Levering van eiwitten, peptiden of Cell-ondoordringbare Kleine moleculen in levende cellen door incubatie met de endosomolytisch reagens dfTAT

Het algemene doel van het volgende experiment is om macromoleculen in levende cellen af te leveren met behulp van dimeer, fluorescerend tat of df tat, een reagens dat zeer efficiënt in cellen kan penetreren zonder deze te beschadigen. Dit wordt bereikt door in eerste instantie het afleveringsmiddel te genereren en te zuiveren. Dfta als tweede stap.

Dfta wordt gedurende één uur bij 37 °C met cellen geïncubeerd in aanwezigheid van het macromoleculaire vrachtmateriaal van belang; df tat induceert de opname van het vrachtmateriaal in endocytische blaasjes. De blaasjes rijpen uit tot vroege endosomen en bereiken uiteindelijk het stadium van het late endosoom, waar DF tat in staat is om het vrachtmateriaal vrij te geven in de cytosolische ruimte van de cellen. Vervolgens worden de cellen afgebeeld met fluorescentiemicroscopie om de afleveringsefficiëntie van detta en het vrachtmateriaal van belang te beoordelen.

De resultaten tonen aan dat DF TT met een hoge efficiëntie cellen kan binnendringen zonder waarneembare cytotoxiciteit; DF tat kan macromoleculen van verschillende groottes in de cytosolische ruimte van cellen afleveren, zoals waargenomen kan worden via fluorescentiemicroscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande vaste afleveringsmethoden is dat ons afleveringsmiddel een hoge afleveringsefficiëntie heeft zonder waarneembaar negatief effect op de cellulaire fysiologie. Bovendien is het eenvoudig in gebruik, aangezien er slechts een simpele co-incubatiestap vereist is.

Om te beginnen met de FTA-synthese, laat 500 milligram R-amide, MBHA-hars en dimethylformamide of DMF gedurende één uur zwellen in een standaard SPPS-vat van 50 milliliter; voer de reactie uit bij kamertemperatuur met net genoeg stikstofgas om de reactie te laten bruisen. Synthetiseer FTA op de rink-amide MBHA-hars met gebruik van 1,2 millimol van elk in het tekstprotocol vermelde FM-beschermde aminozuur voor elke aminozuurkoppelsreactie. Voeg daarnaast 0,44 gram HBTU en 0,51 milliliter DIEA opgelost in DMF toe; voer elke aminozuurkoppelsreactie gedurende vier uur uit, gevolgd door de koppeling van vier uur.

Was de hars met DMF en voer de FD-beschermingsstap uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Herhaal dit totdat de lineaire peptideketen van FTA is gesynthetiseerd. Splits vervolgens de MTT-beschermgroep door de hars vijf minuten te incuberen met 20 milliliters van een oplossing bestaande uit 1% trifluorazijnzuur of TFA en 2% triisopropylsilaan of TIS in DCM.

Aangezien de verwijdering van de MTT-beschermende groep zou leiden tot de verschijning van een gele kleur, dient dit te worden herhaald totdat er geen gele kleuren meer worden waargenomen, waarbij de hars tussentijds wordt gewassen met DCM en DMF. Voeg een extra oplossing van 1% TFA in DCM toe aan de hars om te bevestigen dat er geen MTT meer wordt verwijderd en de oplossing helder blijft.

Los vervolgens T-M-R-H-B-T-U en DIEA op in DMF en voeg dit mengsel toe aan de hars. Laat de reactie overnacht verlopen onder droge stikstof met constante agitatie na de fm d-protectie en aminozuurconjugatie. Was de hars met DCM en laat deze drogen voor de volledige splitsing van het peptide van de hars.

Voeg een oplossing bestaande uit 92,5% TFA, 2,5% water, 2,5% TIS en 2,5% ethaandithiol toe aan de peptidylhars gedurende drie uur bij kamertemperatuur om globale onbescherming en splitsing van de hars te bewerkstelligen. Precipiteer de ruwe peptideproducten met koud watervrij ethyléther door de bereide oplossing af te gieten in 40 milliliter ethyléther. Centrifugeer dit bij vier graden Celsius en 4.000 G gedurende 20 tot 25 minuten.

Herhaal deze stap om het neerslag te wassen met koud watervrij ethyléther. Suspendeer de neerslagen in water en lyophiliseer deze, resuspendeer vervolgens de verkregen producten in 0,1% waterig TFA ACEDONITE. Voer een analyse uit met hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) met een analytische C 18-kolom.

Om elk peptide te analyseren, wordt een stroomsnelheid van 1 mL per minuut gebruikt met detectie bij 214 nm en 550 nm. Voer vervolgens semi-preparatieve HPLC uit op een C 18-kolom voor de zuivering van de peptiden. Gebruik voor alle runs een stroomsnelheid van 4 mL per minuut en detectie bij 214 nm en 550 nm.

Gebruik lineaire gradiënten voordat de oxidatiereactie wordt uitgevoerd. Bevestig de juiste identiteit van de peptiden via MALDI volgens het protocol van de fabrikant. Los FTA op in beluchte gefosfateerde zoutoplossing.

Zorg ervoor dat de pH tussen 7,0 en 7,5 ligt. Laat de reactie na toevoeging van het peptide een nacht doorgaan zodat deze volledig kan reageren. Zuiver het product met reverse phase HPLC en analyseer dit via massaspectrometrie zoals voorheen; lyofiliseer vervolgens de zuivere DF tat en resuspendeer in 200 µL water om de concentratie te meten.

Suspendeer eerst een aliquot van het gezuiverde DF tat in 149 µL van een 50 mM TCEP-oplossing en laat het monster ongeveer 20 minuten reageren. In deze stap wordt DF tat gereduceerd tot de monomeer-tegenhanger F tat om de absorptie-quenching te elimineren die optreedt door de nauwe nabijheid van TMR fluor four en DF tat. Voeg alle oplossingen toe aan een kwartscuvet en meet de absorptie bij 556 nm.

Bepaal de concentratie van de oplossing met behulp van de wet van Beer. Dit komt overeen met de concentratie van fta.

Deel de concentratie van FTA door twee om de concentratie van dfta te verkrijgen. Kweek de cellen in een geschikt medium tot een confluentie van 80 tot 90% in een bevochtigde atmosfeer van 37 °C met 5% CO2, was de cellen drie keer met 200 µL PBS en één keer met NRL 15. Incubeer de cellen met vijf µM df tat met of zonder vracht, zoals enhanced green fluorescent protein, en houd deze gedurende één uur op 37 °C om na incubatie endosomale lekkage te induceren.

Was de cellen drie keer met heparine in L 15-medium om DF tat te verwijderen dat gebonden is aan het plasmamembraan van de cellen. Als laatste stap worden de cellen afgebeeld met een fluorescentiemicroscoop; beeld DF tat af met een rood fluorescent eiwit- of RFP-filter om het verschil tussen F TAT en D ftt te beoordelen. Hele cellen worden geïncubeerd met elk peptide om het verschil in hun cellulaire lokalisatie te bepalen.

Zoals hier getoond, lokaliseert FTA in een punctate distributie. Deze distributie is consistent met het peptide dat gevangen blijft in endosomen. In tegenstelling hiermee vertoont het fluorescentiesignaal van dfta een homogene distributie door het cytosol en de nucleus.

De cytosolische distributie van DF tat wordt waargenomen in verschillende cellijnen. De 20x beelden tonen aan dat een zeer hoog percentage in een schaal een cytosolische distributie van DF tat vertoont zonder cellulaire toxiciteit, zoals blijkt uit de afwezigheid van cyt blue kernkleuring, om te bepalen of dfta-gemedieerde endosomale lekkage grote eiwitten in het cytosol van cellen aflevert. EGFP werd gebruikt om de aflevering van correct gevouwen eiwit te detecteren.

EGFP vertoonde een cytosolische en nucleaire groene fluorescentie-distributie, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen voor DF tat in meer dan 90% van de cellen zonder waarneembare toxiciteit. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eraan te denken dat de cellen niet overmatig confluent mogen zijn. Daarnaast moeten de cellen grondig worden gewassen om FPS te verwijderen voordat df tap wordt toegevoegd.