Name: Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Leer hoe u prostaatkanker PDX-modellen genereert uit circulerende tumorcellen met behulp van flowcytometrie en injectie in immuungecompromitteerde muizen. Deze methode biedt waardevolle experimentele modellen voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Jordi Ochando van de Flow Cytometry Shared Resources bij het Mount Sinai Medical Center voor hun hulp bij de flowcytometrie-analyse. We danken Dr. Rumana Huq van de Microscopy Shared Resource Facility bij het Mount Sinai Medical Center voor hun beeldvormingsassistentie. De auteurs danken de TJ Martell Foundation voor de steun bij dit project.

Dit protocol is uitgevoerd op onze instelling met de goedkeuring van het institutioneel onderzoek ethische raad van bestuur en is in overeenstemming met alle institutionele, nationale en internationale richtlijnen voor het menselijk welzijn. 1. Verzameling van perifere bloed van patiënten met gevorderde prostaatkanker Opmerking: Selecteer patiënten met gemetastaseerde prostaatkanker. Verkrijgen schriftelijke toestemming van de patiënt en het opnemen klinische kenmerken van de patiënten, met inbegrip van leeftijd bij de isolatie en eerdere chemotherapie en hormonale behandelingen. Patiënten met gemetastaseerde ziekte zal kunnen hebben de hoogste concentratie van CTC&#39;s in het perifere bloed. <ol><li> Verzamelen van bloedmonsters na geïnformeerde toestemming en onder een geschikte Institutional Review Board goedgekeurd protocol. Draag latex handschoenen en een labjas gedurende de gehele procedure. </li><li> Sluit 25 G vlinder naald en leidingen aan naaldhouder. Gebruik een alcoholdoekje om de oppervlakte van schoonantecubitale ader tussen de biceps en onderarm, dan van toepassing tourniquet op de bovenarm van de patiënt. </li><li> Steek vlinder naald in antecubitale ader en duw bloedafname buis in naaldhouder aan collectie te starten. Verzamel ongeveer 10 ml bloed in verzameling buizen die ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) om stolling te voorkomen bevatten. </li><li> Verwijder vlinder naald van patiënt en druk uit te oefenen met een steriel gaasje in plaats van ader punctie gedurende 1 min. Cover site met een steriel verband. </li></ol> 2. Isolatie van mononucleaire cellen Opmerking: De verzamelde uit stap 1 bloed perifere mononucleaire cellen (PBMC&#39;s) (bijvoorbeeld lymfocyten en monocyten) naast de mononucleaire CTCs bevatten. <ol><li> Pipetteer volbloed in 50 ml polystyreen conische buis met 5 ml serologische pipet en voeg Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in een 1: 1 ratio. Voorzichtig pipet mengsel te homogeniseren. </li><li> Voeg 15 ml van een commercieel bereide oplossing (Ficoll-Paque) te scheiden bloedcomponenten door lage snelheid dichtheidsgradiënt centrifugeren met een lege 50 ml conische buis van polystyreen. </li><li> Voorzichtig pipet volbloed en HBSS mengsel uit stap 2.1, in de polystyreen buis uit stap 2.2, met verschillende toplaag te vormen. Set pipet op de laagste stand om het mengen van oplossingen te minimaliseren, dit zal zorgen voor efficiënte scheiding. </li><li> Centrifugeer bij 400 xg gedurende 30 min bij kamertemperatuur (25 ° C). Stel vertraging op de laagste stand om het mengen van oplossingen na scheiding te voorkomen. Versnelling kan worden ingesteld op een snelheid. </li><li> Na centrifugeren identificeren van de dunne witgrijze streep PBMCs en CTCs laag gesandwiched tussen plasma boven en scheidingsoplossing op de bodem van de buis. </li><li> Verzamel de cellen van het wit-grijze streep in stap 2,5 in een 50 ml polystyreenbuis met een plastic pipet overdracht. </li><li> Voeg aan 50 ml HBSS polystyreen conische buis met PBMCs en CTCs en centrifuge opnieuw bij 400 xg gedurende 10 min RT te wassen. </li><li> Giet vloeistof en resuspendeer pellet in 50 ml HBSS en centrifugeren weer bij 400 g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur te wassen. </li><li> Verwijder het supernatant, resuspendeer de resterende pellet met 5 ml van rode bloedcellen Lysis buffer en incubeer de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Verwijder de rode bloedcel lysisbuffer door centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min bij RT. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS 1x, aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) te blokkeren voordat antilichaamkleuring. </li></ol> 3. Kleuring mononucleaire cellen met CD45-FITC antilichaam voor Fluorescentie Activated Cell Sorting (FACS) <ol><li> Kwantificeren aantal levensvatbare (trypan blue-negatieve) cellen (uit stap 2,11) met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Maak een 1 x 10 6 cellen / ml suspensie (in PBS 1x met 10% FBS) en plaats het op ijs gedurende 1 uur. </li><li> Verdeel de gekwantificeerdecelsuspensie uit de vorige stap in twee buizen. Label buizen als controle en CD45 kleuring. </li><li> In de controlebuis, voeg IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) bij een verdunning van 1: 250. In de CD45 kleuring buis, voeg CD45 FITC (2,5 ug / ml) geconjugeerd primair antilichaam in een verdunning van 1: 250 en incubeer de celsuspensies op ijs gedurende 30 min. CD45 antigen labeling wordt gebruikt om hematopoïetische cellen sluiten. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 400 g gedurende 3 min bij 4 ° C en de bovenstaande vloeistof. </li><li> Was de cellen tweemaal door suspenderen elke pellet met steriel 1 x PBS gesupplementeerd met 10% FBS, gevolgd door centrifugatie bij 400 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Resuspendeer de cellen in een 1 ml oplossing van PBS bevattende 1 x 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) bij een concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Filter de uiteindelijke oplossing door middel van 35 micrometer zeef caps in 12 mm x 75 mm polystyreen buizen. </li></ol> 4. Isolatie van Prostaat CTC&#39;s doorFACS Opmerking: Gebruik een flowcytometer om live CD45 negatieve CTC&#39;s te verzamelen. <ol><li> Stel controles vergoeding gebruik van cellen uit de buis label &quot;Control.&quot; </li><li> Maak poorten die puin en clusters van cellen met behulp van de juiste forward-scatter en side-scatter parameters te sluiten. </li><li> Bepaal de FITC poorten met de celsuspensies uit de buis label &quot;CD45-FITC.&quot; </li><li> Poort levensvatbare (DAPI-negatief) cellen met behulp van de Pacific Blue-A-kanaal. </li><li> Verzamel CD45 negatieve populatie in een steriele 15 ml polystyreen conische buis met 2 ml van Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 gesupplementeerd met 10% FBS. </li><li> Centrifugeer de gesorteerde prostaat tumorcel suspensie bij 400 xg gedurende 3 min, daarna resuspendeer de pellets in 200 - 500 pl RPMI gesupplementeerd met 10% FBS. </li></ol> 5. Injectie van CTC in Muizen en Monitoring van Xenograft Growth Let op:Voeren alle dierlijke procedures in overeenstemming met protocollen door de institutionele dierlijke zorg commissie goedgekeurd. Dit protocol is uitgevoerd bij onze instelling onder een specifieke dieren Gebruik Protocol door onze Animal Care Committee in overeenstemming en de naleving van alle relevante wettelijke en institutionele organisaties, voorschriften en richtlijnen goedgekeurd. <ol><li> Meng de gesorteerde prostaat tumorcel suspensie met extracellulaire matrix bij een 1: 1 verhouding en plaats op ijs. </li><li> Verdoven muis vóór subcutane implantatie in een kamer toevoeren 5% (v / v) ingeademd isofluraan bij 1 l / min zuurstof. Zorgen voor passende verdoving door te controleren op het verlies van het hoornvlies en de teen reflex in de muis. </li><li> Met behulp van een 25 G naald en een spuit 1 ml, injecteer 250 ul van de prostaat tumorcel en extracellulaire matrix celsuspensie subcutaan in zowel de bovenste flanken van een 8-10 weken oude mannelijke immunodeficiënte muis. Injecteer 250 ui ongeacht CTC concentratie het injectievolume is het important waarde. Maximum SQ toediening bij muizen niet meer dan 1 ml. &#160;</li><li> Monitor muizen door het uitvoeren wekelijkse palpatie van muis injectieplaatsen voor de groei van subcutane nodulaire dichtheden en door het meten van het gewicht muizen tweemaal per week. </li><li> Euthanaseren muizen door kooldioxide stikken, gevolgd door cervicale dislocatie en oogsten subcutane humane prostaatkankerxenograften wanneer tumorgrootte is dan 0,5 cm en minder dan 1 cm in grootste diameter voldoende tumorweefsel voor moleculaire analyse en seriële passage zorgen. Euthanaseren muizen met tekenen van angst of gewichtsverlies van 15% ondanks dat er geen tumor is voelbaar. </li></ol>

<ol><li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer discovery. 4, 998-1013 (2014).</li>
<li>Siolas, D., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumor+xenografts%3A+transforming+clinical+samples+into+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models.</a> Cancer research. 73, 5315-5319 (2013).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology%2C+detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Biology, detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO molecular medicine. 1, 1-11 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+enrichment+by+immunomagnetic+nanobeads+for+unbiased+characterization+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Negative enrichment by immunomagnetic nanobeads for unbiased characterization of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients.</a> Journal of translational medicine. 9, 1-9 (2011).</li>
<li>Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics+%2C+2013%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+a+cancer+journal+for+clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics , 2013.</a> CA: a cancer journal for clinicians. 63, 11-30 (2013).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer cell. 22, 373-388 (2012).</li>
<li>Klein, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+of+metastatic+human+prostate+cancer+to+androgen+independence+in+immunodeficient+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Progression of metastatic human prostate cancer to androgen independence in immunodeficient SCID mice.</a> Nature Medicine. 3, 402-408 (1997).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+therapy.+Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer therapy. Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Hodgkinson, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumorigenicity+and+genetic+profiling+of+circulating+tumor+cells+in+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Tumorigenicity and genetic profiling of circulating tumor cells in small-cell lung cancer.</a> Nature medicine. 20, 897-903 (2014).</li>
<li>Vidal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Targetable+GATA2-IGF2+Axis+Confers+Aggressiveness+in+Lethal+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">A Targetable GATA2-IGF2 Axis Confers Aggressiveness in Lethal Prostate Cancer.</a> Cancer cell. 27, 223-239 (2015).</li>
<li>Quintana, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tumour+formation+by+single+human+melanoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Efficient tumour formation by single human melanoma cells.</a> Nature. 456, 593-598 (2008).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature. 17, 1514-1520 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dit manuscript beschrijft een werkwijze voor het genereren van prostaatkanker PDX modellen van CTCs. Het gebruik van CTCs voor het genereren van PDX modellen heeft een aantal potentieel belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden. Eerst toegankelijke verzameling CTCs uit perifeer bloed maakt het genereren van experimentele modellen van dezelfde patiënt in verschillende stadia van de ziekte. Ten tweede bloedafname is een veiligere en goedkope methode om tumorcellen te isoleren ten opzicht...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/video/53182">Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells</a>. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo

A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells.

Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patiënt afgeleid xenotransplantaten worden steeds populairder experimentele modellen gebruikt voor kankeronderzoek. Ze kunnen worden gebruikt voor de karakterisering van biomerkers en biologische pathways, pre-klinische evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen, en het creëren van virtuele personen gepersonaliseerde kankertherapieën 1,2. Eerder hebben andere onderzoeksgroepen PDX modellen ontwikkeld ofwel door het implanteren of het injecteren van enkele tumorcel schorsingen of hele tumor explantaten in immunogecompromitteerd muizen 1. Deze PDX modellen vereisen chirurgische collectie van verse vaste tumoren, kwaadaardige ascites en pleurale effusie van een patiënt die een chirurgische procedure die zowel kostbaar en loopt de patiënt een verhoogde kans op iatrogene morbiditeit. Een belangrijke recente ontwikkeling in kankeronderzoek detectie, isolatie en karakterisering van circulerende tumorcellen. Deze tumorcellen ontsnappen uit de primaire tumor massa en voer circulatiewaar ze spelen een cruciale rol in metastase en terugval, de meest voorkomende oorzaak van kanker gerelateerde sterfte 3. De evaluatie en karakterisering van CTCs uit verschillende solide tumor types zijn klinische informatie voor de diagnose, prognose en monitoring residuele ziekte 3 voorzien. Verschillende momenteel gebruikte methoden een beroep op zowel de fysische eigenschappen, expressie van biomarkers of functionele kenmerken van CTCs gebruikt kunnen worden om efficiënt isoleren CTCs 4. Bestaande macroschaal CTC isolatiemethoden omvatten dichtheidsgradiënt centrifugering, filtratie fysiek met filter poriën en scheiding tegen oppervlaktemoleculen. De meest gebruikte CTC isolatie methoden zijn gebaseerd op antilichamen gebaseerde vastlegging van CTCs. Zowel positieve als negatieve selectie van celoppervlak markers kunnen worden toegepast voor het isoleren CTCs uit perifeer bloed. Positieve selectie van CTCs in de perifere circulatie gewoonlijk gebruikt epitheliale merkers (bijvoorbeeld EpCAM), dat eenre uitgedrukt op CTCs maar niet hematopoëtische cellen. Het nadeel van deze methode is dat CTCs met metastatische potentie vaak ondergaan epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT), waarbij epitheliale oppervlak 3 merkers downreguleert. Om CTC met metastatische potentieel te isoleren, een negatieve selectie methodiek die de hematopoietische oppervlak marker CD45 telt, om afbrekende de normale cel populatie van leukocyten kan worden gebruikt 5. Prostaatkanker is de meest gediagnosticeerde kanker en een belangrijke oorzaak van kankersterfte bij mannen 6. De mechanismen van de tumorprogressie en agressiviteit niet volledig begrepen en dus het genereren en karakteriseren van experimentele modellen die de moleculaire heterogeniteit van prostaatkanker herhalen van groot belang. PDX modellen van prostaatkanker zijn geweest eerder gegenereerd door implantatie van menselijke prostaatkankercellen in immunocombeloofde muizen 7,8. Echter de vorming van dergelijke modellen wordt bemoeilijkt door het lage percentage enting van prostaatkanker in immuungecompromitteerde muizen, die voornamelijk aan de indolente aard van de ziekte. Recent zijn CTCs gebruikt om borstkanker 9, 10 longkanker en prostaatkanker 11 PDX modellen genereren. Deze proof-of-concept studies introduceerde de mogelijkheid van het genereren van PDX modellen onafhankelijk van de noodzaak voor chirurgische monstername. In dit artikel beschrijven we in detail een werkwijze voor het verkrijgen van deze nieuwe experimentele model.

<table><tbody><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning Cell Gro</td><td>21-031-CM</td><td></td></tr><tr><td>35 &micro;m Cell Strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml polystyreen conische buis</td><td>Crystalgen</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>Rode bloedcel lysering buffer</td><td>Sigma</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>d3571</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440</td><td></td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm Polystyrene buizen met celstrainer dop</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Lavender Bloedopnamebuizen met EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Gevleugelde Bloedopname Set met Duw Knop Terugtrek Naald 23 gauge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Eenmalige Naaldhouder</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weggeef Latex Tourniquet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Latex of non-latex handschoenen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>alcohol watten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 katoenen gaas kussentjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zelfklevende pleister</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 G naald</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml spuit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generatie van prostaatkanker patiënt afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patint-afgeleide xenograft (PDX) modellen winnen aan populariteit in kankeronderzoek en worden gebruikt voor preklinische medicijnevaluatie, biomarkeridentificatie, biologische studies en gepersonaliseerde geneeskundestrategieën. Circulerende tumorcellen (CTC's) spelen een cruciale rol bij tumormetastase en zijn geïsoleerd uit patiënten met verschillende tumortypen. Recent zijn CTC's gebruikt om PDX-experimentele modellen van borst- en prostaatkanker te genereren. Dit manuscript beschrijft de methode voor het genereren van prostaatkanker PDX-modellen vanuit CTC's ontwikkeld door onze groep. Voordelen van deze methode ten opzichte van conventionele PDX-modellen omvatten onafhankelijkheid van chirurgische monstercollectie en het genereren van experimentele modellen in verschillende ziektestadia. Dichtheidsgradientcentrifugering gevolgd door rode bloedcellyse en flowcytometrische depletie van CD45-positieve mononucleaire cellen wordt gebruikt om CTC's uit perifere bloedmonsters van patiënten met gemetastaseerde ziekte te verrijken. De CTC's worden vervolgens geïnjecteerd in immuungecompromitteerde muizen; vervolgens gegenereerde xenografts kunnen worden gebruikt voor functionele studies of worden geoogst voor moleculaire karakterisering. De primaire beperking van deze methode is de negatieve selectiemethode die wordt gebruikt voor CTC-verrijking. Ondanks deze beperking biedt de generatie van PDX-modellen vanuit CTC's een nieuw experimenteel model dat kan worden toegepast op prostaatkankeronderzoek.

Dit protocol zal leiden tot de vorming van PDX modellen uit geïsoleerde CD45 negatieve prostaatkanker CTC. Op basis van de negatieve selectiemethode gebruikt in ons protocol dient om dode cellen te sluiten via DAPI kleuring. Het percentage CD45 negatieve cellen gedetecteerd door flow cytometrie is variabel en hangt af van de tumor belasting van de patiënt (figuur 1A). Immunofluorescentiekleuring ongesorteerd cellen met behulp CD45 en DAPI (voor celkernen identificeren) openbaart CD45 negatieve cellen, z...

Dit manuscript beschrijft een methode die wordt gebruikt om xenografts (PDX's) van prostaatkankerpatiënten te genereren vanuit circulerende tumorcellen (CTC's). Het genereren van PDX-modellen uit CTC's biedt een alternatief experimenteel model om prostaatkanker te bestuderen; de meest vaak gediagnosticeerde tumor en een frequente doodsoorzaak door kanker bij mannen.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Het algemene doel van het volgende protocol is het genereren van prostaatkanker patiëntafgeleide xenografts vanuit circulerende tumorcellen. Dit wordt bereikt door eerst perifeer bloed te verzamelen van patiënten met gevorderde prostaatkanker.Als tweede stap wordt de fractie mononucleaire bloedcellen geïsoleerd, waarin de circulerende tumorcellen zich bevinden. Vervolgens worden de mononucleaire cellen gekleurd met een CD 45 ZI-antilichaam. Om de circulerende tumorcellen met behulp van flowcytometrie te selecteren, worden de cellen daarna geïnjecteerd in immuungecompromitteerde muizen. De resultaten tonen de generatie van prostaatkanker-xenografts aan op basis van de injectie van circulerende tumorcellen die via flowcytometrie zijn geïsoleerd uit het perifere bloed van prostaatkankerpatiënten.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van prostaatkanker door nieuwe experimentele modellen te genereren die kunnen worden gebruikt voor de moleculaire karakterisering van prostaatkanker en de ontwikkeling van nieuwe biomarkers. De procedure wordt gedemonstreerd door Williams, een student uit het laboratorium, en Omada, een onderzoeker van de afdeling oncologie hier bij Mount Sinai. Begin met het afnemen van volbloed van geselecteerde patiënten met gemetastaseerde prostaatkanker, aangezien zij potentieel een hoog aantal circulerende tumorcellen in hun perifeer bloed hebben. Gebruik een serologische pipette van 10 milliliter om het volbloed over te brengen naar een conische polystyreenbuis van 50 milliliter, samen met Hank's balanced salt solution.Pipette het mengsel voorzichtig in een verhouding van één-op-één om het te homogeniseren. Voeg vervolgens 15 milliliters van een FI call pack-oplossing toe aan een lege polystyreen conische buis van 50 milliliter. Pipette voorzichtig 20 milliliters van het verdunde volbloed, met behulp van de laagste instelling, bovenop de oplossing om een duidelijke bovenlaag te vormen.Centrifuge de buis vervolgens 30 minuten bij 400 Gs. Stel bij kamertemperatuur de vertraging van de centrifuge in op de laagste stand om menging van de oplossingen na scheiding te voorkomen. Identificeer na centrifugatie de dunne, witgrijze band van perifere bloedmononucleaire cellen en circulerende tumorcellen die zich tussen de bovenste plasmalaag en de scheidingsvloeistof bevindt.Verzamel voorzichtig de cellen uit de witgrijze streep onderaan de buis en breng deze over naar een polystyreen buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens met een plastic transferpipet Hank's Balanced Salt Solution toe aan de geïsoleerde cellen tot een totaalvolume van 10 milliliter.Centrifugeer het mengsel opnieuw bij 400 Gs gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en herhaal deze wasstap nogmaals om de cellen te wassen.Gooi na de tweede wasbeurt het supernatant weg. Suspendeer het resterende pellet in vijf milliliter lysebuffer voor rode bloedcellen en incubeer de oplossing gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende drie minuten bij 400 Gs bij kamertemperatuur en verwijder de lysebuffer door het supernatant weg te gooien.Resuspendeer ten slotte de pellet in één milliliter PBS aangevuld met 10% foetaal runderserum voorafgaand aan de kleuring. Kwantificeer het aantal levensvatbare cellen met de standaard trypanblauw-uitsluitingsmethode op een hemocytometer of een automatische celteller. Verdun de cellen vervolgens tot 1 miljoen cellen per milliliter in PBS met 10% FBS en plaats ze gedurende één uur op ijs.Om aspecifieke binding te blokkeren, wordt de celsuspensie over twee afzonderlijke buisjes verdeeld. Label één buisje voor controlecellen en één voor CD 45-gekleurde cellen in het controlebuisje. Voeg IgG one Kappa Zi toe in een verdunning van 1 op 250 tot een uiteindelijke concentratie van 10 nanograms per milliliter.Voeg in de CD 45-kleuringsbuis het CD 45 ZI-geconjugeerde primaire antilichaam toe in dezelfde concentratie van 10 nanograms per milliliter en incubeer de cel-suspensies 30 minuten op ijs. Centrifugeer de cellen vervolgens 3 minuten bij 400 Gs bij vier graden Celsius en verwijder daarna het supernatant.Was de cellen twee keer door elk pellet te suspenderen in steriele PBS aangevuld met 10% FBS, gevolgd door centrifugatie bij 400 Gs gedurende drie minuten bij vier graden Celsius. Na het wassen worden de cellen geresuspendeerd in een oplossing van één milliliter PBS bevatttend 10 microgram per milliliter dappy-kleurstof. Filtreer de uiteindelijke oplossing door 35 micrometer zeefdoppen in polystyreen buisjes van 12 millimeter bij 75 millimeter om eventuele celklonters of debris uit te sluiten.Sluit vervolgens de CD 45-positieve cellen en dode cellen uit de suspensie uit met behulp van fluorescence activated cell sorting om deze te verwijderen, zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Meng de gesorteerde prostaattumorcel-suspensie in een verhouding van één-op-één met extracellulaire matrixeiwitten en plaats het mengsel op ijs. Anestheseer vervolgens een immuundeficiënte muis van acht tot 10 weken oud, conform de institutionele richtlijnen, met 5% geïnhaleerd isofluraan in één liter per minuut zuurstof.Zorg voor een adequate anesthesie door te controleren op het verlies van de cornea- en teenreflex bij de muis. Trek 250 µL van de cel-suspensie op met een naald van 25 gauge en een spuit van 1 mL. Injecteer vervolgens het volledige volume van de extracellulaire matrix cel-suspensie subcutaan in beide bovenflanken van de muis. Monitor de tumoren door wekelijks de injectieplaatsen van de muis te palperen op de groei van subcutane nodulaire verdichtingen.Op basis van de methode voor negatieve selectie die in dit protocol wordt gebruikt, is het noodzakelijk om dode cellen uit te sluiten met behulp van DAPI-kleuring. Zoals hier wordt getoond, is het percentage CD 45-negatieve cellen van de overgebleven levensvatbare cellen variabel en afhankelijk van de tumorlast van de patiënt, maar deze zijn eenvoudig te scheiden van de CD 45-positieve cellen. Wanneer de juiste gating wordt toegepast, zullen er na implantatie van de prostaattumorcel-suspensie subcutane nodulaire verdichtingen zichtbaar worden aan beide flanken van de muis.Elke nodulaire verdichting vertegenwoordigt de groei van een xenograft en kan worden onderscheiden van gezond weefsel doordat het uitsteekt boven de dorsale musculatuur van de muis en een stevigere textuur heeft. Patiëntafgeleide xenograft-modellen, gegenereerd uit circulerende tumorcellen, reproduceren menselijke prostaattumoren, zoals blijkt uit hematoxyline- en eosinekleuringen en immunohistochemie voor prostaatspecifieke cellulaire markers zoals de androgeenreceptor en het prostaatspecifieke membraanantigeen na het genereren van de xenografts. Andere protocollen, zoals gen- of eiwitexpressieprofilering, kunnen worden uitgevoerd om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die bijdragen aan de agressiviteit van prostaatkanker.

generation-prostate-cancer-patient-derived-xenograft-models-from

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven de productie van samengeperste hormoon pellets, alsmede subcutane chirurgische implantatie in muizen. Deze strategie kan worden gecombineerd met de groei van cellen en weefsels xenotransplantaten onder de renale capsule van athymische naakt muizen hormonale carcinogenese en regulering van benigne prostaat groei te evalueren.

Nier Capsule Xenografting en subcutaan Pellet Implantatie voor de Evaluatie van de Prostaat Carcinogenese en benigne prostaathyperplasie

Prostaatkanker is de op een na meest voorkomende oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten. Een orthotopisch kankermodel biedt een nuttige benadering om de biologie van prostaatkanker te begrijpen en de werkzaamheid van therapeutische regimes te evalueren. Dit protocol beschrijft gedetailleerde stappen die nodig zijn om een orthotopisch muismodel voor prostaatkanker te vestigen.

Pre-klinische Orthotope muizenmodel van Human prostaatkanker

We beschrijven een methode voor stabiele kenmerken van de patiënt afgeleide xenotransplantaten (PDXs) met lentivirale deeltjes uiten van groen fluorescerend eiwit en luciferase reporters. Deze werkwijze maakt het volgen van de groei van PDXs op de primaire locatie, alsmede detectie spontane en experimentele metastasen gebruik in vivo beeldvorming.

Etikettering van borstkanker-Patient afgeleid Xenograften met Traceable Verslaggevers voor tumorgroei en metastase Studies

Het doel van dit protocol is om aan te tonen van de intra-prostaat injectie van prostaat kankercellen, met latere castratie. Orthotopic preklinische modellen van androgeen-afhankelijke en castratie-resistente prostaatkanker zijn cruciaal voor het bestuderen van de ziekte in het kader van een klinisch relevante tumor communicatie en een immunocompetent host.

Een bioluminescente en fluorescerende Orthotopic Syngeneic lymfkliertest Model van androgeen-afhankelijke en castratie-resistente prostaatkanker

Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.

Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen

We tonen een methode voor obductie en dissectie van muizen prostaatkanker modellen, gericht op prostaat tumor dissectie. Een stap-voor-stap protocol voor het genereren van muis prostaat tumor organoïden wordt ook gepresenteerd.

Generatie van tumor Organoïden uit genetisch gemanipuleerde Muismodellen van prostaatkanker

Het huidige protocol beschrijft methoden voor de vaststelling van de patiënt afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen en primaire kanker cellijnen van chirurgische maagkanker monsters. De methoden bieden een nuttig instrument voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en Kankerbiologie onderzoek.

Oprichting van maagkanker patiënten afgeleide xenograft modellen en primaire cellijnen

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

We presenteren een protocol om een minimaal invasief orthotopisch pancreaskankermodel te genereren door echogeleide injectie van menselijke pancreaskankercellen en de daaropvolgende monitoring van tumorgroei in vivo door echografie.

Generatie van een orthotopisch xenotransplantaat van pancreaskankercellen door echogeleide injectie

De heterogeniteit van prostaatkanker en de resistentie tegen de behandeling blijven uitdagingen. We beschrijven een protocol voor het genereren van patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) die de belangrijkste kenmerken van de ouderlijke tumor behouden. Dit gestandaardiseerde model ondersteunt de screening van geneesmiddelen en de vooruitgang op het gebied van precisiegeneeskunde.

Oprichting en onderhoud van van patiënten afgeleide organoïden voor prostaatkanker: een gedetailleerd experimenteel protocol

Leer hoe u prostaatkanker PDX-modellen genereert uit circulerende tumorcellen met behulp van flowcytometrie en injectie in immuungecompromitteerde muizen. Deze methode biedt waardevolle experimentele modellen voor kankeronderzoek.

Generatie van prostaatkanker Patiënt Afgeleid xenotransplantaatmodellen van circulerende tumorcellen

Meer video's verkennen