porcine huid)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>Maak 0,1% gelatine in gedistilleerd water. Autoclaveer voor gebruik.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reduced Serum medium: OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder</td><td></td><td></td><td>MEF kan worden ingeactiveerd door behandeling met mitomycin C of bestraling zoals eerder beschreven 16.</td></tr><tr><td>26G naald</td><td>Terumo</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate (behandeld voor weefselkweek)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate (behandeld voor weefselkweek)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm schaal (behandeld voor weefselkweek)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>Gebruik bij 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td><td>Gebruik bij 1 mg/ml</td></tr><tr><td>TRA-160 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td>Gebruik bij 5 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>Gebruik bij 5 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>NANOG antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>AF1997</td><td>Gebruik bij 10 &micro;g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert Detectiekit</td><td>Lonza</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>
```

generatie van integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van hair-afgeleide keratinocyten

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recente ontwikkelingen in herprogrammering stellen ons in staat somatische cellen om te zetten in humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Ziektemodellering met behulp van patiëntspecifieke hiPSC's maakt de studie van het onderliggende mechanisme voor pathogenese mogelijk, en biedt ook een platform voor de ontwikkeling van in vitro geneesmiddelscreening en gentherapie om behandelingsopties te verbeteren. Het veelbelovende potentieel van hiPSC's voor regeneratieve geneeskunde is ook duidelijk uit het toenemende aantal publicaties (>7000) over iPSC's in recente jaren. Verschillende celtypen uit verschillende lijnen zijn met succes gebruikt voor de generatie van hiPSC's, inclusief huidfibroblasten, hematopoiëtische cellen en epidermale keratinocyten. Terwijl huidbiopsieën en bloedafname routinematig worden uitgevoerd in veel laboratoria als bron van somatische cellen voor de generatie van hiPSC's, zijn de verzameling en daaropvolgende derivatie van haarkeratinocyten minder gebruikelijk. Haarafgeleide keratinocyten vertegenwoordigen een niet-invasieve benadering om celmonsters van patiënten te verkrijgen. Hier beschrijven we een eenvoudige niet-invasieve methode voor de derivatie van keratinocyten uit getrokken haar. We geven ook instructies voor het onderhoud van keratinocyten en de daaropvolgende herprogrammering om integratievrije hiPSC te genereren met behulp van episomale vectoren.

Het haar gaat door 3 verschillende fasen van de groeicyclus: anagen (de groeifase), catagene (de regressie fase) en telogen (de rustfase) 20,21. De anagene haarfollikels bevat meerdere lagen epitheel; Deze lagen omvatten ORS, IRS en de haarschacht (figuur 1). Anagen haar uiteindelijk ondergaat de overgang naar de catagene fase, die wordt gekenmerkt door apoptose van de ORS en beëindiging van de haarschacht differentiatie. Tenslotte catagene haar overgang naar de telogene fase, waarin apoptose...

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van keratinocyten afgeleid van haar. Dit wordt bereikt door eerst haren van een donor te isoleren. De tweede stap is het uitplaten van de haren om de uitgroei van keratinocyten te faciliteren.Vervolgens worden de keratinocyten in vitro onderhouden en uitgebreid. De laatste stap is om de keratinocyten te herprogrammeren tot menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een episomale herprogrammeringsmethode. Uiteindelijk kunnen menselijke IPS-cellen worden geïsoleerd en gekenmerkt met immunohistochemie om de expressie van pluripotente markers aan te tonen.Het algemene voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals de retrovirale of lentivirale methode, is dat we door het gebruik van een episomaal factor ongewenste integratie van het transgen in het genoom van de gegenereerde stamcellen vermijden. Begin met het ontdooien van een vial met extracellulaire matrixoplossing gedurende één nacht op ijs. Gebruik de volgende ochtend vooraf gekoelde pipetpunten om 200 µL van de oplossing toe te voegen aan 12 mL gekoeld DM F 12-medium.Voeg é

generation-integration-free-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Tonen we het protocol voor het genereren van geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke somatische cellen met behulp van lentivirus-gemedieerde levering van de menselijke factoren Oct4, Sox2, NANOG, en Lin28. Pluripotentie werd bevestigd door morfologie en de aanwezigheid van embryonale stamcellen (ES) cel-specifieke merkers.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van menselijke fibroblasten herprogrammeren met de Stemgent Human TF lentivirus Set

Het volgende protocol bevat instructies voor het aanpassen van de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen aan feeder-vrije cultuur met complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium (KSR-FF). Een keer aangepast, instructies voor de voortdurende onderhoud zijn ook aanwezig.

Feeder-vrije bewerking, Cultuur en passage van de Mens IPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde procedure voor cryopreserving menselijke iPS cellen in KnockOut SR cryopreservatie medium en het herstellen van deze cellen in complete KnockOut SR Feeder Free (KSR-FF) medium of feeder-based KnockOut SR medium.

Cryopreserving en herstellen van de Mens iPS cellen met behulp van complete KnockOut Serum Vervangende Feeder-vrij medium

Dit artikel presenteert een robuuste protocol voor isolatie en kweek van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes.

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen biedt fascinerende perspectieven voor de afleiding van autologe transplantaties. Echter, de progressie door middel van een pluripotente toestand en moeizaam re-differentiatie nog belemmert klinische vertaling. Hier beschrijven we de afleiding van volwassen humane fibroblasten en hun directe omzetting in geïnduceerde neurale progenitor cellen en de daaropvolgende differentiatie tot neuronale lijnen.

Afleiding van volwassen menselijke fibroblasten en hun directe omzetting in Expandable Neural Progenitor Cellen

Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) vormen een bron van patiënt-specifieke weefsels voor klinische toepassingen en fundamenteel onderzoek. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMNCs) die van bevroren buffy coats in viraal-vrije iPSCs met niet-integrerende episomale plasmiden herprogrammeren.

Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen van Frozen Buffy Coats behulp van niet-integrerende Episomaal plasmiden

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor efficiënte generatie van integratievrije iPSC's uit menselijke volwassen perifere bloedcellen. Met behulp van vier oriP/EBNA-gebaseerde episomale vectoren om de herprogrammeringsfactoren, KLF4, MYC, BCL-XL, of OCT4 en SOX2 tot expressie te brengen, kunnen duizenden iPSC-kolonies worden verkregen uit 1 mL perifeer bloed.

Generatie van Integratie-free geïnduceerde pluripotente stamcellen uit menselijke perifere mononucleaire bloedcellen behulp Episomaal Vectors

Robuuste afleiding van door mensen geïnduceerde pluripotente stam (hiPS) cellen werd bereikt door gebruik te maken van niet-integratie van Sendai virus (SeV) vector gemedieerde herprogrammering van dermale fibroblasten. HiPS cel onderhoud en clonale uitbreiding werd uitgevoerd met behulp van xeno-vrije en chemisch gedefinieerde kweekomstandigheden met recombinante humane laminine 521 (LN-521) matrix en essentiële E8 (E8) medium.

Integratie Gratis Derivatie van Menselijk Geïnduceerde Pluripotente Stamcellen Met Laminine 521 Matrix

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Celherprogrammering vereist de introductie van belangrijke genen, die de pluripotente celtoestand reguleren en onderhouden. Het protocol beschreven maakt de vorming van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) kolonies van menselijke dermale fibroblasten zonder virale/integrerende methoden, maar met behulp van niet-gemodificeerde Rna's (NM-Rna's) in combinatie met immuun ontduiking factoren vermindering van cellulaire afweermechanismen.

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.

Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem

Leer hoe je integratie-vrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen genereert uit haar-afgeleide keratinocyten met behulp van episomale vectoren. Deze methode biedt een veilig alternatief voor virale transductie.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Meer video's verkennen