Monitoring endoplasmatisch reticulum calciumhomeostase Met behulp van een

Het algemene doel van het volgende experiment is om de dysregulatie van calcium in het endoplasmatisch reticulum in de loop van de tijd te monitoren met behulp van een uitgescheiden reportereiwit. Dit wordt bereikt via virale vector-gemedieerde transgenese van het doelweefsel, specifiek de lever. In dit voorbeeld met de Gai luciferase circa reporter wordt een biologisch vloeistof, zoals bloed, verzameld om de hoeveelheid vrijgekomen circa uit het weefsel te meten; vervolgens wordt het luciferasesubstraat aan de plasmaproeven toegevoegd en wordt de luminescentie gemeten om de uitputting van calcium in het ER te bepalen.

De resultaten tonen ER-calciumdysregulatie aan, zoals blijkt uit verhoogde niveaus van plasma C camp. ER-homeostase kan over langere perioden worden gemonitord door herhaalde bemonstering van kleine volumes biologische vloeistoffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals calciumkleurstoffen met een lage affiniteit of genetisch gecodeerde calciumindicatoren, is dat de ER-calciumhomeostase in vivo over tijd kan worden gemonitord via een minimaal invasieve procedure. Er zijn twee therapeutische wegen voor deze techniek.

De eerste methode is het screenen naar geneesmiddelen die de calciumhomeostase in het ER kunnen behouden of kunnen herstellen naar een normale fysiologische toestand. De tweede benadering is het modificeren van therapeutische eiwitten tot therapeutische amps, waarbij secretie plaatsvindt als reactie op calciumdepletie in het ER. Deze methode kan inzicht bieden in de dysregulatie van calcium in het ER in de lever.

Het kan ook worden toegepast op andere orgaansystemen, zoals de hersenen, het hart, spieren of de pancreas. Nadat een sprat dolly rat is geanestheseerd volgens het tekstprotocol, brengt u oogzalf aan en voert u een staartknijptest uit om de anesthesie te verifiëren; scheer het gebied van de buik vanaf net onder de ribben tot aan de middenbuik en schrob het chirurgische gebied drie keer, waarbij u afwisselend Betadine en 70% ethanol gebruikt. Plaats de rat vervolgens in rugligging op een steriel chirurgisch vlak en dek deze af met steriele chirurgische doeken; verdun een a v gluc samp tot de door de gebruiker geoptimaliseerde concentratie.

In dit geval gebruikten we 7,6 × 10⁹ virale genomen per milliliter en mengden we dit door de buis te inverteren. Pipetteer vervolgens 105 µL van het verdunde AAV in een steriele schaal en gebruik een naald van 30 gauge om het virus in een spuit op te nemen. Markeer de beoogde incisielocatie om de lever bloot te leggen voor injectie met behulp van een scalpel.

Maak een horizontale incisie van ongeveer twee tot drie centimeter lang onder de ribbenkast. Voer een botte dissectie uit om het bindweefsel van de hypodermis te scheiden. Snijd door de buikspier om de rechter mediale lob van de lever bloot te leggen.

Plaats het dier vervolgens onder een chirurgische microscoop en stel deze zo in dat de rechter mediane leverlap in het gezichtsveld komt. Injecteer vervolgens met de spuit een derde van het totale virusvolume in drie plaatsen in het parenchym van de rechter mediane lap; laat de naald na injectie vijf tot 10 seconden in het weefsel zitten om de afgifte van het volledige injectievolume te garanderen. Hecht de buikspier en de incisie en breng Neosporin aan met een wattenstaafje. Plaats de rat in een herstelkamer totdat het bewustzijn is teruggekeerd en het dier in staat is een rechtopstaande positie aan te nemen, alvorens het dier terug te plaatsen in een individuele thuiskooi.

Vier tot zeven dagen na de injectie. Bereid de buisjes voor bloedafname voor door ze te labelen en vooraf te wegen. Voeg vervolgens 50 µL van 1000 units per milliliter heparine toe aan elk buisje.

Nadat de rat is geanestheseerd volgens het tekstprotocol, wordt een knijpprik in de staart uitgevoerd om de sedatie te verifiëren. Knip met een steriele schaar het uiteinde van de staart ongeveer één tot twee millimeter vanaf de punt af. Verzamel meer dan 100 µL bloed druppelgewijs in een buis die vooraf is gevuld met heparine om de bloeding te stoppen.

Gebruik een natte wattenstaaf om STIC-poeder op de staart aan te brengen. Gebruik een ethanol-doekje om de schaar af te nemen en steriliseer de kraal tussen de collecties door. Bewaar de bloedbuisjes bij vier graden Celsius.

Weg bij het verzamelen van opeenvolgende monsters de opvangbuisjes en pas de hoeveelheid heparine aan om een verhouding van twee op één tussen bloed en heparine te verkrijgen. Deze stap normaliseert de hoeveelheid heparine in elk monster. Centrifugeer de buisjes bij 2000 ×g en 4 °C gedurende vijf minuten.

Kopieer de plasmasupernatant naar een nieuwe buis en bewaar deze bij vier graden Celsius gedurende maximaal 72 uur of bij min 80 graden Celsius voor langdurige bewaring, om thaa garin als positieve controle toe te dienen voor de luciferase-assay. Verdun in ethanol tot een eindconcentratie van 2,5 milligram per milliliter. Injecteer vervolgens één milligram per kilogram intraperitoneaal in de onderbuik.

Neem het eerste bloedmonster 24 uur na injectie zoals hierboven beschreven. Om de luminescentie te meten, bereidt u het selen ezine-werksubstraat voor volgens het tekstprotocol en laat u dit 30 minuten incuberen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.

Ontdooi ondertussen alle monsters op ijs en breng 10 µL plasma over naar een plaat met ondoorzichtige wanden met behulp van een platenlezer die bioluminescentie kan monitoren en is uitgerust met een substraatinjector. Spoel de leidingen door met substraat. Injecteer 100 µL substraat in een well.

Schud gedurende vijf seconden op gemiddelde snelheid en meet de lichtemissie voor in vitro monsters. Integreer de lichtemissie gedurende 0,5 seconden voor de leesstap en voor in vivo monsters gedurende vijf seconden tijdens de leesstap om de calciumhomeostase van het ER te beoordelen. Met behulp van de Gluc SAR Camp-methode kunnen verschillende controles worden opgenomen, zoals een constitutief uitgescheiden reporter, in dit geval Gluc Noag.

Een toename van de extracellulaire spiegels van zowel GLUC SAR camp als Gluc noag als reactie op experimentele condities zou worden beschouwd als een ambigu resultaat. Echter, een toename in de secretie van gluc SAR camp zonder respons van gluc noag ondersteunt een ER-calciumafhankelijk event. Farmacologische modulatoren van de ER-calciumvoorraad kunnen worden gebruikt om de bijdrage van ER-calcium aan de SAR camp-afgifte in nieuwe paradigma's te bevestigen.

Zo is hier aangetoond dat dantrolene, een INE-receptorantagonist die ER-calcium stabiliseert, de afgifte van SAR camp remt als reactie op thic argon. Voor in vitro studies met gluc-gebaseerd SAR camp wordt de door de behandeling geïnduceerde respons het beste beoordeeld over het tijdsverloop. Door veranderingen in de relatieve respons binnen een plaat te volgen ten opzichte van controles, is het niet raadzaam om ruwe waarden over meerdere platen te vergelijken, aangezien degradatie van het substraat kan leiden tot veranderingen in de ruwe waarden. Voor in vivo studies moeten de gegevens onafhankelijk voor elk dier worden beoordeeld, waarbij elk dier dient als zijn eigen pretreatment-controle.

Dit is noodzakelijk om rekening te houden met de variabiliteit in de aflevering en expressie van het transgen tussen dieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u sircam-technologie kunt gebruiken om de calciumregulatie in het endoplasmatisch reticulum te onderzoeken in knaagdiermodellen van leverziekten. Vergeet niet dat het werken met virale vectoren uiterst gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen, bij het uitvoeren van deze procedure.