Modellering Encephalopathie van Prematurity gebruik van prenatale hypoxie-ischemie met Intra-vruchtwater Lipopolysaccharide bij ratten
20 november 2015
Encephalopathie van prematuriteit omvat de afwijkingen van het centrale zenuwstelsel die geassocieerd zijn met letsel door vroeggeboorte. Dit rapport beschrijft een klinisch relevante rattenmodel van in utero tijdelijke systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische lipopolysaccharide toediening (LPS) die chorioamnionitis nabootst, en de gerelateerde impact van infectieuze stimuli en placentale ondervoeding op de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.
Het algemene doel van deze chirurgische procedure is om een reproduceerbaar model te bieden van hersenletsel geassocieerd met extreem premature geboorte, via de inductie van in utero, tijdelijke systemische hypoxie, ischemie en intra-amniotische ontsteking om placenta-insufficiëntie en chorioamnionitis bij ratten na te bootsen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de pathogenese van perinatale hersenletsel die voortvloeien uit intra-uteriene processen die de ontwikkeling van gerichte therapeutische strategieën vergemakkelijken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de systemische schade induceert die intra-uteriene aanvallen van zowel infectie als hypoxie, ischemie nabootst en functionele neurologische deficiënties veroorzaakt bij de volwassen rat.
Dit model is bijzonder geschikt voor het ontrafelen van de mechanismen van letsels gerelateerd aan ontsteking. Aangezien de hypoxie, ischemie en infectieuze stimuli afzonderlijk of als een gecombineerde verwonding kunnen worden getest, zal Lindsey Chan, een technicus uit ons laboratorium, de procedure demonstreren. Voordat u met de procedure begint, gebruikt u kleine dierenschaar om al het haar uit de onderste buikstreek van een embryonale dag te verwijderen.
18 zwangere rat in een rechthoekig patroon, zorg ervoor dat u de tepels niet snijdt of een scheermesuitslag veroorzaakt. Gebruik vervolgens steriele wattenstaafjes om de huid te schrobben met drie wisselende toepassingen van povidonjodium en 70% ethanol. Wanneer de huid droog is, bevestigt u de juiste diepte van de anesthesie door de teen te knijpen en het dier te draperen.
Gebruik vervolgens een scalpel om een middenlijnsnede van drie centimeter in de buik van het dier te maken, gevolgd door een platte dissectie van de huidlaagp van de buikfascie met een schaar. Gebruikend pincetten en chirurgische schaar. Til de buikfascielaag op en maak een incisie door de avasculaire lineaire elleboog.
Wanneer de buikholte is blootgelegd, plaatst u chirurgisch gaas op de buitenkant van de incisie en bevochtigt u het gaas met steriele zoutoplossing. Gebruik vervolgens platte forceps en externe druk op de buik om voorzichtig de baarmoederoorns uit de buikholte te verwijderen en de hoorns op het bevochtigde gaas te rangschikken. Zorg ervoor dat u verstrikking en contact met de darmen vermijdt, gebruik alleen het spierweefsel tussen de individuele vruchtzakken om de foetussen te rangschikken.
Gebruik vervolgens platte dissectie om de vier baarmoederarterieën bloot te leggen en te isoleren. Zorg ervoor dat u de moederlijke bloedvaten niet beschadigt wanneer de slagaders zijn geïsoleerd. Plaats een 30 gauge rat aneurysma clip op elke slagader. Voordat u de clips aanbrengt, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat al het omliggende weefsel volledig vrij is.
Bij het plaatsen van de clips, bevestig ze met de platte forceps en plaats ze vervolgens parallel. Het observeren van de stopzetting van de puls is cruciaal om volledige hypoxie ischemie te garanderen wanneer alle clips zijn geplaatst. Bevestig de stopzetting van de proximale en distale pulsen en het verdonkeren van de baarmoedervaten, inclusief in de individuele placenta's.
Bedek vervolgens het gehele chirurgische veld met gaas en irrigeer het weefsel met steriele zoutoplossing. Verwijder elke 10 minuten gedurende een uur na 60 minuten het gaas en irrigeer het veld opnieuw. Wanneer de baarmoederoorns en vaten voldoende zijn bevochtigd, gebruikt u forceps om voorzichtig elke aneurysma clip te verwijderen, zorg ervoor dat u geen trauma aan het vat veroorzaakt en de weefselintegriteit behoudt.
Irrigeer vervolgens de hoorns en het veld grondig. Nog een laatste keer, zorg ervoor dat u alle loszittende garens uit de vruchtzakken verwijdert. Om de foetussen met LPS te behandelen, gebruikt u platte forceps om elke vruchtzak te stabiliseren en te roteren zodat de basis van elke individuele vruchtzak zichtbaar is.
Laad vervolgens een ultrafijne 0,3 milliliter insulinesyringe met een gemonteerde acht millimeter 31 gauge naald met LPS-oplossing en injecteer 100 microliters van de oplossing net voor elke placentale plaat. Terwijl de naald wordt verwijderd, oefent u directe druk uit op de vruchtzak om eventuele vloeistoflekkage te stoppen. Het inbrengen van een ultrafijne 31 gauge naald aan de basis van de vruchtzak is cruciaal voor de juiste LPS-afgifte zonder dat er amniotisch vocht kan ontsnappen.
Nadat de baarmoederoorns drie keer met steriele zoutoplossing zijn geïrrigeerd, gebruikt u forceps om de hoorns terug te brengen in de buikholte. Gebruik vervolgens een lopende drie oh zijden draad om de randen van de musculo-fasciale laag opnieuw te approximeren zonder in of door een zak te naaien, gevolgd door sluiting van de huid met een andere lopende 3,0 zijden draad. Gebruik vervolgens een 26 gauge naald om subcutaan te injecteren.
Injecteer een milliliter van 0,125% bupivacaïne rond de wondranden. Droog de rat indien nodig met een handdoek, injecteer 0,1 milligram per kilogram buprenorfine in de nek. Plaats het dier in een schone thuiskooi met monitoring tot volledig herstel.
Na transiënte systemische hypoxie ischemie en LPS-toediening op embryonale dag 18, zoals zojuist is gedemonstreerd, toont het het en eosinkleuring significante histopathologische afwijkingen in zowel de placenta als in de hersenen. Inderdaad, placenta onderzocht op embryonale dagen 19 en 21 zijn bruut met microbloedingen en necrose door het hele decidua en labyrint. Aanzienlijke ontstekingsinfiltratie en verhoogde vaatvoorziening worden ook waargenomen.
Verder onderzochte hersenen op postnatale dag twee onthullen ventrikelmagaly, evenals witte stof en verlies van subplate-neuronen vergeleken met shams. Transiënte systemische hypoxie, ischemie en LPS verminderden ook significant de expressie van kaliumchloride cotransporter twee-eiwit, een chloride-cotransporter die centraal staat in de ontwikkeling van GABAergische remming in de cortex op postnatale dag 15, wat consistent is met de verminderde ontwikkelingsopwaardering die wordt waargenomen tijdens de kritieke postnatale
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een ratmodel dat hersenletsel simuleert dat geassocieerd is met extreem vroeggeboorte, door middel van in utero transiënte systemische hypoxie-ischemie en intra-amniotische inflammatie. Het model beoogt de mechanismen van perinatale hersenbeschadiging gerelateerd aan infectie en placentaire insufficiëntie te verduidelijken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Perinatale geneeskunde
Achtergrond
- Encefalopathie bij vroeggeboorten omvat afwijkingen van het centraal zenuwstelsel als gevolg van een premature geboorte.
- Chorioamnionitis en placentaire onderperfusie zijn belangrijke factoren bij de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel.
- Het begrijpen van deze factoren is cruciaal voor de ontwikkeling van therapeutische strategieën.
- Intra-uteriene processen kunnen leiden tot functionele neurologische tekorten.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar model van hersenletsel bij extreem premature ratten te creëren.
- Om de effecten van systemisch letsel te onderzoeken dat intra-uteriene beledigingen nabootst.
- Om de pathogenese van perinatale hersenbeschadiging te verkennen.
Gebruikte methoden
- Inductie van transiënte systemische hypoxie in utero.
- Inductie van ischemie en intra-amniotische inflammatie.
- Gebruik van een ratmodel om de effecten van gecombineerde letsels te bestuderen.
- Beoordeling van functionele neurologische tekorten bij volwassen ratten.
Belangrijkste resultaten
- Het model bootst de effecten van infectie en hypoxie-ischemie succesvol na.
- Het vermogen om individuele en gecombineerde letseleffecten te testen is aangetoond.
- Het bood inzicht in de met ontsteking gerelateerde mechanismen van letsel.
- Het faciliteerde de ontwikkeling van gerichte therapeutische strategieën.
Conclusies
- Dit model is waardevol voor het bestuderen van mechanismen van perinatale hersenschade.
- Het kan helpen bij het begrijpen van de impact van intra-uteriene omstandigheden op de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel.
- Toekomstig onderzoek kan dit model gebruiken om therapeutische interventies te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Dit prenatale ratmodel vult een kritisch gat in het onderzoek naar encefalopathie bij prematuren door kortstondige systemische hypoxie-ischemie te combineren met intra-amniotische inflammatie om menselijke placentaire onderperfusie en chorioamnionitis na te bootsen. Het maakt mechanistische analyse van uiteenlopende letseltypen mogelijk — ischemisch versus infectieus — wat targetvalidatie en de ontdekking van biomarkers voor perinatale neuroprotectie ondersteunt. Het vermogen van het model om functionele tekorten bij volwassen ratten te produceren die klinische fenotypes weerspiegelen, verhoogt het voorspellend vertrouwen voor preklinische therapeutische screening.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door hypoxie-ischemie en inflammatoire routes te isoleren in een gecombineerd letselmodel.
- Operationele waarde: Ondersteunt functionele targetvalidatie via kwantificeerbare schade aan het CZS, waaronder verlies van witte stof, subplaatneuronen en oligodendrocyten.
- Voorspellende waarde: Faciliteert portfolio-triage door convergente pathofysiologieën te modelleren die worden waargenomen bij extreem vroeggeboren zuigelingen.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert ziekterelevante neuroanatomische en functionele resultaten (loopafwijkingen, ventriculaire morfologie, KCC2-downregulatie) voor assay-standaardisatie.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantificeerbare resultaten in zowel placentaire als foetale compartimenten om screening van verbindingen met een hoge getrouwheid mogelijk te maken.
- Platformnut: Maakt sequentieel testen van individuele en gecombineerde insults mogelijk om mechanistische ambiguïteit bij de identificatie van lead-verbindingen te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Recapituleert meerdere EoP-criteria — neuronaal/axonaal verlies, degeneratie van de subplate en aanhoudende functionele tekorten — wat de translationele validiteit verhoogt.
- Operationele waarde: Maakt continuïteit mogelijk van prenatale beschadiging tot postnataal fenotype, wat longitudinale tracking van biomarkers ondersteunt.
- Risicobeperking: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door het modelleren van gecombineerde placentaire insufficiëntie en inflammatoire etiologieën.
Integratie van pijplijn en workflow
Het model past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypothesen via fenotypische screening tot preklinische validatie, in het bijzonder voor neuroprotectieve middelen die zich richten op inflammatoire of hypoxisch-ischemische pathways.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door het mogelijk maken van de dissectie van inflammatie bij verschillende soorten letsel (ischemisch versus infectieus) in utero.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve histopathologische en gedragsmatige resultaten die essentieel zijn voor de reproduceerbaarheid van assays en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt vergelijking van de ernst van het letsel mogelijk via placentaire histopathologie, foetale hersenhistologie en postnatale neurofunctionele assays.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij de klinische pathofysiologie van EoP, wat de afstemming van biomarkers en de continuïteit van preklinisch naar klinisch onderzoek ondersteunt.
- Enterprise Reuse: Dient als een herbruikbaar platform voor het evalueren van monotherapieën en combinatietherapieën over verschillende letselmodaliteiten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij perinatale hersenbeschadiging door synergistische placentaire en foetale insulten te modelleren.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde chirurgische timing (E18), clipplaatsing en LPS-doseringsprotocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door multifactoriële etiologieën te modelleren die leiden tot klinisch falen in een laat stadium bij neuroprotectie.
- Impact op portfolio: Maakt risicogestratificeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van effectiviteit binnen ischemische, inflammatoire of gecombineerde beschadigingsparadigma's.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microschirurgie bij knaagdieren, isolatie van de uterusarteria en manipulatie van de vruchtzak.
- Afhankelijk van precisie-instrumentarium: aneurysmaclemmen van gauge 30, insulinespuiten van gauge 31 en het handhaven van een steriel veld.
- Vereist standaardisatie tussen de teams voor chirurgie, histologie en gedragsanalyse voor een consistente fenotypering.
- Aanpassing aan andere modellen vereist validatie van de placentaperfusiedynamiek en de inflammatoire dosis-responscurve.
- Praktische beperkingen omvatten chirurgische variabiliteit bij de plaatsing van de clem en de LPS-diffusie, die gecontroleerd moeten worden via verificatie van de polsstop en spoeling met saline.
