Name: Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Leer hoe je eiwitten en celondoordringbare kleine moleculen levert in levende zoogdiercellen met behulp van het endosomolytische reagens dfTAT. Deze efficiënte co-incubatiemethode minimaliseert celbeschadiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit artikel werd ondersteund door Award Nummer R01GM087227 van het National Institute of General Medical Sciences, het Norman Ackerman Advanced Research Program en de Robert A. Welch Foundation (Grant A-1769).

1. SPPS: CK (TMR) TATG (fTAT) Synthese Opmerking: dfTAT wordt in twee stappen: synthese van het monomeer fTAT door vaste fase peptidesynthese, gevolgd door disulfidebinding dimerisatie te dfTAT vormen. <ol><li> Zwellen 500 mg rink amide MBHA hars in dimethylformamide (DMF) in een standaard 50 ml SPPS vaartuig 1 uur. </li><li> Voer Fmoc ontscherming door het incuberen van de Fmoc beschermde hars in een 20% piperidine-oplossing (20% piperidine in DMF, 10 ml (0,30 mmol). Voer deprotectiestappen tweemaal (1 x 5 min en 1 x 15 min) met een wasstap met behulp DMF (de wasstap omvat meerdere keren spoelen van de hars met een totaal volume van ongeveer 150 ml DMF en het oplosmiddel door vacuum filtratie) daartussen reacties. </li><li> Synthetiseren CK (TMR) RKKRRQRRRG (fTAT) op de ijsbaan amide MBHA hars. Gebruik de volgende Fmoc beschermde aminozuren: Fmoc-Lys (MTT) -OH (alleen N-terminus), Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc Gln (Trt) -OH en Fmoc-Cys (Trt) -OH. Het uitvoeren van de reactie met behulp van N2 (20 PSI) om de reactie te ageren. Voer alle reacties bij kamertemperatuur. <ol><li> Het uitvoeren van elk aminozuur koppeling reactie gedurende 4 uur. Voor elke koppeling met de Fmoc beschermde aminozuur (1,2 mmol), N, N, N &#39;, N&#39; -Tetramethyl- O- (1H-benzotriazol-1-yl) uroniumhexafluorfosfaat (HBTU) (0,44 g, 1,1 mmol ) en diisopropylethylamine (DIEA) (0,51 ml, 3,0 mmol) opgelost in DMF. Na de 4 uur koppeling, was de hars met DMF en voer de Fmoc ontscherming stap zoals beschreven in stap 1.2. </li><li> Herhaal dit totdat het lineaire peptide keten van fTAT (Linear peptideketen: CKRKKRRQRRRG geen TMR) werd gesynthetiseerd. </li><li> Daarna wassen hars grondig met eerste DMF en na die met dichloormethaan (DCM). Spoel de hars meerdere keren met een totaal volume van ongeveer 150 ml DMF en DCM en verwijder het oplosmiddel door vacuum filtratie. </li><li> Use MALDI-TOF te bevestigen dat de verkregen peptide de juiste molecuulgewicht. <ol><li> Wordt matrix mengsel door toevoeging van 1 mg matrix aan een oplossing bestaande uit 50 gl van 0,01% TFA in water oplossing en 50 gl acetonitril. </li><li> Lineaire peptideketen massa te bevestigen, gebruik α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur. Uitvoeren van een analytische HPLC van het ruwe peptide en het verzamelen van 50 gl van de top van de zuivere piek. </li><li> Om het monster te bereiden op plaat op de MALDI plaat: Voeg 8 pi van het peptide aan 2 pl van de matrix-oplossing en plaats op de MALDI plaat te droog of op een 37 ° C hitte plaat lucht. Opmerking: Arginine speelt een aminozuur moeilijk paar SPPS zijn. Succesvolle koppeling wordt vastgesteld door het uitvoeren van een Kaiser-test 14 (bijvoorbeeld ninhydrine test). Deze test maakt de detectie van vrije amines die losgekoppeld kunnen blijven op de hars. Indien wordt een blauwe kleur (indicatief voor de aanwezigheid van vrije aminen) gedetecteerd, koppeling sTEP&#39;s worden herhaald. </li></ol></li></ol></li><li> Voor CK (-NH-TMR) TATG (fTAT), klieven Mtt beschermende groep op de aminogroep van Lys CK (-NH-Mtt) TATG met een oplossing bestaande uit 1% trifluorazijnzuur (TFA) en 2% triisopropylsilaan (TIS) in DCM. <ol><li> Het verwijderen van MTT beschermgroep leidt tot het verschijnen van een gele kleur, incubeer de hars met 20 ml van bovenstaande oplossing 5 min Herhaal dit totdat er geen gele kleur waargenomen. Was de hars met DCM en DMF daartussen. Bovendien aangezien TIS is een scavenger dat de MTT zouden vangen zodra geen gele kleur wordt weergegeven in de oplossing in aanwezigheid van MTT. </li><li> Voeg een extra oplossing met 1% TFA in DCM (geen TIS) aan de hars niet meer MTT verzekeren is verwijderd en de oplossing helder is. </li></ol></li><li> Los de drie componenten: Carboxytetramethylrhodamine (TMR), HBTU en DIEA (4, 3,9 en 10 equivalentie ten opzichte van de hoeveelheid hars (in mg)) in DMF en voeg dit mengselde hars en het uitvoeren van de reactie O / N droge N2 roeren verschaffen. </li><li> Na Fmoc-ontscherming en aminozuur conjugatie was de hars met DCM en laten drogen. Voor volledige afsplitsing van het peptide van de hars, voeg een oplossing van 92,5% TFA, 2,5% H2O, 2,5% TIS, en 2,5% ethaandithiol (EDT) (totaal volume = 4 ml) om het peptidyl-hars 3 uur bij KT mondiale deprotectie en klieving van de hars te bereiken. <ol><li> Precipiteren van het ruwe peptide producten met koud watervrije ethylether (Et 2 O) door het laten uitlekken van de oplossing uit stap 1.6 in 40 ml Et 2 O, draaien dit neer op 4 ° C en 4000 g gedurende 20 - 25 min. Herhaal deze stap om het wassen van de neerslag met koud watervrij Et 2 O. toe </li><li> Resuspendeer de precipitaten in water (5 ml of totdat neerslag volledig is opgelost) en Lyophilize. Vervolgens resuspendeer de verkregen waterige 0,1% TFA / acetonitrile producten. </li></ol></li> &lt;li&gt; Voer een HPLC-analyse met een analytische C18-kolom (5 urn, 4 x 150 mm) aan elk peptide te analyseren. Met een stroomsnelheid van 1 ml / min en detectie bij 214 nm en 550 nm. </li><li> Voer semi-preparatieve HPLC op een C18-kolom 10 x 250 mm voor peptide zuiveren. Met een stroomsnelheid van 4 ml / min en detectie bij 214 nm en 550 nm. Voor alle runs, gebruiken lineaire gradiënten van 0,1% waterig TFA (oplosmiddel A) en 90% acetonitril, 9,9% water en 0,1% TFA (oplosmiddel B). </li><li> Bevestig de juiste identiteit van de peptiden door MALDI-TOF volgens de fabrikant protocol: fTAT, verwachte massa: 2,041.17, waargenomen massa: 2.040,66. DEAC-K9, verwachte massa: 1,412.97, waargenomen massa: 1,415.59. Gebruik een α- cyano-4-hydroxykaneelzuurmatrix voor de MALDI-TOF. </li></ol> 2. Oxidatie Reactie: dfTAT Generation <ol><li> Beluchten fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) pH 7,4 gedurende 1 uur (minimaal 5 ml voor de onderstaande reactie). </li><li> Ontbinden fTAT (0,3 mg, 1,5 x 10 -4 mmol) in Aerated PBS pH 7,4 (5 ml). Zorg ervoor dat de pH tussen 7,0 - 7,5 na toevoeging van het peptide. Indien niet natriumhydroxide toe (1 M, in kleine stappen 1 - 5 pi) om de pH terug te brengen tot 7,4. </li><li> Opmerking: zuurstof opgelost in PBS werkt om de thiolgroepen op fTAT oxideren en vormen een disulfidebinding. </li><li> Nutate de reactie O / N om te reageren totdat voltooid (100% opbrengst gebaseerd op HPLC analyse). Zuiver het product met behulp van omgekeerde fase HPLC en geanalyseerd met massaspectrometrie (MALDI-TOF) als in stap 1,9. Verwachte massa: 4,080.34, waargenomen massa: 4,084.21. </li><li> Lyophilize pure dfTAT (0,71 x10 -4 mmol) en resuspendeer in 200 ul water (concentratie pure dfTAT = 356,3 uM). </li></ol> 3. Meten dfTAT Concentratie <ol><li> Resuspendeer een hoeveelheid van de gezuiverde dfTAT (kenmerkend 1 ul, afhankelijk van de hoeveelheid peptide gezuiverd) in een 149 ui 50 mM TCEP oplossing. </li><li> Opmerking: In deze stap dfTAT verlaagd tot zijn monomer tegenhanger fTAT de absorptie quenching die optreedt elimineren vanwege de nabijheid van het TMR fluorofoor in dfTAT (de extinctiecoëfficiënt ε van TMR in dfTAT is in vergelijking met de ε van TMR verminderd fTAT gereduceerd). </li><li> Laat het monster reageren ongeveer 20 min (analytische HPLC kan worden gebruikt om de vorming van fTAT bevestiging). </li><li> Voeg de oplossing van het kwarts cuvet en meet de absorptie bij 556 nm. </li><li> Met behulp van de wet van Beer (A = εcl: ε = 91.500 M -1 cm -1) om de concentratie van fTAT berekenen, het gehalte aan dfTAT en verdeel [fTAT] twee. </li></ol> 4. Cellular Levering Experimenten <ol><li> Zaad de cellen (HeLa, HDF, enz.) In een schotel met een confluentie van 80 - 90% (bijvoorbeeld 8-well of 24-putjes). Groei cellen in een geschikt medium (bijvoorbeeld DMEM aangevuld met 10% FBS en Pen / Strep) tot 80 - 90% confluentie in een 37 ° Cbevochtigde atmosfeer met 5% CO2. </li><li> Was de cellen driemaal (3x) met PBS (door toevoeging van 200 pi PBS en vervolgens verwijderen driemaal). </li><li> Wordt 5 uM werkende concentratie dfTAT door verdunning van een voorraad dfTAT (in water) in NRL-15 media (voor 8 putjes het totale volume moet 200 pi zijn). Een concentratie van 5 uM dfTAT leidt tot efficiënte levering (hoog cytosolische levering in meer dan 90% van de cellen aanwezig in een schotel) in de meeste celtypen getest date (figuur 3). Echter, kunnen lagere of hogere concentraties meer voldoende voor celtypen met een hoge of lage neiging tot penetratie. Opmerking over Media: NRL-15 wordt gebruikt voor het verrichten van dfTAT omdat het niet cysteïne waarin de disulfidebinding in dfTAT kunnen verminderen bevatten. Echter, onze gegevens blijkt dat zowel normale L-15 (met cysteïne) en DMEM kan worden gebruikt als de aflevermedia. L-15 bevat het reducerend aminozuur cysteïne maar cysteïne presumably oxideert in de media te vormen cystine (DMEM wordt geformuleerd met cystine). dfTAT blijft dus intact in deze media en de levering werkt op dezelfde efficiency als die verkregen met nrL15. </li><li> Incubeer de cellen met dfTAT (5 uM) met of zonder lading (bijv., EGFP (10 uM)) en houdt bij 37 ° C gedurende 1 uur (incubatietijd kan worden verminderd, maar dfTAT vereist normaliter ongeveer 30 tot 45 min tot endosomale lekkage induceert ). </li><li> Was de cellen met heparine (1 mg / ml) in L-15 (3 wasbeurten wordt aanbevolen) om dfTAT verwijderen gebonden aan het plasmamembraan van cellen. </li><li> Incubeer cellen met cel-impermeabele kern vlek, bijv., Sytox blauw, Sytox Groen (2 uM in NRL-15), om te bepalen of het plasmamembraan van cellen is aangetast (dode cellen zullen worden gekleurd terwijl levende cellen niet) volgens protocol van de fabrikant. </li><li> Afbeelding cellen met behulp van een fluorescentie microscoop (100X olie onderdompeling of 20X objectief). Afbeelding dfTAT gebruik van een RFP filter (Ex =560 ± 20 nm / Em = 630 ± 35 nm). Opmerking: Succesvolle levering leidt tot een diffuse fluorescentie van dfTAT gedurende de cel (het beoordelen van de levering van eiwit of peptide van belang is afhankelijk van de toepassing). Kleuring van nucleoli door fTAT (het gereduceerde product van dfTAT bij cytosolische entry) kan worden gebruikt als een indicatie dat de gedetecteerde fluorescentie intracellulair is. fTAT zal degraderen binnen enkele uren. Op dit punt zal de fluorescentie van de afbraak fragmenten verschijnen punctata. Dit moet niet verward worden voor de gestippelde distributie die ook wordt gezien als dfTAT blijft tevergeefs opgesloten in endosomen (dit kan gebeuren als dfTAT aanwezig op een te laag van een concentratie is). </li></ol> 5. Controling Concentratie van MOI Geleverd <ol><li> Identificeer de &quot;optimale levering&quot; concentratie die nodig is om een ​​efficiënte cytosolische release van dfTAT in de gebruikte celtype te bereiken. Voer fluorescentiemicroscopie op cellen geïncubeerd met increasing concentraties dfTAT. De optimale dfTAT concentratie wordt gedefinieerd als de minimale concentratie die leidt cytosolische wissen &quot;diffuse&quot; TMR fluorescentie bij ongeveer 100% van de cellen in een kweek. </li><li> Varieert de concentratie van MOI gebruikt in co-incubatie protocol terwijl de concentratie dfTAT constant (bijvoorbeeld met behulp van optimale toediening concentratie dfTAT&#39;s). Het veranderen van de incubatietijd tot minder dan 1 uur kan ook een optie om de hoeveelheid variëren van MOI geleverd. </li></ol>

<ol><li>Didenko, V. V., Ngo, H., Baskin, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethyleneimine+as+a+transmembrane+carrier+of+fluorescently+labeled+proteins+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Polyethyleneimine as a transmembrane carrier of fluorescently labeled proteins and antibodies.</a> Anal Biochem. 344, 168-173 (2005).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+Rapid+Cytosolic+Delivery+Using+Cell-Penetrating+Peptides+Mediated+by+Pyrenebutyrate%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct and Rapid Cytosolic Delivery Using Cell-Penetrating Peptides Mediated by Pyrenebutyrate.</a> ACS Chem Biol. 1, 299-303 (2006).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotech. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+somatic+cells+via+TAT-mediated+protein+transduction+of+recombinant+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of somatic cells via TAT-mediated protein transduction of recombinant factors.</a> Biomaterials. 33, 5047-5055 (2012).</li>
<li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+of+protein+and+peptide+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%3A+Technol%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery of protein and peptide therapeutics.</a> Drug Discov Today: Technol. 5, e95-e103 (2005).</li>
<li>Chakravarty, P., Qian, W., El-Sayed, M. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+molecules+into+cells+using+carbon+nanoparticles+activated+by+femtosecond+laser+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Delivery of molecules into cells using carbon nanoparticles activated by femtosecond laser pulses.</a> Nature nanotechnol. 5, 607-611 (2010).</li>
<li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 16998-17003 (2011).</li>
<li>Pan, C., Lu, B., Chen, H., Bishop, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+using+HIV-1+TAT+recombinant+proteins+OCT4%2C+SOX2%2C+KLF4+and+c-MYC%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts using HIV-1 TAT recombinant proteins OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC.</a> Mol Biol Rep. 37, 2117-2124 (2010).</li>
<li>Fittipaldi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Membrane+Lipid+Rafts+Mediate+Caveolar+Endocytosis+of+HIV-1+Tat+Fusion+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell Membrane Lipid Rafts Mediate Caveolar Endocytosis of HIV-1 Tat Fusion Proteins.</a> J Biol Chem. 278, 34141-34149 (2003).</li>
<li>Lee, Y. J., Erazo-Oliveras, A., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+macromolecules+into+live+cells+by+simple+co-incubation+with+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Delivery of macromolecules into live cells by simple co-incubation with a peptide.</a> Chembiochem. 11, 325-330 (2010).</li>
<li>Angeles-Boza, A. M., Erazo-Oliveras, A., Lee, Y. J., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+endosomolytic+reagents+by+branching+of+cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+the+delivery+of+bioactive+compounds+to+live+cells+in+cis+or+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chem%22%5BJournal%5D)">Generation of endosomolytic reagents by branching of cell-penetrating peptides: tools for the delivery of bioactive compounds to live cells in cis or trans.</a> Bioconjugate chem. 21, 2164-2167 (2010).</li>
<li>Walev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Erazo-Oliveras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+delivery+into+live+cells+by+incubation+with+an+endosomolytic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Protein delivery into live cells by incubation with an endosomolytic agent.</a> Nat methods. 11, 861-867 (2014).</li>
<li>Kaiser, E., Colescott, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+test+for+detection+of+free+terminal+amino+groups+in+the+solid-phase+synthesis+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.</a> Anal Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Muthukrishnan, N., Johnson, G. A., Lim, J., Simanek, E. E., Pellois, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-mediated+photochemical+internalization+results+in+cell+killing+by+causing+the+release+of+calcium+into+the+cytosol+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+biophys+acta%22%5BJournal%5D)">TAT-mediated photochemical internalization results in cell killing by causing the release of calcium into the cytosol of cells.</a> Biochim biophys acta. 1820, 1734-1743 (2012).</li>
<li>Lautwein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+lymphoblastoid+cells+contain+distinct+patterns+of+cathepsin+activity+in+endocytic+compartments+and+regulate+MHC+class+II+transport+in+a+cathepsin+S-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B lymphoblastoid cells contain distinct patterns of cathepsin activity in endocytic compartments and regulate MHC class II transport in a cathepsin S-independent manner.</a> J Leukoc Biol. 75, 844-855 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De cellen die voor dfTAT afgifte moet niet al confluent zijn (&gt; 90% confluentie) omdat dit kan hebben op de levering efficiency. De cellen moeten ook gezond zijn: dode cellen in de cultuur kan apoptotische fragmenten waarmee dfTAT kan communiceren (bijvoorbeeld DNA van afgebroken kernen) vrij te geven. Hierdoor kan interfereren met de levering efficiëntie en de kwaliteit van de beeldvorming. De cellen moeten grondig worden gewassen om FBS te verwijderen voordat u dfTAT. BSA aanwezig in FBS kan binden aan dfT...

De afgifte van proteïnen, peptiden of cel-doorlaatbare kleine moleculen in levende cellen vaak gewenst in veel biologische of biotechnologische toepassingen (cellulaire beeldvorming, functionele testen, cellulaire herprogrammering, enz.) 1-4. Vele benaderingen levering reeds gemeld, waaronder micro-injectie, elektroporatie, of het gebruik van carrier middelen (bv., Celpenetrerende peptiden zoals TAT, lipiden) 5-7. Elke techniek heeft meestal specifieke voor- en nadelen die deze benaderingen voldoende voor sommige toepassingen, maar niet voor anderen kunnen maken. Veelvoorkomende problemen impliceren slechte levering efficiëntie en / of gebrek aan controle over hoeveel materiaal wordt afgeleverd 8,9, toxiciteit of nadelige fysiologische gevolgen 10,11, gebrek aan temporele controle levering weinig cellen, maar niet in een gehele populatie (bijv., micro-injectie) 12, en de complexe chemische conjugatie of formulering regelingen 11. s = &#39;jove_content &quot;&gt; Onlangs hebben we een nieuwe leveringsstrategie Deze beperkingen omzeilt ontwikkeld. Deze strategie is gebaseerd op een peptide genaamd dfTAT (dimeer fluorescerende TAT) 13. dfTAT is afgeleid van de bekende cel-penetrerende peptide (CPP) TAT. dfTAT bevat twee disulfide gebonden kopieën van TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. Ondanks hun gelijkenissen, TAT en dfTAT aanzienlijk verschillen in activiteit. TAT typisch geïnternaliseerd in cellen door endocytose. Dit CPP blijft echter meestal opgesloten in endosomen (dit meestal leiden tot een punctata verdeling van het peptide in de cellen wanneer onderzocht door fluorescentiemicroscopie). Zoals TAT ​​wordt dfTAT efficiënt endocytose door cellen. Echter, dfTAT niet blijven zitten in endosomen. In plaats daarvan bemiddelt op een wijze die zeer efficiënt endosomale lekkage. De endosomolytisch activiteit van dfTAT kan vervolgens worden benut om macromoleculen te leveren door een simpele incubatie assay. ntent &quot;&gt; De huidige begrip van het leveringsproces is als volgt. dfTAT induceert macropinocytose. Hierdoor cellen geïncubeerd met dfTAT nemen oplosbare eiwitten, peptiden of kleine moleculen (moleculen plaats, MOI) aanwezig in media door vloeistoffase endocytose (zie figuur 1). Interacties tussen dfTAT en MOI niet nodig zolang beide entiteiten verkeer tezamen in de endocytische route. Als dfTAT een bepaalde drempel binnen het lumen van endocytische organellen bereikt, zijn endosomale lekkage activiteit (de moleculaire details uitdrukt blijven volledig gekarakteriseerde te zijn). De inhoud van het lumen van lekkende organellen, en dus de MOI, wordt dan losgelaten in de cellen. Deze benadering is daarom erg handig omdat geen conjugatie of formulering stelsels met MOI vereist. Omdat bovendien dfTAT is niet direct modificeren van een MOI moet ook niet storen MOI functie eenmaal intracellulaire afgifte wordt bereikt. Ook de concentratie vandfTAT gebruikt levering is onafhankelijk van die van de MOI in de media. Zo kan dfTAT concentratie constant tussen verschillende experimenten worden gehouden reproduceerbare efficiëntie in endosomale lekkage te garanderen. Daarentegen kunnen concentratie MOI in media geleidelijk worden veranderd om gewenste niveau bereiken van MOI geleverd cytosol. De hoge endosomale lekkage efficiency bereikt met dfTAT opmerkelijk onschadelijk zijn voor veel van de tot op heden geteste cellen. Dit is verrassend omdat endosomale organellen belangrijke component van de cellen en men zou verwachten dat de dramatische lekkage veroorzaakt door dfTAT gepaard zou gaan met schadelijke cellulaire responsen. Toch behandelde cellen woekeren in hetzelfde tempo als onbehandelde cellen en geen significante veranderingen in hun transcriptoomanalyse niet weergegeven. Bovendien kan de levering worden herhaald binnen enkele minuten met reproduceerbare levering efficiëntie, wat aangeeft dat de cellen kan ofwel tolereren of herstellen van het leveringsproces zonder verlieshun capaciteit voor endocytose of endosomale lekkage. Subtiele cellulaire reacties kunnen plaatsvinden tijdens dfTAT levering en de moleculaire details van wat deze reacties zou kunnen nog worden onderzocht. Maar door het combineren hoge efficiëntie, gemak protocollen, en gebrek aan toxiciteit, dient deze levering benadering blijken onmiddellijk bruikbaar in vele cel-gebaseerde applicaties. De hierin gepresenteerde protocollen zijn gericht op het maken van deze technologie toegankelijk voor de onderzoeksgemeenschap.

<table><tbody><tr><td>Heparine&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) cysteïne</td><td>Hyclone</td><td></td><td>Speciale bestelling</td></tr><tr><td>Fmoc-beschermde aminozuren</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>Steekproeven worden verstrekt op verzoek (contact: pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>Bioveiligheidskast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde epifluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>model IXB1</td><td>uitgerust met een verwarmingsplatform op 37 &deg;C en met een Rolera-MGI Plus back-verlichte elektronen vermenigvuldigende ladingsgekoppelde apparaat (EMCCD) camera (Qimaging).&nbsp;</td></tr><tr><td>37 &deg;C bevochtigde, 5% CO2 incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptidesynthetaser of vat om handmatige peptide synthese uit te voeren</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

levering van eiwitten, peptiden of cell-ondoordringbare kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dftat

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromoleculaire levering strategieën gebruiken meestal de endocytische route als een route van cellulaire binnenkomst. Echter, endosomale entrapment ernstig beperkt de efficiëntie waarmee macromoleculen dringen de cytosolische ruimte van de cellen. Onlangs hebben we dit probleem omzeild door het identificeren van het reagens dfTAT een disulfidebinding dimeer van het peptide TAT gemerkt met de fluorofoor tetramethylrhodamine. We hebben een fluorescent gemerkt dimeer van de prototypische celpenetrerende peptide (CPP) TAT, dfTAT die levende cellen doordringt en de cytosolische ruimte van cellen met een bijzonder hoog rendement bereikt gegenereerd. Cytosolische levering van dfTAT wordt bereikt in meerdere cellijnen, met inbegrip van primaire cellen. Bovendien is de levering niet merkbaar beïnvloeden levensvatbaarheid van de cellen, proliferatie of genexpressie. dfTAT kan leveren kleine moleculen, peptiden, antilichamen, biologisch actieve enzymen en een transcriptiefactor. In dit rapport beschrijven we de betrokken DFTA protocollenT synthese en cellulaire levering. Het manuscript beschrijft hoe de hoeveelheid eiwit afgegeven aan de cytosolische ruimte van de cellen te regelen door het variëren van de hoeveelheid eiwit extracellulair toegediend. Tenslotte, de karakteristieken van deze nieuwe technologie en stappen die betrokken zijn bij het valideren aflevering besproken. De beschreven protocols zou zeer nuttig zijn voor cel-gebaseerde testen en voor de ex vivo manipulatie en herprogrammering van cellen.

Het verschil tussen fTAT en dfTAT beoordelen worden HeLa-cellen gedurende 1 uur bij elk peptide op het verschil in hun cellulaire lokalisatie te bepalen. De internalisatie van de twee CPP werd bepaald met fluorescentiemicroscopie. Figuur 2 laat zien dat fTAT (20 uM) lokaliseert in een gestippelde distributie. Deze verdeling is in overeenstemming met het peptide blijft ingevangen binnen endosomen. In tegenstelling, het fluorescentiesignaal van dfTAT (5 uM) wordt een homogene verdeling in het cytosol en d...

We beschrijven hoe eiwitten en cel-ondoorlatende kleine moleculen in gekweekte zoogdiercellen kunnen worden afgeleverd door middel van een eenvoudig co-incubatieprotocol met een reagens dat ervoor zorgt dat endocytische organellen lekkend worden.

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om macromoleculen in levende cellen af te leveren met behulp van dimeer, fluorescerend tat of df tat, een reagens dat zeer efficiënt in cellen kan penetreren zonder deze te beschadigen. Dit wordt bereikt door in eerste instantie het afleveringsmiddel te genereren en te zuiveren. Dfta als tweede stap.Dfta wordt gedurende één uur bij 37 °C met cellen geïncubeerd in aanwezigheid van het macromoleculaire vrachtmateriaal van belang; df tat induceert de opname van het vrachtmateriaal in endocytische blaasjes. De blaasjes rijpen uit tot vroege endosomen en bereiken uiteindelijk het stadium van het late endosoom, waar DF tat in staat is om het vrachtmateriaal vrij te geven in de cytosolische ruimte van de cellen. Vervolgens worden de cellen afgebeeld met fluorescentiemicroscopie om de afleveringsefficiëntie van detta en het vrachtmateriaal van belang te beoordelen.De resultaten tonen aan dat DF TT met een hoge efficiëntie cellen kan binnendringen zonder waarneembare cytotoxiciteit; DF tat kan macromoleculen van verschillende groottes in de cytosolische ruimte van cellen afleveren, zoals waargenomen kan worden via fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande vaste afleveringsmethoden is dat ons afleveringsmiddel een hoge afleveringsefficiëntie heeft zonder waarneembaar negatief effect op de cellulaire fysiologie. Bovendien is het eenvoudig in gebruik, aangezien er slechts een simpele co-incubatiestap vereist is.Om te beginnen met de FTA-synthese, laat 500 milligram R-amide, MBHA-hars en dimethylformamide of DMF gedurende één uur zwellen in een standaard SPPS-vat van 50 milliliter; voer de reactie uit bij kamertemperatuur met net genoeg stikstofgas om de reactie te laten bruisen. Synthetiseer FTA op de rink-amide MBHA-hars met gebruik van 1,2 millimol van elk in het tekstprotocol vermelde FM-beschermde aminozuur voor elke aminozuurkoppelsreactie. Voeg daarnaast 0,44 gram HBTU en 0,51 milliliter DIEA opgelost in DMF toe; voer elke aminozuurkoppelsreactie gedurende vier uur uit, gevolgd door de koppeling van vier uur.Was de hars met DMF en voer de FD-beschermingsstap uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Herhaal dit totdat de lineaire peptideketen van FTA is gesynthetiseerd. Splits vervolgens de MTT-beschermgroep door de hars vijf minuten te incuberen met 20 milliliters van een oplossing bestaande uit 1% trifluorazijnzuur of TFA en 2% triisopropylsilaan of TIS in DCM.Aangezien de verwijdering van de MTT-beschermende groep zou leiden tot de verschijning van een gele kleur, dient dit te worden herhaald totdat er geen gele kleuren meer worden waargenomen, waarbij de hars tussentijds wordt gewassen met DCM en DMF. Voeg een extra oplossing van 1% TFA in DCM toe aan de hars om te bevestigen dat er geen MTT meer wordt verwijderd en de oplossing helder blijft.Los vervolgens T-M-R-H-B-T-U en DIEA op in DMF en voeg dit mengsel toe aan de hars. Laat de reactie overnacht verlopen onder droge stikstof met constante agitatie na de fm d-protectie en aminozuurconjugatie. Was de hars met DCM en laat deze drogen voor de volledige splitsing van het peptide van de hars.Voeg een oplossing bestaande uit 92,5% TFA, 2,5% water, 2,5% TIS en 2,5% ethaandithiol toe aan de peptidylhars gedurende drie uur bij kamertemperatuur om globale onbescherming en splitsing van de hars te bewerkstelligen. Precipiteer de ruwe peptideproducten met koud watervrij ethyléther door de bereide oplossing af te gieten in 40 milliliter ethyléther. Centrifugeer dit bij vier graden Celsius en 4.000 G gedurende 20 tot 25 minuten.Herhaal deze stap om het neerslag te wassen met koud watervrij ethyléther. Suspendeer de neerslagen in water en lyophiliseer deze, resuspendeer vervolgens de verkregen producten in 0,1% waterig TFA ACEDONITE. Voer een analyse uit met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een analytische C 18-kolom.Om elk peptide te analyseren, wordt een stroomsnelheid van 1 mL per minuut gebruikt met detectie bij 214 nm en 550 nm. Voer vervolgens semi-preparatieve HPLC uit op een C 18-kolom voor de zuivering van de peptiden. Gebruik voor alle runs een stroomsnelheid van 4 mL per minuut en detectie bij 214 nm en 550 nm.Gebruik lineaire gradiënten voordat de oxidatiereactie wordt uitgevoerd. Bevestig de juiste identiteit van de peptiden via MALDI volgens het protocol van de fabrikant. Los FTA op in beluchte gefosfateerde zoutoplossing.Zorg ervoor dat de pH tussen 7,0 en 7,5 ligt. Laat de reactie na toevoeging van het peptide een nacht doorgaan zodat deze volledig kan reageren. Zuiver het product met reverse phase HPLC en analyseer dit via massaspectrometrie zoals voorheen; lyofiliseer vervolgens de zuivere DF tat en resuspendeer in 200 µL water om de concentratie te meten.Suspendeer eerst een aliquot van het gezuiverde DF tat in 149 µL van een 50 mM TCEP-oplossing en laat het monster ongeveer 20 minuten reageren. In deze stap wordt DF tat gereduceerd tot de monomeer-tegenhanger F tat om de absorptie-quenching te elimineren die optreedt door de nauwe nabijheid van TMR fluor four en DF tat. Voeg alle oplossingen toe aan een kwartscuvet en meet de absorptie bij 556 nm.Bepaal de concentratie van de oplossing met behulp van de wet van Beer. Dit komt overeen met de concentratie van fta.Deel de concentratie van FTA door twee om de concentratie van dfta te verkrijgen. Kweek de cellen in een geschikt medium tot een confluentie van 80 tot 90% in een bevochtigde atmosfeer van 37 °C met 5% CO2, was de cellen drie keer met 200 µL PBS en één keer met NRL 15. Incubeer de cellen met vijf µM df tat met of zonder vracht, zoals enhanced green fluorescent protein, en houd deze gedurende één uur op 37 °C om na incubatie endosomale lekkage te induceren.Was de cellen drie keer met heparine in L 15-medium om DF tat te verwijderen dat gebonden is aan het plasmamembraan van de cellen. Als laatste stap worden de cellen afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop; beeld DF tat af met een rood fluorescent eiwit- of RFP-filter om het verschil tussen F TAT en D ftt te beoordelen. Hele cellen worden geïncubeerd met elk peptide om het verschil in hun cellulaire lokalisatie te bepalen.Zoals hier getoond, lokaliseert FTA in een punctate distributie. Deze distributie is consistent met het peptide dat gevangen blijft in endosomen. In tegenstelling hiermee vertoont het fluorescentiesignaal van dfta een homogene distributie door het cytosol en de nucleus.De cytosolische distributie van DF tat wordt waargenomen in verschillende cellijnen. De 20x beelden tonen aan dat een zeer hoog percentage in een schaal een cytosolische distributie van DF tat vertoont zonder cellulaire toxiciteit, zoals blijkt uit de afwezigheid van cyt blue kernkleuring, om te bepalen of dfta-gemedieerde endosomale lekkage grote eiwitten in het cytosol van cellen aflevert. EGFP werd gebruikt om de aflevering van correct gevouwen eiwit te detecteren.EGFP vertoonde een cytosolische en nucleaire groene fluorescentie-distributie, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen voor DF tat in meer dan 90% van de cellen zonder waarneembare toxiciteit. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de cellen niet overmatig confluent mogen zijn. Daarnaast moeten de cellen grondig worden gewassen om FPS te verwijderen voordat df tap wordt toegevoegd.

delivery-proteins-peptides-or-cell-impermeable-small-molecules-into

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Eiwit transductie maakt de directe levering van biologisch actieve eiwitten in cellen. In tegenstelling tot conventionele methoden, zoals DNA-transfectie of virale transductie deze niet-invasieve paradigma maakt zeer efficiënte cellulaire manipulatie in een titreerbare manier te omzeilen cellulaire toxiciteit en het risico van oncogene transformatie door permanente genetische modificatie.

Technische Cel-permeabel Protein

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

In this video, we demonstrate the introduction of bacterial effector proteins into mammalian cells by electroporation. The intracellular localization of the bacterial effector proteins is detected by confocal microscopy following staining with specific fluorophore-conjugated antibodies.

Introduction of Bacterial Effector Proteins into Mammalian Cells by Electroporation

Rapid mechanische vervorming van de cellen heeft ontpopt als een veelbelovende,-vector vrije methode voor intracellulaire levering van macromoleculen en nanomaterialen. Dit protocol biedt gedetailleerde stappen over hoe het systeem te gebruiken voor een breed scala aan toepassingen.

Cel Knijpen als een robuuste, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Zinkvinger domeinen zijn intrinsiek cel permeabel en geschikt mediëren eiwit plaatsing in een breed scala aan zoogdier celtypen. Hier wordt een uitvoerige stap-voor-stap-protocol voor de uitvoering van zink-vinger-technologie voor intracellulaire eiwit levering gepresenteerd.

Direct Eiwit Levering aan zoogdiercellen behulp van Cell-permeabel Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Zijn<sub&gt; 2</sub&gt; Zinkvinger Domeinen

Dit is een protocol bij het bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie gebaseerd op het systeem van de Biotine-avidin-pull-down met de nieuwigheid van het combineren van cel-penetrating sequenties. Het belangrijkste voordeel is dat de volgorde van de doelgroep is geïncubeerd met levende cellen in plaats van de cel lysates en daarom de interacties in het cellulaire kader zal optreden.

Biotinyleerd cel-penetrating Peptides te bestuderen van intracellulaire eiwit-eiwitinteractie

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Cognate J-Domain eiwitten werken samen met de Hsp70 chaperonne om te helpen bij een groot aantal biologische processen, variërend van eiwit vouwen tot afbraak. Hier beschrijven we een in-situ proximity ligatie test, die het mogelijk maakt om deze transitieve gevormde chaperonne machinerie in bacteriële, gist en menselijke cellen te monitoren.

In situ monitoring van transitieve gevormde moleculaire Chaperone-assemblages in bacteriën, gist en menselijke cellen

Op het snijvlak van organische en waterige oplosmiddelen assembleren op maat gemaakte amfifiele elastine-achtige eiwitten zich in complexe supramoleculaire structuren zoals blaasjes, vezels en coacervaten die worden geactiveerd door omgevingsparameters. De beschreven assemblageprotocollen leveren Op eiwitmembraan gebaseerde compartimenten (PMBC's) met tunable eigenschappen, waardoor de inkapseling van verschillende lading.

Geleid Assemblage van Elastin-achtige eiwitten in gedefinieerde supramoleculaire structuren en cargo-encapsulation in vitro

De fluorescentielekkagetest is een eenvoudige methode die het onderzoek van peptide / membraaninteracties mogelijk maakt om hun betrokkenheid bij verschillende biologische processen te begrijpen en vooral het vermogen van cel-penetrerende peptiden om fosfolipiden bilayers te verstoren tijdens een direct cellulair translocatieproces.

Fluorescerende lekkagetest om membraan destabilisatie door cel-penetrerend peptide te onderzoeken

Kraalbelasting introduceert eiwitten, plasmiden en deeltjes in aanhankelijke zoogdiercellen. Deze celbelastingstechniek is goedkoop, snel en heeft geen substantiële invloed op de gezondheid van cellen. Het is het meest geschikt voor live-cell imaging.

Kraal loading eiwitten en nucleïnezuren in aanhankelijke menselijke cellen

Leer hoe je eiwitten en celondoordringbare kleine moleculen levert in levende zoogdiercellen met behulp van het endosomolytische reagens dfTAT. Deze efficiënte co-incubatiemethode minimaliseert celbeschadiging.

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT (Video) | JoVE Journal

Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Meer video's verkennen