Het bestuderen van de stoichiometrie van de epidermale groeifactor receptor in intacte cellen met Correlatieve Microscopy

Het algemene doel van het volgende experiment is om de distributie en stoichiometrie van epidermale groeifactorreceptoren of EGFR's in het plasmamembraan van intacte en gehydrateerde cellen te visualiseren met fluorescentie- en elektronenmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst EGFR-expresserende cellen, zoals cos seven, te kweken op microchips met een 50 nanometer dun siliciumnitride-membraan dat over een centraal gelegen venstergebied gespannen is. Vervolgens worden de cellen geïncubeerd met een gebiotineerde versie van de epidermale groeifactor die aan de receptor bindt en de conformatie van EGFR verandert, wat leidt tot dimerisatie en activatie.

Vervolgens worden de cellen gefixeerd om de receptoren te immobiliseren en geïncubeerd met gestripte Hagen-geconjugeerde quantum dots die binden aan de EGF-geactiveerde receptoren, waarna de cellen worden afgebeeld. Ten slotte zorgt een tweede fixatie met glutaraldehyde voor crosslinking van de gestripte habit in geconjugeerde quantum dots met de EGFR, wat het monster stabiliseert voor elektronenmicroscopie. De resultaten tonen een emissie van rode fluorescentie via fluorescent quantum dot-imaging en de EGFR-distributie en stoichiometrische status of clustering via scanning transmissie elektronenmicroscopie.

Deze methode biedt unieke informatie over de voorraadgeometrie en distributie van membraanreceptoren in intacte cellen en kan worden gebruikt om inzicht te verkrijgen in de activering van de epidermale groeifactorreceptor in normale cellen en in kankercellen. Het kan ook worden toegepast om andere membraanreceptoren, zoals ionkanalen, te bestuderen. Begin de procedure onder een chemische afzuigkap. Voor de eerste voorbereidingsstappen van siliciumnitride-membraanmicrochips en na het onderdompelen in aceton volgens het tekstprotocol, worden de microchips direct overgebracht naar een bekerglas met ethanol. Wacht twee minuten, haal de chips uit de ethanol en plaats ze op een cleanroom-doekje.

Wanneer de chips zijn opgedroogd, worden ze overgebracht naar een glazen objectglas dat vooraf in een petrischaal is geplaatst. Plaats vervolgens het deksel op de schaal. Plaats daarna het objectglas met de microchips in een plasmareiniger.

Voer een standaard reinigingsprogramma van vijf minuten uit om het oppervlak van het siliciumnitride-membraan hydrofiel te maken. Verplaats vervolgens de microchips onder de laminaire flowkast van het glas. Schuif ze op een cleanroom-tissue voordat u ze in een well van een 24-wells plaat plaatst die is gevuld met poly-L-lysine-oplossing of PLL; incubeer gedurende vijf minuten.

Transfer vervolgens de microchips één voor één naar een tweede well met HPLC-kwaliteit water voordat ze worden gespoeld in een tweede well met water. Plaats de microchips ten slotte individueel in wells van een 96-wells plaat gevuld met DM en plaats de plaat in een kooldioxide-incubator met een COS zeven-cel subcultuur. Bereid een monodisperse celsuspensie voor met een concentratie van ongeveer vijf keer 10th.

De vijf cellen per milliliter. Voeg één druppel cel-suspensie toe aan elke microchip in de 96-wells plaat en incubeer vijf minuten bij kamertemperatuur met een geïnverteerde microscoop. Begin met het onderzoeken van de gebieden op de microchips om een geschatte dichtheid van 20 tot 30 cos zeven cellen per venster van 150 by 400 micrometer te bereiken.

Wanneer de cellen voldoende zijn gehecht, worden de microchips voorzichtig overgebracht met de celzijde naar boven in nieuwe wells met dm. Wanneer er voldoende cellen gehecht zijn gebleven, worden de microchips met de cellen naar boven overgebracht naar nieuwe wells met serumvrij dmm. Incubeer de microchips vervolgens gedurende enkele uren tot overnacht bij 37 graden Celsius in een kooldioxide-incubator ter voorbereiding op de volgende stappen.

Vul de putjes van een 96-wells plaat met de benodigde oplossingen en gebruik één rij of kolom per microchip. Spoel de microchips door ze in een putje met verse B-S-A-G-E-L-P-B-S te plaatsen en incubeer deze gedurende vijf minuten bij 37 °C. Verplaats de microchips naar een 300 nM EGF-biotine-oplossing en plaats ze drie minuten terug in de incubator, aangezien de cellen met de endocytose van het EGF-gelabelde EGFR zullen beginnen.

Spoel de microchips snel drie keer met PBS. Spoel de monsters vervolgens met 0,1 molar cate-buffer of CB. Verplaats de microchips daarna naar 3% PFA en incubeer deze gedurende 10 minuten.

Na één keer spoelen met CB en drie keer met PBS, worden de chips overgebracht naar G-L-Y-P-B-S en gedurende twee minuten geïncubeerd. Spoel vervolgens twee keer met PBS. Plaats de microchips nu gedurende 10 minuten in 10 nM S-T-R-Q-D voordat ze vier keer worden gespoeld met B-S-A-P-B-S.

Dompel vervolgens één microchip onder in een glazen schaaltje van 35 millimeter dat vooraf is gevuld met B-S-A-P-B-S op kamertemperatuur om de cellen af te beelden met DIC- en fluorescentiemicroscopie. Gebruik een 40 x luchtobjectief voor overzichtsbeelden van cellen gelabeld met QD 6 55. Gebruik een filterkubus die de quantum dots exciteert tussen 340 en 380 nanometer met een emissie boven 420 nanometer.

Minimaliseer de lichtintensiteit om te voorkomen dat te intens licht het monster beschadigt. Stel de belichtingstijd in op ten minste 300 milliseconden, zodat de signalen van alle qds worden vastgelegd aangezien QD-fluorescentie knippert; pas de lichtintensiteit en de versterking aan om heldere beelden zonder zichtbare beeldruis te verkrijgen, terwijl de lichtintensiteit minimaal wordt gehouden. Plaats de microchip na het beelden terug in een 96-wellplaat met B-S-A-P-B-S.

Spoel één keer met cb en breng vervolgens 2% glutaraldehyde over, gevolgd door een incubatie van 10 minuten. Was en gebruik B-S-A-P-B-S om de microchip drie keer te wassen; bewaar deze in vooraf gevulde putjes met B-S-A-P-B-S van een nieuwe 96-wells plaat voor elke microchip. Vul een rij van vier putjes met HPLC-waardig water.

Nadat de ESEM is ingesteld volgens het tekstprotocol, wordt een monster in de pre-COOL ESEM STEM-houder geladen door de 96-well plaat uit de koelcontainer te halen en deze dicht bij de geopende ESEM-houder te plaatsen. Leg een cleanroom-doekje ernaast. Spoel een microchip snel af door deze vier keer gedurende een seconde in een well gevuld met HPLC-water te dopen.

Dep de achterzijde van de microchip kort af op het weefsel en plaats deze in de vooraf gekoelde houder met 3 µL gekoeld HPLC-grade water. Bevochtig het oppervlak van het monster en fixeer het monster in de houder. Plaats vervolgens drie extra waterdruppels van 3 µL op de houder nabij het monster en sluit de monsterkamer.

Nadat een cel van belang is geïdentificeerd, legt u volgens het tekstprotocol een STEM-overzichtsbeeld van de cel vast, verplaatst u naar een perifeer gebied van de cel waar de celrand zichtbaar is en zoomt u in tot een vergroting van 50,000 X. Leg beelden vast waarop individuele qds te zien zijn en gebruik pixel-verblijftijden van 20 tot 30 microseconden; hier wordt QD 6 55 gelabeld membraangebonden EGFR getoond in intacte, volledig gehydrateerde COS seven cellen. Het DIC-beeld illustreert hier de membraantopografie van de cellen en het overeenkomstige fluorescentiebeeld toont de distributie van EGFR over het gehele celoppervlak na drie minuten incubatie met EGF biotine.

Deze ESEM STEM-beelden met lage vergroting tonen fijne structuren, zoals filopodia die zich vanuit de cel naar naburige cellen uitstrekken, en enkele structuren binnen de dunnere celregio's. Dikke centrale celregio's, inclusief de nucleus, verschijnen wit omdat transmissie door het monster niet mogelijk is voor elektronen met de gebruikte energie. Hoge resolutie.

ESEM STEM-beelden van de dunnere perifere regio's tonen QD-labels op een membraanplooi die het beeld diagonaal kruist. Deze membraanstructuur heeft op verschillende locaties een hogere EGFR-dichtheid dan de omliggende membraanregio's, waarbij twee labels zich in nauwe nabijheid bevonden. Twee voorbeelden met afstanden van 20 en 24 nanometer zijn aangegeven met pijlpunten.

Deze paren labels worden geïnterpreteerd als behorend tot EGF Fers. Deze afbeelding is opgenomen van een gebied met een lagere EGFR-dichtheid en een zwakker fluorescent signaal. Desondanks werd EGFR hier ook in dimeren aangetroffen en waren er twee clusters van 10 of 11 EEG aanwezig.

Zodra de methode onder de knie is, kan de monstervoorbereiding binnen twee uur worden voltooid, wat aanzienlijk sneller is dan veelgebruikte technieken voor elektronenmicroscopie. De daaropvolgende essem STEM-imaging kan tot 100 beelden met een hoge resolutie opleveren binnen een halve dag.