Name: Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Leer geoptimaliseerde weefselverwerking voor translationeel kankeronderzoek met menselijke chirurgische resecties. Deze methode maximaliseert data-extractie uit beperkte monsters voor betrouwbare analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de filantropische bijdragen van de John G. en Marie Stella Kenedy Memorial Foundation (Grant # 0727033) en de Melanoma Research Alliance. De auteurs willen de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center Institutionele Tissue Bank (ITB) bedanken voor de coördinatie van het weefsel distributie en het verzamelen en translationeel onderzoek te vergemakkelijken, evenals Dr. Ignacio Wistuba, Dr. Victor Prieto, de MD Anderson Cancer Center Afdeling pathologie en het melanoom Moon Shot Program. Tot slot, de auteurs willen alle patiënten en families getroffen door melanoom te erkennen.

Ethische verklaring: Dit protocol wordt goedgekeurd door de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center. 1. Specimen Procurement <ol><li> Verzamel onderzoek weefselmonsters van overtollige tumor en aanverwante normaal weefsel 10-12. Exemplaren te slaan op nat ijs om autolyse te voorkomen. </li><li> Stuur alle weefsels, medische hulpmiddelen en vreemde lichamen verwijderd tijdens een chirurgische ingreep aan de afdeling Pathologie voor noodzakelijke onderzoeken om een ​​pathologische diagnose te vergemakkelijken. </li><li> Handvat weefsel voor onderzoek in overeenstemming met de toepasselijke onderzoek en weefsels banking beleid en procedures toegewezen. OPMERKING: Biospecimen collectie omvat de coördinatie van de pathologen, pathologen &#39;assistenten, histotechnologists en specialisten weefsels. </li></ol> 2. Pathologie Quality Assurance (QA) <ol><li> Voltooien en controleer patiëntendossiers als een vroege QA maatregel en raadpleeg een patholoog om diagnostische pa beoordelentient verslagen (pathologie rapporten, weefsel dia&#39;s, enz.) en weefselmonsters. Rechter weefselmonsters op morfologische kenmerken van belang, zoals het percentage van de tumor necrose, tissue-tumor-interface, enz. Dit is in overeenstemming met biorepository best practices 10-12. </li><li> Na de eerste beoordeling, voeren periodieke evaluaties van biorepository gegevens en onderzoek monsters gedurende de gehele lengte van het verblijf van de biospecimen. </li><li> Link resultaten en aantekeningen van histopathologische en andere onderzoeken naar de monsters en geven deze gegevens aan de onderzoekers via een eigen biorepository software systeem. OPMERKING: QA processen zorgen voor de integriteit van zowel de klinische en technische aspecten van biorepository operaties. </li><li> Voer genetische en moleculaire tests om te controleren en te karakteriseren de monsters voor klinisch gebruik. </li><li> Verzamelen en data gebaseerd op feedback van onderzoekers die gebruiken de monsters voor laboratoriumproeven analyseren. Spoormonsters met behulp van barcode-technologie. Deze elektronische tracking systeem wordt ook bepleit in biorespository best practices 10-12. </li></ol> 3. Specimen / Tissue Processing <ol><li> Bewaar verse weefselmonsters op nat ijs en proces zo snel mogelijk, om veranderingen geïnduceerd door extractie van het weefselmonster uit zijn natuurlijke milieu te beperken. Proces normale tumor-geëvenaard en tumor weefsel monsters afzonderlijk om kruisbesmetting te voorkomen. OPMERKING: Op basis van onderzoek protocollen kunnen verwerken biospecimen verzamelen van de monsters omvatten een of meer soorten media. </li><li> Voor het begin van het proces, stelt een steriele Petri-kweekschaal, een scalpel, en een naald of forceps weefseldoorwerkingsmethoden voor. Zorg ervoor dat buizen zijn opgesteld, geëtiketteerd, en uit met het oog op de tijd van het monster verwerking (figuur 2) te beperken vastgelegd. </li><li> Alle relevante weefsel informatie, zoals naam van de patiënt, het aantal, de behandeling, de datum vanchirurgie, en andere relevante informatie voor zover van toepassing voor de studie kan zijn, moet gemakkelijk toegankelijk zijn in een institutionele weefsel databank worden gemaakt. Beperkte patiënt informatie moet worden gehouden in het lab op papier of spreadsheet vorm. NB. Alleen verzamelen biospecimen informatie om de aard van het onderzoek namelijk relevant fundamenteel biomedisch onderzoek, klinisch onderzoek, translationeel onderzoek, enz. Voor de ziekte-specifieke informatie, het biorepository personeel moeten gegevens die door de huidige literatuur noodzakelijk achtte en betreffende organisaties verzamelen om zorgen voor een goede diagnose en zinvolle onderzoek. Dit omvat, maar is niet beperkt tot tumor status en kanker opvoeren informatie. </li><li> Plan alle gewenste volgende experimenten vooraf bepalen van de grootte van weefselsecties voor elke soort analyse, evenals de locatie van excisions. Idealiter, hoewel onmogelijk, alle analyses moeten representatief zijn voor de hele sectie weefsel zijn om rekening te houden met het weefsel heterogeneity en beperken vooringenomenheid van de downstream-analyses. Leg alle benodigde items op voorhand zoals weergegeven in figuur 2. </li><li> Plaats het weefsel model in de open Petri cultuur schotel, vlak tegen het oppervlak. LET OP: Laat alleen geautoriseerde biorepository personeel geïdentificeerd monsters hanteren en te herzien geïdentificeerd gezondheidsgegevens. Onderzoekers moeten toegang krijgen tot alleen die patiënt identifiers zoals toegestaan ​​door de ondertekende geïnformeerde toestemming en zoals gereguleerd door de IRB. Alle monsters moeten adequaat worden geëtiketteerd en moet ten minste, een uniek weefsel identificatienummer en weefsel type. Bevatten geen PHI in de etiketten, in overeenstemming met de HIPAA regelgeving. </li><li> Inspecteer het monster vanuit alle hoeken, om een ​​beter begrip van de structuur en afmetingen krijgen. Speld het monster naar de bodem van de schaal met de naald, en ga verder met het weefsel langs de grootste en beste vertegenwoordiger as halveren. </li><li> Knip een klein stukje weefsel en plaats het in een steriele 1,5 ml MICRocentrifuge buis met 1 ml RNA-stabiliserende oplossing. Dit monster kan op ijs geplaatst gedurende de rest van het proces en bewaard bij 4 ° C totdat het nodig is. OPMERKING: Bij het werken met RNA, handschoenen altijd gedragen en RNAse-vrij tipjes worden gebruikt om de kansen op RNA degradatie en contaminatie. </li><li> Lay-out van een open en pre-gelabelde biopsie cassette in de deksel van de Petri cultuur schotel. Snijd een plakje weefsel niet dikker dan 3 tot 5 mm en overbrengen naar de cassette. Plaats de cassette in 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) voor minimaal 72 uur. Breng de cassette in 70% ethanol voor de lange termijn opslag voor paraffine-inbedding. OPMERKING: Labeling van cassettes dient in potlood of met de aanbevolen markers als gebruik van xyleen tijdens de verwerking anders labels gewist worden uitgevoerd. </li><li> Knip een stukje weefsel en plaats het in een weefsel mal. Bedek de sectie weefsel in optimale snijtemperatuur (LGO) verbinding, en onmiddellijk bevriezenbij -20 ° C gedurende cryosectioning. Dit weefselsectie kan worden bewaard bij -20 ° C tot klaar voor cryosectioning. </li><li> Knip een of meerdere stukjes weefsel en overbrengen naar een 50 ml buis met MACS-buffer (1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 0,5% foetaal runderserum (FBS), 2 mM Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)) voor daaropvolgende flowcytometrieanalyse . Voor flowcytometrie kunnen grotere monsters voorkeur als cellen verloren tijdens tumor dissociatie, cel fixatie en permeabilisatie wanneer nodig. In het algemeen, kan dit gedeelte worden aan het einde hebben als alle andere stukken verwerkt. Overgebleven representatieve tumor monster worden gebruikt voor flowcytometrie. Eventueel kan deze buis worden bewaard bij 4 ° CO / N of voor flowcytometrische kleuring onmiddellijk na omzetting in een celsuspensie (zie Stap 4 - Flow cytometrische kleuring). </li><li> Snij resterende weefsel in stukken niet groter dan een maximale grootte van 0,5 mm x 0,5 mm en overbrengen naar cryogeneflacons voor onmiddellijke bevriezing in vloeibare stikstof. Deze snap-ingevroren monsters kunnen worden gebruikt voor toekomstige analyses en samenwerkend doeleinden. OPMERKING: Extra zorg moet worden genomen bij het werken met vloeibare stikstof als direct contact ernstig letsel kan veroorzaken. Ogen moeten worden beschermd met een veiligheidsbril met zijstukken of een gezichtsbescherming. Cryogene handschoenen moet ook worden gedragen om te beschermen tegen vloeibare stikstof brandwonden veroorzaakt door spatten en direct contact. Handschoenen moeten goed passen, maar zijn los genoeg om snel worden verwijderd moet vloeibare stikstof splash in hen. </li></ol> 4. Flowcytometrische kleuring <ol><li> Weefsel Homogenisering <ol><li> Bereid digestie met DMEM medium (40 ml), DNase I (50 U / ml) en collagenase I (2 mg / ml). Plaats vers of O / N opgeslagen tumor in MACS buffer in de deksel van een petrischaal en ondergedompeld met digestiemedium. NB:. Verschillende spijsvertering methoden bestaan, elk met voordelen (dwz celoppervlakeiwit expression, leefbaarheid). Zorg ervoor dat u de juiste methode voor uw gewenste downstream applicatie. </li><li> Pin tumor aan de bodem van de schaal met een naald, en gesneden van buitenaf tot centrum met een scalpel, totdat de tumor heeft een pasta-achtige structuur. Transfer tumor mix in een 50 ml buis, seal en plaats in een plastic zak om lekken te voorkomen. Verbindingsleiding een incubator en draaien met 225 rpm, 37 ° C, 1 uur. </li><li> Filter tumorcel suspensie door een 70 urn cel zeef. Centrifugeer celsuspensie bij 250 xg, 4 ° C, 5 min. Resuspendeer celpellet in 1 ml FACS buffer (500 ml PBS, 1 ml 0,5 M voorraad EDTA, 10 ml FCS of FBS). </li><li> Tellen cellen met een hemocytometer en resuspendeer in een concentratie van 1x10 7 cellen / ml. Transfer 100 ul per putje (10 6 cellen) in een 96 putjes met ronde bodemplaat voor kleuring. </li></ol></li><li> Levensvatbaarheid en antilichaamkleuring <ol><li> Voeg 200 ul van levensvatbaarheid kleuroplossing aan elke well en meng. Incuverminder gedurende 30 minuten bij 4 ° C in het donker. Spin down cellen bij 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant. </li><li> Voeg antilichaam mengsel bij aanbevolen / bepaalde concentratie (volgens de fabrikant) voor oppervlakte-antigenen in 200 ul FACS buffer. Incubeer de cellen bij 4 ° C, 30 min in het donker. Spin down cellen bij 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant. </li><li> Wassen met 200 ui FACS-buffer, het afsluiten cellen op 250 xg, 4 ° C, 5 min, en zuig supernatant. Resuspendeer cellen in 200 ul FACS buffer en ga naar cytometer stromen voor acquisitie en analyse. LET OP: Als het uitvoeren van intracellulaire flowcytometrie kleuring, voeren fixatie en permeabilisatie stappen en intracellulaire kleuring tussen de stappen 4.2.2 en 4.2.3. Bij het uitvoeren cytokine kleuring moeten de cellen vooraf geactiveerde voorafgaande kleuring, zoals aanbevolen, en een remmer van intracellulair eiwit en secretie zoals monensine te worden tijdens activeringzorgen behoud van oplosbare factoren. Gefixeerde cellen kan worden bewaard kort (één week) bij 4 ° C in het donker vóór verkrijging bij flowcytometer. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lorsch, J. R., Collins, F. S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology.+Fixing+problems+with+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Biology. Fixing problems with cell lines.</a> Science. 346, 1452-1453 (2014).</li>
<li>van der Worp, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+animal+models+of+disease+reliably+inform+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Can animal models of disease reliably inform human studies.</a> , PLoS Med. 7, e1000245 (2010).</li>
<li>McCabe, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Behav%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease.</a> Physiol. Behav. 68, 501-507 (2000).</li>
<li>Woolf, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+translational+research+and+why+it+matters%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">The meaning of translational research and why it matters.</a> JAMA. 299, 211-213 (2008).</li>
<li>Brockbank, K. G., Taylor, M. J. Tissue Preservation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrockbank%2C+KG+%22Advances+in+Biopreservation%22">Advances in Biopreservation</a>. , 157-159 (2006).</li>
<li>Bulmer, M. The ethics of social research. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBulmer%2C+M+%22Researching+social+life%22">Researching social life</a>. Gilbert, N. , Sage. London. 45-57 (2001).</li>
<li>Penslar, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPenslar%2C+RL+%22IRB+guidebook%22">IRB guidebook</a>. , US Government Printing Office. (1993).</li>
<li>Protection of human subjects. CFR Title 21 Section 50.25. , Food and Drug Administration. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25">http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?FR=50.25</a> (2011).</li>
<li>HIPAA privacy rule and public health. Guidance from CDC and the US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm">http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/su5201a1.htm</a> (2003).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22MD+Anderson+Cancer+Center+Institutional+Tissue+Bank+Standard+Operating+Procedures%22">MD Anderson Cancer Center Institutional Tissue Bank Standard Operating Procedures</a>. 3, Institutional Tissue Bank. (2009).</li>
<li>Collection, Storage, Retrieval and Distribution of Biological Materials for Research. , 3rd ed., International Society for Biological and Environmental Repositories. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf">http://biorepository.uic.edu/Contact_Us_files/ISBERBestPractices3rdedition.pdf</a> (2011).</li>
<li>NCI Best Practices for Biospecimen Resources. , 2nd ed., Office of Biorepositories and Biospecimen Research. Available from:
 <a target="_blank" href="http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf">http://biospecimens.cancer.gov/bestpractices/2011-NCIbestpractices.pdf</a> (2011).</li>
<li>Ruffell, B., et al. Leukocyte composition of human breast cancer. Proc. of the Ntnl. Aca. of Sci. 109, 2796-2801 (2012).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Baker, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+phosphoprotein+as+a+biological+marker+of+tumor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Stability of phosphoprotein as a biological marker of tumor signaling.</a> Clin. Cancer Res. 11, 4338-4340 (2005).</li>
<li>Jacobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+processing+considerations+for+detecting+copy+number+changes+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+protocols%22%5BJournal%5D)">Sample processing considerations for detecting copy number changes in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2012, 1195-1202 (2012).</li>
<li>Chung, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+in+tissue+handling+and+processing+that+impact+RNA+obtained+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Factors in tissue handling and processing that impact RNA obtained from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 56, 1033-1042 (2008).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+procedure+for+protein+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+for+reverse+phase+protein+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">An efficient procedure for protein extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues for reverse phase protein arrays.</a> Proteome Sci. 10, 1477-5956 (2012).</li>
<li>Feldman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+mRNA+amplification+for+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Advantages of mRNA amplification for microarray analysis.</a> Biotechniques. 33, 906-914 (2002).</li>
<li>Francino, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+real-time+PCR+assay+for+diagnosis+and+monitoring+of+canine+leishmaniosis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Advantages of real-time PCR assay for diagnosis and monitoring of canine leishmaniosis.</a> Vet Parasitol. 137, 214-221 (2006).</li>
<li>Grunberg-Manago, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Messenger+RNA+stability+and+its+role+in+control+of+gene+expression+in+bacteria+and+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Messenger RNA stability and its role in control of gene expression in bacteria and phages.</a> Annu. Rev. Genet. 33, 193-227 (1999).</li>
<li>Lesnik, E. A., Freier, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+thermodynamic+stability+of+DNA%2C+RNA%2C+and+DNA%3ARNA+hybrid+duplexes%3A+relationship+with+base+composition+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Relative thermodynamic stability of DNA, RNA, and DNA:RNA hybrid duplexes: relationship with base composition and structure.</a> Biochemistry. 34, 10807-10815 (1995).</li>
<li>MacBeath, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarrays+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Protein microarrays and proteomics.</a> Nat Genet. 32, 526-532 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Uiteindelijk moet de verwerkingsmethoden worden gedicteerd door de gewenste hypothese en de verwachte technische assays worden uitgevoerd (Figuur 1). Het volgende deel dient als een overzicht van potentiële tests die kunnen worden uitgevoerd op een dergelijke weefsel secties te beschrijven. Het is geenszins een uitputtend overzicht, maar is bedoeld om gids monster verwerkingsmethoden en de keuze van de downstream assays helpen door het beschrijven van technieken en aanbieden van hun sterke en zwakke pun...

Medisch onderzoek heeft enorm geprofiteerd van de studie van zowel menselijke cellijnen en diermodellen. Cellijnen zorgen voor betere controle van componenten in een systeem, alsmede het gebruik van cellen van het juiste organisme. Het werken met menselijke cellen, terwijl meer representatieve, presenteert een drastisch vereenvoudigd momentopname van mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de gezondheid en ziekte kan zijn, omdat cellijnen de invloed van andere cellen, stromale componenten, en de organen die reacties 1 kunnen beïnvloeden niet kunnen herhalen. Anderzijds, dierlijke modellen, hoewel niet helemaal correct reproduceren menselijke ziekten en genetische heterogeniteit bieden verder inzicht doordat voor het invoeren van gehele dieren in de meeste modellen 2,3. Tekortkomingen opzij, beide methoden hebben hun voordelen en zijn complementair. Echter, het belangrijkste doel blijft menselijke cellen en organen te bestuderen in een full body, meerdere organen. Dienovereenkomstig, translationeel onderzoek heeft taken grote vooruitgang in het onderzoek van menselijke organen en weefsels geëxtraheerd uit patiënten te vergemakkelijken, om beter begrijpen van de mechanismen onderliggende ziekte. Translationeel onderzoek biedt het voordeel van het bestuderen van het resultaat van behandelingen en ziekten in het lichaam en in geschikte cellen, waardoor het beste van twee werelden tussen cel en proefdierstudies 4. Translationeel onderzoek is ook niet zonder gebreken. Geoogst monsters van humane patiënten na verwijdering uit de gastheer, onmiddellijk onderworpen aan ischemie en andere externe factoren waarvan zij anders zouden worden beschermd. Dit kan leiden tot stress geïnduceerde moleculaire en genetische veranderingen en bias in latere studies veroorzaken. Daarom is er veel inspanning in de winning en verwerking van weefsels door strikte methoden om beste orgel en mobiele integriteit te bewaren voor downstream studies 5 gezet. Belangrijker nog, moeten toekomstige toepassingen zorgvuldig worden overwogen bij de keuze van methoden of bewerken van menselijke monsters, zoals bepaalde methoden schadelijk voor cellulaire componenten kunnen zijn en signaalwegen terwijl spaarde anderen. Voor elk onderzoek waarbij menselijke weefsels, moet regelgeving worden aangepakt. Na Tuskegee en Belmont rapporten groeide aanvaard dat biomedisch onderzoek werd geassocieerd met inherente risico vaak tot onvermijdelijke ethische 6 dilemma. De behoefte aan nationale normen werd erkend en de federale overheid opgericht Institutional Review Board (IRB) als een middel om de principes van de Belmont rapport handhaven (respect voor personen, Weldadigheid, Justitie). IRB Elke instelling is een commissie van artsen, onderzoekers en leden van de gemeenschap die verantwoordelijk zijn voor de bescherming van deelnemers aan het onderzoek. Het vereist dat vrijwillige toestemming worden verkregen van alle deelnemers van biomedisch onderzoek studies, en dat deze toestemming te worden vastgelegd in een geïnformeerde toestemming fo<html> rm. De geïnformeerde toestemming proces is bedoeld om adequate informatie te verstrekken aan een deelnemer, zodat een weloverwogen beslissing kan worden gedaan over het al dan niet in te schrijven in een studie, of te blijven deelnemen. In dit verband moet de geïnformeerde toestemming document goede leesbaarheid en moeten in taal die gemakkelijk kan worden begrepen (6 e tot 8 ste klas leesniveau) van de doelpopulatie worden geschreven. De mogelijkheid van dwang of ongepaste beïnvloeding moet worden geminimaliseerd, en het onderwerp moet worden gegeven voldoende tijd om de deelname te overwegen. De deelnemer moet ook worden toegestaan ​​om hun recht op instemming in elk stadium terug te trekken in de loop van het onderzoek zonder boete uit te oefenen. Vrijwillige geïnformeerde toestemming is een verplichte voorwaarde voor de deelname van een proefpersoon in het onderzoek en het is ook rechtsgeldig 7. Zoals aangegeven in de regelgeving voor de bescherming van proefpersonen 21 CFR 50,25 (/45cfr46.html&quot;&gt;http://www.hhs.gov/ohrp/humansubjects/guidance/45cfr46.html 8), moeten deelnemers worden geïnformeerd over het doel van het onderzoek, de procedures die betrokken zijn bij het ​​onderzoek, alternatieven voor participatie, alle voorzienbare risico&#39;s en ongemakken (waaronder niet alleen lichamelijk letsel, maar ook psychologische, sociale of economische schade, ongemak of overlast), de voordelen van het onderzoek voor de samenleving en eventueel aan de individuele, de lengte van de tijd het onderwerp wordt verwacht om deel te nemen, contactpersoon voor antwoorden op vragen of in het geval van een onderzoek met betrekking letsel of noodgeval verklaring waaruit blijkt dat de deelname vrijwillig is en dat de weigering om deel te nemen zal niet resulteren in de gevolgen of een verlies van voordelen, zoals een compromis in de reguliere klinische zorg dat de deelnemer anders heeft het recht om te ontvangen als gevolg van zijn / haar diagnoses, en tot slot een verklaring met betrekking tot het recht van de patiënt om de vertrouwelijkheid en het recht zich terug te trekken uithet onderzoek op elk gewenst moment zonder gevolgen. Weefsel monsters van deelnemers die tijdens de studie toestemming in te trekken moet niet dwarshelling en moet onmiddellijk worden opgebruikt. Afzien van een of meer elementen van informed consent kan worden verkregen van de IRB voor een aantal onderzoeksprojecten die kunnen praktisch niet worden gedaan zonder een wijziging van de benodigde elementen of voor studies indien nodig elementen zijn niet van toepassing. Grote zorg moet worden genomen om de vertrouwelijkheid van de gegevens te verzekeren. Het Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA) is een federale wet die voorkomt dat het gebruik of de openbaarmaking van &quot;beschermde gezondheidsinformatie&quot; (PHI) zonder schriftelijke toestemming van de deelnemers. PHI omvat, maar is niet beperkt tot medische informatie verzonden of gehandhaafd in enige vorm of medium bevat en velden die kunnen worden gebruikt voor het identificeren van een individu 9. Door middel van dit werk, willen we het protocol dat tijdens de tissu moeten worden gevolgd schetsene processing - inclusief aankopen en opslag en benadrukken het belang van het volgen van deze strikte richtlijnen om de vertekeningen die kunnen ontstaan ​​als gevolg van de spanningen een weefsel wordt onderworpen aan extractie bij minimaliseren. We streven er eveneens naar een kort overzicht van de downstream testen of analyses (figuur 1) dat kan worden uitgevoerd op deze specimens te bieden, zodat de lezer een gekwalificeerd oordeel over welke test (s) het best past bij hun behoeften kunnen maken.

```html
<table><tbody><tr><td>Naalden</td><td>BD</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>Wegwerp scalpels van roestvrij staal</td><td>Miltex</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschaal</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie cassettes</td><td>Thermo Fisher</td><td>58931</td><td></td></tr><tr><td>RNA-stabiliserende oplossing</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Eppendorf buisjes</td><td>Phenix</td><td>MAX-815</td><td></td></tr><tr><td>50 ml buizen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>10% neutraal gebufferd formaline</td><td>StatLab Medical Products</td><td>28600-5</td><td></td></tr><tr><td>Formaline containers</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-032-059</td><td></td></tr><tr><td>Optimale snijtemperatuur oplossing (OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura Finetek</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Collageenase I</td><td>Roche</td><td>11088793001</td><td></td></tr><tr><td>70&mu;m celsifters</td><td>BD Bioscience</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 wel ronde bodemplatten</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead kleuroplossing</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr></tbody></table>
```

werken met menselijke weefsels for translational cancer research

Working with Human Tissues for Translational Cancer Research

Medisch onderzoek ten behoeve van de mens wordt sterk gehinderd door de noodzaak van menselijk weefsel en proefpersonen. Echter, na het verkrijgen van toestemming voor menselijke monsters, moeten kostbare monsters met de grootste zorg worden behandeld om de integriteit van organen, weefsels en cellen tot het hoogste niveau te garanderen. Helaas vereist weefselverwerking per definitie de extractie van weefsels uit de gastheer, een verandering die grote cellulaire stress kan veroorzaken en grote gevolgen kan hebben voor daaropvolgende analyses. Deze stress kan ertoe leiden dat het monster niet langer representatief is voor de plaats waaruit het werd verkregen. Daarom moet bij de verwerking van deze monsters een strikt protocol worden gevolgd om representatiefheid te garanderen. De gewenste test(en) moeten ook in overweging worden genomen om ervoor te zorgen dat een optimale techniek wordt gebruikt voor monsterverwerking. Hieronder is een protocol voor weefselwinning, -verwerking en verschillende analyses die kunnen worden uitgevoerd op verwerkt weefsel om de downstream-productie uit beperkte weefselmonsters te maximaliseren.

<html> De hieronder weergegeven resultaten tonen flowcytometrie gating strategie voor brede immune fenotypering op een verwerkt melanoom tumor. De dag van kleuring werd weefselmonster geknipt en gehomogeniseerd met collagenase I en DNase I incubatie gedurende 60 min bij 37 ° C onder 225 rpm rotatie. Na digestie werd celsuspensie gefiltreerd door een 70 um cel zeef om vuil te verwijderen en de cellen werden gekleurd met fluorescentie gemerkte antilichamen voor flowcytometrie immuuncel fenotypering. Hieronder (figu...

Translationeel kankeronderzoek is afhankelijk van de extractie van menselijk weefsel. Er is veel werk verzet om extractiemethoden voor ex vivo analyse te optimaliseren. Hier beschrijven we weefselverwerkingsmethoden die een maximale data-output toestaan van beperkte monsters.

Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research

Medical research for human benefit is greatly impeded by the necessity for human tissues and subjects. However, upon obtaining consent for human ...

Het algemene doel van deze procedure is om de kwaliteit en kwantiteit van de data die uit weefselmonsters worden geëxtraheerd te maximaliseren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van translationeel kankeronderzoek, zoals welke mutaties aanwezig zijn, welke signaalpaden zijn geactiveerd en welke immuuncel-subtypen menselijke tumoren infiltreren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat een grote hoeveelheid data kan worden gegenereerd uit een enkele chirurgische resectie van menselijk weefsel.Een van de meest kritische stappen voorafgaand aan de monsterverwerking is het waarborgen van de monsterkwaliteit en het valideren van de aanwezigheid van levensvatbare tumor door pathologische beoordeling, zoals beschreven in de protocoltekst. Alle relevante informatie voor het monster of weefsel, zoals patiëntnaam, nummer, behandeling en operatiedatum, moet direct toegankelijk zijn in een institutionele weefseldatabase. Verse weefselmonsters moeten altijd worden bewaard op nat ijs en zo snel mogelijk worden verwerkt om veranderingen te beperken die worden veroorzaakt door de extractie van het weefselmonster uit zijn natuurlijke omgeving. Normale tumor-gematchte en tumorweefselmonsters moeten afzonderlijk worden verwerkt.Om kruiscontaminatie te voorkomen, bereidt u een steriele Petri-schaal, een scalpel en een naald of pincet voor voor de weefselbewerking. Om de bewerkingstijd van het monster te beperken, legt u alle benodigde materialen vooraf klaar zoals hier wordt afgebeeld. Plaats het weefselmonster plat tegen het oppervlak in de open Petri-schaal.Inspecteer het monster vanuit alle hoeken om een beter inzicht te krijgen in de structuur en afmetingen ervan. Zet het monster met de naald vast op de bodem van de schaal en bisecteer vervolgens het weefsel langs de grootste en meest representatieve as. Snijd een klein stukje weefsel uit en plaats dit in een steriele 1.5 milliliter microcentrifugebuis die één milliliter RNA-stabiliserende oplossing bevat.Plaats dit monster voor de rest van het proces op ijs en bewaar het bij vier graden Celsius tot het nodig is. Leg een open en vooraf gelabelde biopsiecassette op het deksel van de Petri-cultuurschaal. Snijd een weefselplakje met een dikte van maximaal drie tot vijf millimeter uit en breng dit over naar de cassette.Plaats de cassette gedurende minimaal 72 uur in 10% neutraal gebufferde formaline. Snijd bij kamertemperatuur een stukje weefsel uit en plaats dit in een weefselvorm. Bedek de weefselsectie met optimal cutting temperature compound en vries deze onmiddellijk in bij -20 °C tot het moment van cryosectie.Snijd één of meerdere stukjes weefsel uit en breng deze over naar een buis van 50 milliliter met max buffer. De weefsels kunnen vers worden gebruikt of overnacht worden bewaard bij vier graden Celsius voor flowcytometrie-analyse. Snijd het resterende weefsel in stukjes met een maximale afmeting van 0,5 millimeter bij 0,5 millimeter en breng deze over naar cryovials.Bevries de weefsels onmiddellijk in vloeibare stikstof voor langdurige bewaring. Om deze procedure te starten, bereidt u het digestiemedium met DM EMD NS one en collagenase. Plaats een verse tumor of een tumor die een nacht in max buffer is bewaard in het deksel van een Petrischaal en onderdompel deze in het digestiemedium.Zet de tumor met een naald vast aan de bodem van de schaal en snijd met een scalpel van buiten naar binnen tot de tumor een pasta-achtige textuur heeft. Breng het tumormengsel over naar een buis van 50 milliliter en sluit de buis af om lekken te voorkomen. Plaats de buis in een incubator en agiteer gedurende één uur bij 225 RPM bij 37 degrees Celsius.Filter na één uur de tumorcel-suspensie door een 70 µm cell strainer en centrifugeer de celsuspensie bij 250 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten. Resuspendeer de celpellet in 1 mL FACS-buffer. Nadat de cellen zijn geteld met een hemocytometer, worden de cellen geresuspendeerd tot een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per mL.Breng 100 µL of 10⁶ cellen over naar elke put van een 96-wells plaat met ronde bodem. Voeg 200 µL van de levensvatbaarheidsverfoplossing toe aan elke put, meng en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Centrifugeer de cellen na 30 minuten bij 250 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten.Aspireer het supernatant. Voeg het antilichaammengsel toe in 200 µL fax-buffer tegen de aanbevolen getitreerde concentratie voor oppervlakteantigenen. Incubeer de cellen 30 minuten lang in het donker bij vier graden Celsius.Centrifugeer de cellen bij 250 Gs en vier graden Celsius gedurende vijf minuten en aspireer het supernatant; was met 200 microliters fax buffer en centrifugeer de cellen opnieuw, aspireer het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 microliters fax buffer. De cellen zijn nu klaar voor analyse via flowcytometrie. Deze representatieve resultaten tonen de flowcytometrie gating-strategie voor brede immuunfenotypering op verwerkte melanomatumorsamples die zijn verwerkt zoals gedemonstreerd en gedurende de nacht zijn bewaard in max buffer bij vier graden Celsius, waarbij een zeer beperkte mortaliteit wordt vertoond.Verder wordt de verwerking van het weefsel gedemonstreerd. Zodra deze techniek onder de knie is, maakt het een multicolor brede fenotypering mogelijk van immuuncelpopulaties in melanoom, zoals B-cellen, CD4 T-cellen, CD8 T-cellen, gamma-delta T-cellen en NK-cellen, dendritische cellen, macrofagen, mestcellen, basofielen, neutrofielen en eosinofielen. Deze techniek kan in vier uur worden voltooid indien deze correct wordt uitgevoerd.

working-with-human-tissues-for-translational-cancer-research

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Op lange termijn Cultuur van menselijke borstkankercellen Monsters en hun analyse met behulp van optische projectie Tomografie

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Diepgaande analyses van kankercel-proteomen vergemakkelijken de identificatie van nieuwe doelen voor geneesmiddelen en diagnostische biomarkers. We beschrijven een experimentele workflow voor kwantitatieve analyse van (fosfo-)proteomen in kankercelsubpopulaties afgeleid van vloeibare en vaste tumoren. Dit wordt bereikt door cellulaire verrijkingsstrategieën te combineren met kwantitatieve Super-SILAC-gebaseerde massaspectrometrie.

Kwantitatieve Massaspectrometrische Profilering van Kanker-cel proteoom Afgeleid Van vloeibare en vaste tumoren

Protocollen worden beschreven voor het bestuderen van borstkanker celmigratie, proliferatie en kolonisatie in een menselijk botweefsel explantaatmodel systeem.

Methoden voor het kweken van menselijke dijbeen weefselexplantaten naar Breast Cancer Cell Kolonisatie van het gemetastaseerde Niche Bestudeer

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van echografie-geleide injectie van neuroblastoom (NB) en de Ewing sarcoom (ES) cellen (gevestigde cellijnen en patiënt afkomstige tumorcellen) op biologisch relevante sites maken van betrouwbare preklinische modellen voor kanker onderzoek.

Gebruik van echografie begeleide weefsel geleide cellulaire implantatie voor de oprichting van biologisch relevante uitgezaaide Tumor Xenografts

Biobanken zijn cruciale bronnen voor biomedisch onderzoek en de Biobank for Translational and Digital Medicine Unit van het European Institute of Oncology is een model op dit gebied. Hier geven we een gedetailleerde beschrijving van de standaard operationele procedures van biobanken voor het beheer van verschillende soorten menselijke biologische monsters.

Biobank voor translationele geneeskunde: standaard operationele procedures voor optimaal monsterbeheer

Dit protocol schetst de generatie van muizen van het menselijk immuunsysteem (HIS) voor immuno-oncologische studies. Instructies en overwegingen bij het gebruik van dit model voor het testen van menselijke immunotherapeutica op menselijke tumoren die in dit model zijn geïmplanteerd, worden gepresenteerd met de nadruk op het karakteriseren van de reactie van het menselijk immuunsysteem op de tumor.

Testen van kankerimmunotherapeutica in een gehumaniseerd muismodel met menselijke tumoren

Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.

Oprichting van van alvleesklierkanker afgeleide tumororganoïden en fibroblasten uit vers weefsel

Dit protocol presenteert een fysiologisch relevant tumor-on-a-chip-model om basis- en translationeel kankeronderzoek bij mensen met een hoge doorvoer uit te voeren, het screenen van geneesmiddelen, ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen te bevorderen met een beschrijving van laad-, onderhouds- en evaluatieprocedures.

Opzetten van een fysiologisch menselijk gevasculariseerd microtumormodel voor kankeronderzoek

Dit protocol schetst de procedure voor het snel dissociëren van tumormonsters van mensen en muizen voor sequencing van enkelcellig RNA.

Dissociatie van tumorweefselmonsters van mensen en muizen voor eencellige RNA-sequencing

Een unieke methode om chirurgisch orale plaveiselceltumoren die in de mondholte zijn gevestigd, te verwijderen, wordt hier getoond.

Translationeel relevant tumorresectiemodel voor muispreklinische modellen van orale plaveiselcelcarcinoom

Leer geoptimaliseerde weefselverwerking voor translationeel kankeronderzoek met menselijke chirurgische resecties. Deze methode maximaliseert data-extractie uit beperkte monsters voor betrouwbare analyses.

Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research

Meer video's verkennen