Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van proteopathische seeding-activiteit uit recombinante of biologische bronnen, waardoor de gevoelige detectie van eiwitten, aggregaten en monsters mogelijk wordt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurodegeneratie. Bijvoorbeeld: hoe kunnen we veranderingen in seeding-activiteit na therapeutische interventie in diermodellen van de ziekte kwantitatief evalueren?

De voordelen van deze techniek zijn onder meer de hoge specificiteit voor lage concentraties eiwitaggregaten, de uitstekende specificiteit, het gebruiksgemak en de hoge doorvoercapaciteit. Deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door mijzelf en co-auteur Brandon Holmes.

Om het biologische zaadmateriaal voor te bereiden, begint u met het wegen van bevroren hersenweefsel in een wegwerpbootje. Breng het weefsel vervolgens over in een conische buis, voeg ijskoude homogenisatiebuffer toe zodat de uiteindelijke oplossing een volumepercentage van 10% heeft, en breng de monsters over naar een koude kamer op ijs. Stel vervolgens een probe-indicator in op de juiste instellingen en spoel de zijkant en de onderkant van de probe af.

Spoel de indicatorpunt drie keer af zoals aangegeven, waarbij de probe tussen elke oplossing wordt afgeveegd. Wanneer de probe gereed is, dompel je de punt in de homogenisatiebuffer van één monster en start je de sonicatie door in totaal 25 pulsen toe te dienen. Wanneer het weefsel volledig in suspensie is, centrifugeer je het homogenisaat en breng je het supernatant over naar een schone buis.

Zorg ervoor dat het gehemelte niet wordt verstoord. Hoewel er talrijke andere homogenisatietechnieken beschikbaar zijn, is probatie superieur voor het isoleren van kleine hoeveelheden protio-pathogene zaden uit biologische monsters. De mechanische dissociatie maakt een consistente en efficiënte afbraak van weefsel en daaropvolgende extractie van zaden mogelijk.

Verdeel vervolgens het supernatant in aliquots en bewaar de lysaten bij -80 °C. Om de biosensorcellen onder steriele omstandigheden te herplaatsen, spoelt u elke cellijn met warme PBS, gevolgd door een incubatie van drie minuten met trypsine EDTA. Wanneer de cellen zijn losgelaten, stopt u de reactie met warm kweekmedium en brengt u de cellen onmiddellijk over naar een conische buis.

Centrifugeer de resuspendeerde cellen en resuspendeer de pellet in vers medium. Tel vervolgens de cellen en maak een mastermix-celverdunning van 3.500.000 cellen per 13 milliliter medium. Breng met een meerkanaals pipet langzaam 130 microliters van de cellen over in elke put van een platbodem 96-wells plaat die behandeld is voor weefselkweek, waarbij u er op let dat de pipetpunten in het midden van de putten worden geplaatst zonder de bodem van de plaat te raken.

Zodra de cellen zijn uitgeplaat, laat u ze 10 minuten ongestoord rusten bij kamertemperatuur en incubeert u de plaat vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2 en een relatieve vochtigheid van ≥ 80%. De volgende dag, wanneer de biosensorcellen 60 tot 65% confluent zijn, combineert u het serumarm medium, het liposoomreagens en de biologische zaadbron om transductiecomplexen te vormen. Pipetteer vervolgens 20 µL van het transductiecomplex langs de wand van elke individuele biosensorwell en plaats de behandelde cellen nogmaals 24 tot 48 uur in de incubator voordat u ze oogst.

Onbehandelde cellen zullen slechts diffuse fluorescentie vertonen. Echter, cellen die behandeld zijn met tau-seedmateriaal zullen heldere aggregaten vertonen. Om de cellen na één tot twee dagen te oogsten, vervangt u het celkweekmedium door 50 µL trypsine-EDTA om de reactie te stoppen. Na vijf minuten voegt u 150 µL gekoeld kweekmedium toe, brengt u de cellen onmiddellijk over naar een 96-wells plaat met ronde bodem en pellet u de cellen. Aspireer de supernatanten zonder de pellets te verstoren en resuspendeer de cellen vervolgens voorzichtig maar grondig in 50 µL 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.

Centrifuge de cellen vervolgens opnieuw en resuspendeer de pellets zo snel mogelijk in 200 µL gekoelde flowcytometrie-buffer. Laad na fixatie de plaat op een compatibele flowcytometer en genereer een plot van side scatter area versus forward scatter area per variant. Pas vervolgens, terwijl cellijn één wordt geanalyseerd, de voltages voor side scatter en forward scatter aan totdat de celpopulatie zich in het kwadrant linksonder bevindt.

Definieer vervolgens met de polygoontool de celpopulatie als gate P1. Maak nu een bivariant plot van forward scatter height versus forward scatter area en pas de P1-gate toe. Definieer daarna de enkelvoudige cellen als gate P2 en genereer van elk één histogram.

Pas voor de C-F-P-Y-F-P- en fret-filters gate P toe op twee tot drie verschillende histogrammen, waarvan elk één voor de C-F-P-Y-F-P- en fret-filters voor compensatie. Voeg 30 µL van de suspensie van cellijn één toe aan 200 µL van de suspensie van cellijn twee. Klik vervolgens op het pictogram voor instrumentinstellingen, gevolgd door het tabblad compensatie, en vink matrix aan om de compensatietabel te openen.

Genereer een plot van het FRET-oppervlak versus het CFP-oppervlak per variabele en pas poort P2 toe. Klik vervolgens, terwijl cellijn 1 en cellijn 2 worden uitgevoerd, op het kwadrant-icoon en teken kwadranten zodanig dat de fluorescentie-negatieve en -positieve populaties door de onderste twee kwadranten worden gescheiden. Maak nu een statistiekentabel die de mediane fluorescentie-intensiteit of MFI van FRET weergeeft voor de poorten LL3 en LR3, en pas de FRET-parameter in de compensatiematrix aan totdat de MFI van het FRET-signaal ongeveer gelijk is tussen LL3 en LR3.

Maak vervolgens een plot van de YFP-oppervlakte tegenover de CFP-oppervlakte met kwadranten. Pas de YFP-parameter in de compensatiematrix aan totdat de MFI van het YFP-signaal in de kwadranten ongeveer gelijk is, vergelijkbaar met wat eerder is getoond voor FRET-flowcytometrie.

De primaire fluorescentie-overlap vindt plaats door CFP dat wordt uitgezonden in het FRET-detectiekanaal, wat gecorrigeerd kan worden via fluorescentiecompensatie met behulp van enkelkleurige positieve controlecellen. Wanneer alle gates zijn ingesteld en het CFP-signaal is gecompenseerd, selecteert u de wells van belang en analyseert u de rest van de plaat om de gegevens te evalueren. Definieer eerst de cellen en enkelvoudige cellen met behulp van dezelfde parameters als we gebruiken voor het instellen van de flow-analyse.

Gebruik vervolgens cellijn drie om de YFP-enkelpositieve cellen uit te zetten in een plot van FRET versus YFP per variant. Teken een polygonale gate die langs en weg van de helling van de FRET-positieve celpopulatie loopt om een 'false FRET gate' te definiëren, die YFP-spillover in het FRET-filter uitsluit. Nadat de 'false FRET gate' op alle monsters is toegepast, worden de met lege liposomen behandelde CFP-YFP-cellen uitgezet in een plot van FRET versus CFP per variant en wordt er een polygonale gate geplaatst langs de helling van de populatie die zich naar boven en naar links weg van de populatie uitstrekt.

Alle gebeurtenissen die in deze gate vallen, worden beschouwd als fret-positief en het percentage cellen zal correleren met de gebruikte seed titer tijdens de behandeling. Noteer ten slotte de relevante analyseparameters, waaronder het percentage fret-positiviteit en de mediane fluorescentie-intensiteit van de fret-positieve cellen. Bereken vervolgens het product van het positiviteitspercentage en de MFI om de geïntegreerde fret-dichtheid handmatig te bepalen.

In de afwezigheid van tau-aggregaten of seeds wordt tau in een oplosbare monomerische toestand gehouden, wat wordt weergegeven door een consistent diffuus en FRET-negatief fluorescent signaal. Na de introductie van tau-seeds in de biosensorcellen wordt endogene tau omgezet in een geaggregeerde en FRET-positieve toestand via FRET-kwantificering. Flowcytometrie-analyse bevestigt vervolgens dat femtomolaire concentraties recombinant tau voldoende zijn voor detectie hier.

Hersenstamweefsel van tauopathie-muizen, geofferd op verschillende leeftijden, dient als representatieve hersenregio die een consistente detectie van seeding-activiteit bij de dieren aantoont vanaf een leeftijd van 1,5 maand. In dit experiment vertoonde hersenhomogenaat van proefpersonen met de ziekte van Alzheimer een robuuste seeding-activiteit, terwijl leeftijdsgenoten in de controlegroep en proefpersonen met de ziekte van Huntington dit niet deden, wat de assay-specificiteit voor tau-aggregaten aantoont. Onbehandelde primaire neuronale culturen, getransduceerd met tau-CFP- en tau-YFP-lentivirale constructen, vertoonden een diffuus fluorescent signaal na behandeling met recombinant tau-seeds.

Endogene tau vormt echter grote aggregaten die detecteerbaar zijn via fret flowcytometrie, zelfs in afwezigheid van liposoom-gemedieerde transductie. Wanneer zaadbronnen vooraf worden geïncubeerd met geneesmiddelen die de tau-opname remmen, zoals heparine, en worden behandeld in afwezigheid van liposomen, kan de zaadactiviteit in zowel recombinante fis als tauopathie-muizenhersenmonsters worden geblokkeerd. Eenmaal beheerst.

Deze techniek kan in drie dagen worden voltooid, waarbij elke dag slechts één tot twee uur aan benchwerk nodig is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat voor bepaalde stappen interne optimalisatie vereist zal zijn. Bijvoorbeeld bij het bepalen van effectieve titers van protio-pathogene zaden uit diverse biologische bronnen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u FRET-flowcytometrie-experimenten opzet, uitvoert en analyseert met als doel het detecteren van proteopathische seeding-activiteit uit recombinante en biologische bronnen.