Driedimensionale Kwantificering van Dendritische stekels van Piramidale Neuronen afgeleid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het algemene doel van deze procedure is het in beeld brengen van dendritische stekels van neuronen afgeleid van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen en het kwantificeren hiervan in drie dimensies. Dit wordt bereikt door eerst dekglasjes in zes-wells platen te behandelen met polyurethaan en laminine voor het kweken van neurale stamcellen. Vervolgens worden neurale stamcellen verdund in kweekmedium.

Het medium wordt aangebracht met een zachte roterende pipetbeweging en de cellen krijgen tot 70 dagen de tijd om in kweek te differentiëren. Na regelmatige vernieuwing van het medium worden de cellen getransduceerd met GFP-lentivirus, gekleurd met anti-GFP-antilichamen en gevisualiseerd. Ten slotte worden de culturen gefixeerd en worden de dendritische spines in beeld gebracht met behulp van confocale microscopie.

Uiteindelijk worden de beeldgegevens van menselijke dendritische spines in 3D gereconstrueerd voor hun classificatie en kwantificatie. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om glutamaterge neuronen van laag twee tot vier van de menselijke hersenschors te verkrijgen. Het omvat het gebruik van neurale stamcellen afgeleid van menselijke geïnduceerde prepotente stamcellen die afkomstig zijn van menselijke fibroblasten, gebaseerd op de eerder gepubliceerde methode.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van onze bestaande methoden is dat deze automatische segmentatie van DON rechts en PY in 3D mogelijk maakt. Dit gaat gepaard met een aanzienlijke tijdwinst ten opzichte van bestaande softwarepakketten, die doorgaans slechts 2D-analyses uitvoeren. De classificaties van donr en spy zijn daarnaast zeer praktisch en eenvoudig in gebruik.

Om neuronale culturen voor te bereiden, plaatst u glazen dekglasjes in zes-wells kweekschalen en voegt u poly-ornithine toe; incubeer dit overnacht in een laminaire flowkast. Was de volgende dag de dekglasjes drie keer met DPBS en voeg laminine toe; incubeer dit gedurende ten minste 10 uur in een laminaire flowkast. Bereid kweekmedium voor dat de volgende componenten bevat.

Gebruik vervolgens het medium om neurale stamcellen of NSCS uit te platen en te verspreiden met een dichtheid van 50 000 cellen per vierkante centimeter. Pipetteer met langzame draaiende bewegingen om celclustering te verminderen om menselijke iPSC-afgeleide neuronen te transduceren. Voeg in elke stap van de rijping één microliter van een stamoplossing die 40 nanogram GFP-lentiviraal vector per cultuurputje bevat toe aan vers cultuurmedium, en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C. Om de cellen voorbereiden voor immunofluorescentie, verwijder het cultuurmedium en gebruik 4% formaldehyde om de getransduceerde cellen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te fixeren.

Was de cellen vervolgens drie keer gedurende 10 minuten per keer met XPBS. Dompel de dekglasjes daarna onder in PBS aangevuld met 0,05% Triton X 110% paardenserum en incubeer dit gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de dekglasjes vervolgens drie keer met PBS.

Voeg aan elk dekglas 100 µL PBS met 4% paardenserum toe waarin het GFP-primaire antilichaam is verdund tot 1/1000. Incubeer gedurende de nacht bij 4 °C in een donkere box. Verdun vervolgens de Alexa Fluor 488-geconjugeerde antilichamen 1:200 in PBS met 0,5% Tween 20 en incubeer de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur met de antilichaamoplossing, nadat de objectglazen drie keer zijn gewassen met PBS.

Gebruik monteermedium om de objectglazen te monteren voor fluorescentiemicroscopie. Selecteer onder een confocale microscoop per conditie ten minste 10 gezonde neuronen met een piramidale morfologie en een gevouwen dendritische arborisatie om 60 tot 100 micrometers per dendriet te kwantificeren. Neem beelden op met een 40 x na, 1.3 olie-objectief en een 488 nanometer laser met een typisch piekvermogen op monsterniveau van rond de 20 micro watts; stel de pixelgrootte in op ongeveer 80 nanometers om de dendritische spines correct te samplen.

Om het volledige volume van het neuron te bemonsteren, wordt een Z-stapel vastgelegd met een Z-afstand van 150 tot 300 nanometer, wat resulteert in 20 tot 30 Z-doorsneden om een 3D-kwantificering van dendritische spines uit te voeren. Gebruik de volgende instellingen voor de analyse-software voor de voorbewerking. Pas Gaussische filtering toe door te kiezen voor beeldverwerking smoothing Gaussian filter.

Stel de filterbreedte gelijk aan de pixelgrootte in het XY-vlak om een semi-automatische tracering van dendrieten uit te voeren met de filament tracer-module. Gebruik in het tabblad 'slice' de afstandstool om de diameter van de dendriet te schatten. Klik vervolgens in het tabblad 'surpassed' op de filaments-tool en kies voor 'skip automatic creation' voor een betere robuustheid in het tabblad 'draw'.

Selecteer nu 'auto path' als methode, 'dendrite' als type en voer de geschatte diameter van de dendriet in. Gebruik de selectiemodus van de aanwijzer om de cursor in een vakje te veranderen, houd shift ingedrukt en klik met de rechtermuisknop op het startpunt van de dendriet. De software zal de initiële berekeningen uitvoeren.

Beweeg nu de aanwijzer vanaf het startpunt langs de dendriet. Er wordt een gele lijn getoond die het meest waarschijnlijke pad van de dendriet representeert. Druk op shift en links.

Klik in de module-interface op het dendrieteindpunt om automatische spine-segmentatie uit te voeren. Klik op het tabblad 'creation' in de drop-downlijst 'rebuild'. Kies 'rebuild dendrite diameter' en vink het vakje 'keep data' aan.

Klik vervolgens op rebuild. Stel de drempelwaarde zo in dat het gesegmenteerde volume overeenkomt met het werkelijke dendrietvolume. Selecteer als algoritme shortest distance from distance map.

Klik vervolgens op de knop 'volgende' onder het tabblad 'slice' en bepaal de kleinste doorn, de hoofddiameter en de maximale lengte. Voer daarna onder het tabblad 'surpass' de parameterwaarden in; waarden tussen 200 en 300 nanometers voor de minimale diameter en vier micrometers voor de maximale lengte zijn goede startpunten. Klik op de knop 'volgende' zonder het vakje 'allow spines' aan te vinken. Pas vervolgens de drempelwaarde voor de seed points aan, zodat de blauwe punten die de doorns vertegenwoordigen, gelokaliseerd zijn bij de werkelijke doornhoofden.

Klik vervolgens op next. De kernberekening wordt nu uitgevoerd en kan enige tijd in beslag nemen om de spines te classificeren. Klik onder het tabblad tools van de module-interface op classify spine. Na verificatie dat er vier klassen zijn zoals beschreven in het tekstprotocol, zal de module-interface vier nieuwe filament-objecten genereren met de resultaten van de classificatie.

Exporteer ten slotte de statistische gegevens onder het tabblad statistieken door te klikken op exporteer alle statistieken naar bestand. Deze figuur illustreert de kweek van menselijke neuronen gelabeld met een anti beta three tubuline antilichaam. De neiging tot celclustering is hier ook duidelijk zichtbaar.

Hier wordt een met GFP gelabeld parametaal neuron getoond, 40 dagen na differentiatie uit een late corticale progenitor. Afkomstig uit de oppervlakkige corticale lagen. De inzet toont een lagere vergroting met het zichtbare cellichaam.

Deze panelen tonen de 3D-reconstructie van segmenten van dendritische stekels in verschillende stadia van rijping. De kwantitatieve analyse van de stekeldichtheid en het volume van de stekelkop wordt hier weergegeven. Zoals verwacht nemen deze twee parameters toe gedurende de kweekperiode.

Bij het uitvoeren van de kweekprocedure is het belangrijk om de neurale stamcellen zeer zorgvuldig uit te platen en te verspreiden door de cellen langzaam toe te voegen met een rustige draaiende beweging om celklontering te verminderen. Deze methode vereist namelijk de identificatie van individuele neuronen.