Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen
October 10th, 2015
Dendritische stekels van piramidale neuronen zijn de sites van de meest prikkelende synapsen in de hersenen van zoogdieren cortex. Deze methode beschrijft een 3D-kwantitatieve analyse van de wervelkolom morfologie in menselijke corticale piramidale glutamaat neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen.
Het algemene doel van deze procedure is om dendritische stekels van perale neuronen afkomstig van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen te beelden en ze in drie dimensies te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst de dekglasjes in zeswelplaten te behandelen met polyurethaan en laminine voor het kweken van neurale stamcellen. Vervolgens worden neurale stamcellen verdund in cultuurmedium geplaatst, met behulp van een zachte roterende pijpettenbeweging en mogen ze zich gedurende maximaal 70 dagen in cultuur differentiëren. Door het medium regelmatig te verversen worden de cellen getransduceerd met GFP-lentivirus, gekleurd met anti-GFP-antilichamen en gevisualiseerd. Ten slotte worden de culturen gefixeerd en worden de dendritische stekels geïmagerd met behulp van confocale microscopie.
Uiteindelijk worden de beeldgegevens van menselijke dendritische stekels in 3D gereconstrueerd voor hun classificatie en kwantificering. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om glutamaterge neuronen van laag twee tot vier van de menselijke hersenschors te verkrijgen. Het omvat het gebruik van neurale stamcellen afgeleid van menselijk geïnduceerde prepotente stamcellen die afkomstig zijn van menselijke fibroblasten op basis van de eerder gepubliceerde methode.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden is dat deze de automatische segmentatie van DON rechts en PY in 3D mogelijk maakt. Dit resulteert in een aanzienlijke tijdwinst ten opzichte van bestaande software, die meestal alleen voor 2D-analyse is ontworpen. De DONR en SPY classificaties zijn erg handig en gemakkelijk te gebruiken.
Om neuronale culturen voor te bereiden, plaatst u glazen dekglasjes in zeswel kweekschalen en voegt u poly ornithine toe. Incubeer deze overnacht onder een flowhood. De volgende dag wast u de dekglasjes drie keer met DPBS en voegt u laminine toe, incubeer onder een flowhood gedurende minimaal 10 uur. Bereid kweekmedium voor met de volgende componenten.
Gebruik vervolgens het medium om neurale stamcellen of NSCS te plateren en uit te breiden met een dichtheid van 50.000 cellen per vierkante centimeter. Pipetteer met langzame roterende bewegingen om celclustering te verminderen om humane IPSC-afgeleide neuronen te transduceren. Voeg in elke kweekschaal met vers kweekmedium een microliter van een voorraadoplossing toe die 40 nanogram GFP-lentiviraal vector bevat, en incubeer gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius. Om cellen voor immunofluorescentie voor te bereiden, verwijdert u het kweekmedium en gebruikt u 4% formaldehyde om de getransduceerde cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te fixeren.
Was vervolgens de cellen drie keer gedurende 10 minuten met één keer XPBS. Dompel vervolgens de dekglasjes onder in PBS aangevuld met 0,05% Triton X 110% paardenserum en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dekglasjes drie keer met PBS.
Voeg één 1000ste GFP primaire antilichaam toe in 100 microliters PBS 4% paardenserum voor elk dekglas. Incubeer in een donkere doos bij vier graden Celsius overnacht. Verdun vervolgens Alexa Fluor 4 88 geconjugeerd antilichaam één op 200 in PBS 0,5% tween 20 en incubeer de cellen met de antilichaamoplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur nadat u de glijbanen drie keer met PBS hebt gewassen.
Gebruik montagemedium om de glijbanen voor fluorescentiemicroscopie te monteren. Selecteer onder een confocale microscoop ten minste 10 gezonde neuronen per conditie met een parametaalmorfologie en een gevouwen dendritisch arborisatie om 60 tot 100 micrometer per dendriet te kwantificeren. Verzamel beelden met een 40 x na, 1,3 olie objectief en een 488 nanometer laser met een typische piekvermogen op monstersniveau rond de 20 microwatt, stel de pixelgrootte rond de 80 nanometer om dendritische stekels goed te bemonsteren.
Om het hele neuronvolume te bemonsteren, verzamelt u een Z-stack met een Z-afstand van 150 tot 300 nanometer, wat 20 tot 30 Z-sneden oplevert om een 3D-kwantificering van dendritische stekels uit te voeren. Gebruik de volgende instellingen voor de analysesoftware voor voorverwerking. Gebruik Gaussiaanse filtering door de keuze van beeldverwerkingsvervaging Gaussiaanse filter.
Stel de filterbreedte gelijk aan de pixelgrootte in het XY-vlak om een semi-automatische tracering van dendrieten uit te voeren vanuit de filament tracer module. Gebruik in het snedetab de afstandtool om de dendrietdiameter te schatten. Klik vervolgens in het surpass tab op de filaments tool en kies overslaan van automatische creatie voor betere robuustheid In het draw tab.
Selecteer nu auto pad als methode, dendriet als type en voer de geschatte dendrietdiameter in. Gebruik de selectiemodus van de wijzer en verander de cursor in een vak en kies shift en klik met de rechtermuisknop op het startpunt van de dendriet. De software zal initiële berekeningen uitvoeren.
Verplaats nu de wijzer langs de dendriet vanaf het startpunt. Er wordt een gele lijn getoond die de meest waarschijnlijke dendrietpad vertegenwoordigt. Druk op shift en links.
Klik op het dendriet-eindpunt om geautomatiseerde stekelsegmentatie in de module-interface uit te voeren. Klik op de creatie-tab in de herbouwdruppellijst. Kies dendrietdiameter herbouw en vink het vakje keep data aan.
Klik vervolgens op herbouw. Stel de drempel in zodat het gesegmenteerde volume overeenkomt met het werkelijke dendrietvolume. Selecteer als algoritme kortste afstand vanaf afstandskaart.
Klik vervolgens op de volgende knop onder het snedetab, bepaal de kleinste stekel, kopdiameter en de maximale lengte. Vervolgens onder het surpass tab, voer de parameterwaarden in rond 200 tot 300 nanometer voor minimale diameter en vier micrometer voor maximale lengte zijn goede startpunten zonder het vakje toestaan stekels aan te vinken, klik op de volgende knop. Pas vervolgens de zaadpunten-drempel aan zodat de blauwe punten die stekels vertegenwoordigen lokaliseren bij de werkelijke stekelkoppen.
Klik vervolgens op volgende. De
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze methode beschrijft een 3D kwantitatieve analyse van dendritische stekels in humane corticale piramidale glutamaterge neuronen afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen. De procedure omvat het beeldvormen en kwantificeren van deze stekels om hun morfologie beter te begrijpen.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Stamcellenonderzoek
Achtergrond
- Dendritische stekels zijn cruciaal voor synaptische transmissie in de hersenen.
- Piramidale neuronen zijn een belangrijk type van exciterende neuronen in de cortex.
- Het begrijpen van de stekelmorfologie kan inzichten geven in neurale connectiviteit.
- Geïnduceerde pluripotente stamcellen bieden een model voor het bestuderen van humane neuronen.
Doel van het onderzoek
- Om de morfologie van dendritische stekels in humane neuronen te analyseren.
- Om stekelkenmerken in drie dimensies te kwantificeren.
- Om het begrip van synaptische structuren in de menselijke hersenen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Kweek van neurale stamcellen op behandelde dekplaatjes.
- Differentiatie van stamcellen gedurende maximaal 70 dagen.
- Transductie met GFP-lentivirus voor visualisatie.
- Beeldvorming van dendritische stekels met behulp van confocale microscopie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van dendritische stekels in gekweekte neuronen.
- Kwantitatieve analyse van de stekelmorfologie werd bereikt.
- Inzichten in de structurele eigenschappen van humane corticale neuronen.
- Methodologie vastgesteld voor toekomstige studies over synaptische structuren.
Conclusies
- De methode biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van dendritische stekels.
- Bevindingen dragen bij aan het begrip van exciterende synapsen.
- Mogelijke toepassingen in neurodevelopmental en neurodegeneratief onderzoek.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Three-dimensional quantification of dendritic spines in human iPSC-derived pyramidal neurons enables high-fidelity morphological analysis critical for early CNS target validation. This workflow supports predictive confidence in synaptic function studies and de-risks translational neuroscience programs by providing human-relevant, quantitative readouts. The approach is positioned to inform portfolio decisions in neuropsychiatric and neurodegenerative disease research pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of synaptic structure in human-derived neurons.
- Supports functional target validation by quantifying spine density and morphology.
- Facilitates predictive confidence in disease-relevant neuronal models.
- Provides a platform for comparative studies between control and patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible 3D imaging and quantification workflows.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream compound screening.
- Prepares validated neuronal systems for high-content analysis platforms.
- Enables reliable evaluation of synaptic modulators in human context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant human neuronal phenotypes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in CNS pipelines.
- Provides quantitative endpoints for translational biomarker development.
- De-risks advancement decisions by anchoring on human neuronal data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust hypothesis testing and quantitative phenotyping in human iPSC-derived neuronal models.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking via 3D spine analysis.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Delivers statistical measurements of spine density, head volume, and maturation state.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant human neuronal systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for diverse CNS research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes 3D imaging and quantification for scalable, reproducible outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in neurobiology portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS assets based on human-relevant data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human iPSC culture and neuronal differentiation.
- Demands access to confocal microscopy and advanced image analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging and quantification parameters.
- Adaptation may be needed for different neuronal subtypes or disease models.
- Careful cell handling is critical to ensure single-neuron identification and reduce clustering.
