Hele netvlies Explantaten van kippenembryo's voor Elektroporatie en chemische reagens Behandelingen

Het algemene doel van deze procedure is om volledige retina-implantaten uit kiजemembryo's experimenteel te dissekeren, te manipuleren en te kweken. Dit wordt bereikt door eerst beide ogen van een kiजemembryo te verzamelen en deze in een Petrischaal te plaatsen. De tweede stap is het verwijderen van de sclera en het pigmentepitheel met behulp van fijne pincetten.

Vervolgens wordt het volledige retinaal explantaat onderworpen aan electroporatie van plasmide-DNA met platte cirkelvormige elektroden. De laatste stap is het incuberen van het retinaal explantaat in kweekmedium, in een 24-wells plaat in een incubator.

Uiteindelijk worden de volledige retina-implantaten gefixeerd, cryogesectioneerd en geanalyseerd via immunofluorescentiemicroscopie om de retina-neuronen te visualiseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals in ovo elektro-operaties, is dat deze snel is, eenvoudig uit te voeren en reproduceerbare resultaten garandeert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van de ontwikkeling van het centraal zenuwstelsel, zoals de vraag hoe de neurogenese wordt beïnvloed door specifieke chemische reagentia zoals enzymremmers of genproducten die zich na incubatie richten op de celcyclus.

Plaats eieren van de gewenste embryonale leeftijd in de laminaire flowkast en veeg de eierschalen af met 70% ethanol om contaminatie van het embryo te voorkomen. Tik de zijkant van het ei stevig tegen een hard oppervlak om het ei open te breken en plaats de inhoud vervolgens in een Petri-schaal van 100 millimeter. Gebruik een klein lepeltje om het embryo over te brengen naar een Petri-schaal van 35 millimeter met voorverwarmde PBS bij 37 °C om uitdroging van het weefsel te voorkomen.

Ontkop daarna het embryo en plaats de Petri-schaal van 35 millimeter met het embryonale weefsel onder een binoculaire stereomicroscoop in de laminaire flowkast. Gebruik een fijne pincet om een incisie door de mond ventraal van het oog te maken. Scheur, beginnend bij de incisielocatie, het weefsel rondom het gehele oog open.

Knel vervolgens de oogzenuw af en verwijder het intacte oog uit de oogkas. Neem zowel het linker- als het rechteroog van hetzelfde embryo om te gebruiken als respectievelijk het controle-oog of het behandelde oog. Gebruik een klein lepeltje en een fijne pincet om de ogen over te brengen naar een nieuwe Petri-schaal van 35 millimeter met voorverwarmde PBS.

Verwijder al het weefsel rondom het oog, inclusief de scleraal flap. Maak vervolgens een kleine incisie in het gepigmenteerde epitheel aan de dorsale zijde van het oog, waarbij u er zorg voor draagt dat het neurale retina niet wordt beschadigd. Scheur daarna het gepigmenteerde epitheel voorzichtig open, beginnend bij de plaats van de incisie.

Laat de lens en het volledige netvlies verbonden blijven met het glasvocht. Verwijder het pigmentepitheel, waarbij u voorzichtig te werk gaat langs het ciliaire lichaam rond de pupil in het anterieure deel van het oog, en langs de choroideus-spleet, aangezien verwijdering op deze locaties moeilijk is. Zet de elektro-unit aan en stel de spanning in op 15 volt voor een retina van stadium 20 tot 25, of op 20 volt voor een retina van stadium 26 tot 27.

Stel vervolgens de pulsherhalingen in op vijf pulsen van 50 milliseconden, met een pulslengte met intervallen van één seconde. Gebruik een pulsgenerator die met een voetpedaal op de vloer kan worden bediend, aangezien beide handen nodig zijn om de elektroden op hun plaats te houden. Sluit twee op maat gemaakte paddelvormige platina elektroden aan op de uitgangsaansluiting van de pulsgenerator.

De hier getoonde elektroden werden gemaakt van 0,1 millimeter platina plaatjes en de 0,8 millimeter verbindingsdraad was geïsoleerd. Breng met behulp van plastic buisjes het volledige retina-explantat voorzichtig over naar een vet met een polyethyleen Pasteur-pipet waarvan het uiteinde is afgesneden. Vermijd het gebruik van pipetpunten, omdat de retina de neiging heeft aan het plastic te hechten en te scheuren.

Gebruik vervolgens een pipette van 100 µL om voorzichtig alle PBS rondom het retina-explant te verwijderen. Let erop dat u de retina niet aanraakt om scheuren te voorkomen. Voeg 100 µL van de verdunde plasmide-oplossing toe aan de QVE en zorg ervoor dat het volledige retina-explant met de oplossing is bedekt.

Druk het retina-explant voorzichtig naar beneden met een pincet als het naar boven drijft. Gebruik pincet-elektroden om de lens zodanig te positioneren dat deze naar één zijde van het vete is gericht en richt de oogzenuw naar de bodem van het vete. Plaats vervolgens de positieve elektrode vóór de lens en de negatieve elektrode achter het retina zonder het weefsel aan te raken.

Breng de stroom aan door op het voetpedaal te drukken en controleer op bellen bij de elektroden, wat duidt op een succesvolle ontlading. Gebruik een 100 µL pipet om het volledige plasmidmengsel uit de qve te verwijderen zonder de retina te beschadigen. Het plasmidmengsel kan drie tot vijf keer worden hergebruikt na het verwijderen van het plasmid.

Vul de vete met voorverwarmde PBS. Gebruik een pincet om het retinaal explantaat voorzichtig los te maken van de wand van de vete. Gebruik vervolgens de polyethyleen pasteurpipet om het volledige retinaal explantaat over te brengen naar een 24-wells plaat die één milliliter voorverwarmd medium bevat.

Incubeer slechts één retinaal explantaat per putje in het medium. Incubeer het retinaal explantaat bij 37 °C en 5% CO2 op een rotator shaker met een constante snelheid van 50 RPM. De rotatie garandeert een maximale blootstelling aan het medium en voorkomt dat de retina aan de bodem van de 24-wells plaat hecht.

Na 24 uur kweken waren GFP-positieve cellen zichtbaar in een groot deel van het intacte netvlies, aangezien elektroporatie ertoe leidde dat een groot netvliesgebied het plasmide opnam en het reportergen tot expressie bracht. Na het maken van coupes waren individuele GFP-positieve cellen eenvoudig te detecteren langs de basale as van de ACO van het netvlies. Het volledige netvliesexplantaat kan nog ongeveer 24 uur langer worden gekweekt.

Incubatietijden kunnen leiden tot ontwikkelingsachterstand, morfologische malformaties, apoptose en uiteindelijk desintegratie van het netvlies. Een doorsnede van een volledig retinaal explantaat dat 24 uur is gekweekt, is immunogekleurd met fosfo-histon drie, hier weergegeven in het rode kanaal; fosfo-histon drie labelt cellen in de late G2-M-fase. De pH3-positieve cellen werden aangetroffen aan de apicale zijde van het netvlies, wat consistent is met een normale ontwikkeling van het netvlies.

Zoals hier wordt getoond, kan deze ontwikkeling worden geblokkeerd door de toevoeging van een CDK1/2-remmer; incubatie met de remmer gedurende vier uur voorafgaand aan de beeldvorming verminderde het aantal pH3-positieve cellen in het netvlies na de ontwikkeling significant. Deze techniek is succesvol gebruikt om gerapporteerde genexpressie vanuit nieuwe DNA-plasmiden te onderzoeken en om retina-explantaten te behandelen met chemische reagentia, waaronder regulatoren van de DNA-schade-route en de celcyclus. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals in vivo elektroporatie, worden uitgevoerd om de resultaten verder te bevestigen.