Name: Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Leer een gevoelige FRET-flowcytometrie-assay voor het detecteren van proteopathische seeding-activiteit in recombinante en biologische monsters. Deze methode biedt hoge specificiteit voor lage niveaus eiwitaggregaten en is geschikt voor doorvoeronderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Tau Consortium (M.I.D); National Institutes of Health Grant 1R01NS071835 (M.I.D.), een Department of Defense Grant PT110816 (aan M.I.D.), 1F32NS087805 (aan J.L.F.), en 1F31NS079039 (aan B.B.H.).

NB: Dit protocol benadrukt het gebruik van FRET flowcytometrie voor het opsporen van zaaien activiteit van de muis biologische monsters. Het is ook compatibel met recombinant fibrillen en menselijke biologische monsters. Muizen euthanasie en hersenen oogsten werd uitgevoerd volgens IACUC-erkende procedures. 1. Brain Extraction <ol><li> Na diepe verdoving met isofluraan (2%), perfuseren een muis met ijskoude PBS met 0,03% heparine en extraheer de hersenen na de in Gage et al beschreven details. 18 </li><li> Plaats gewonnen weefsel in een cryo-flesje, en snap bevriezen door het plaatsen in vloeibare stikstof. Als alternatief bevriezen weefsel op droog ijs. Eenmaal bevroren, overdragen weefsel -80 ° C en opslag voor langere tijd, indien nodig. NB: Dit protocol is compatibel met hele hersenhomogenaten of micro-ontleed hersengebieden. Zie Hagihara et al. Voor een gedetailleerde micro-dissectie protocol 19. </li></ol&gt; 2. Voorbereiding van de Biologische Seed Materiaal <ol><li> Bereid homogenisatiebuffer door oplossen proteaseremmers (EDTA-vrije) in 1x TBS (1 tablet per 10 ml). Vortex krachtig, en op te slaan op het ijs. Proteaseremmers moet EDTA vrij om biosensor levensvatbaarheid van de cellen te behouden zijn. </li><li> Weeg bevroren hersenweefsel in een wegwerp wegen boot, en over te dragen aan een 5 ml conische buis. Add ijskoude homogenisatiebuffer, zodat de eindoplossing 10% gewicht / volume. Tijdelijk op te slaan op het ijs. Weefselmassa en daaropvolgende homogenisering buffer volume is afhankelijk van de grootte van de hersenen en / of gebieden gebruikt. Hier wordt een volwassen muis hemibrain gewicht 0,2 g gesuspendeerd in 2 ml van een 10% gew / vol oplossing. </li><li> Overdracht monsters in een koude kamer, en pas een sonde ultrasoonapparaat naar de juiste instellingen. Voor probe ultrasoonapparaat met Omni Ruptor (hier getoond), zet de AAN tot 20%, wat overeenkomt met ongeveer 75 W. Met een pulsmodus te verzekeren monsters niet over-verwarmd tijdens ultrasoonapparaat. Stel de pulser tot 30%, overeenkomend met ongeveer 500 msec. </li><li> Reinig het uiteinde van de sonde ultrasoonapparaat door spoelen met water, isopropanol en water weer afvegen van de sonde tussen elke oplossing. Wees er zeker van te spoelen en veeg zowel de zijkanten en onderkant van de sonde met een lab-doekjes. </li><li> Werken met één monster tegelijk onderdompelen sondetip in de homogenisatiebuffer en start de sonicator. Met behulp van de kracht en de pulser instellingen zoals hierboven beschreven, leveren 25 in totaal pulsen. Zorg ervoor dat het weefsel volledig in suspensie. Wees voorzichtig om schuimen van het monster tijdens deze stap te vermijden. Opmerking: De monsters zijn gevoelig voor schuimvorming indien a) het totale volume is laag of b) het homogenaat opwarmt. Met deze specifieke instrument, niet ultrasone trillingen met volumes van minder dan 250 pl. Om ervoor te zorgen monsters blijven gekoeld, kunnen buizen op ijs bewaard worden tijdens deze stap. </li><li> Reinig de sonde door weg te vegen resterende lysaat, dan levert 10 pulsen in een bekerglas of schoon water. Spoel de wanden en bodem van de sonde met water, isopropanol en water opnieuw (zoals bij stap 2,4), vegen drogen tussen elke stap. Om besmetting te voorkomen, spoel de sonde tussen de monsters. OPMERKING: tau aggregaten, we hebben niet gevonden dat strengere reiniging die nodig zijn voor het voorkomen van sample-to-sample besmetting zijn. Andere amyloids kunnen evenwel extra zorg die uitvoerig is beschreven in de literatuur 20,21 vereisen. </li><li> WINKEL homogenaten op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt. </li><li> Spin homogenaten bij 21.300 xg gedurende 15 min bij 4 ° C. </li><li> Breng de bovenstaande om een ​​schone buis, verzorgen de pellet te verstoren. Gooi de pellet. Aliquot de supernatant en opslag lysaten bij -80 ° C voor verder gebruik. Vermijd vries / ontdooi cycli van de homogenaten, echter, zoals dit vermindert zaaien efficiency. </li></ol> 3. replating Biosensor Cellen LET OP:Gebruik vier cellijnen voor deze test: HEK 293T (cellijn # 1), RD-P301S-GVB (cellijn 2 #), RD-P301S-YFP (cellijn 3 #) en RD-P301S-CFP / YFP ( cellijn # 4). Gelieve referentie Tabel 1 voor de bijdrage van elke cellijn aan de test. <ol><li> In een steriele omgeving, aspireren kweekmedium. Spoel cellen met warm PBS, en zuig. Trypsinize cellen (3 ml trypsine-EDTA (0,05%)) gedurende 3 min, blussen met warm kweekmedium (9 ml van DMEM, 10% FBS, 1% pen / strep, 1% GlutaMax) en direct cellen te dragen aan een conische buis. </li><li> Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Zuig medium en resuspendeer celpellet in warm kweekmedium. </li><li> Met behulp van een hemocytometer, bepalen de celdichtheid voor elke cellijn. Celdichtheid afhankelijk van samenvloeiing op het moment van oogsten en resuspensie volume. Resuspendeer cellen geoogst uit een 10 cm schaal bij 90% confluentie in 10 ml media, celdichtheid ongeveer 1 miljoen cellen / ml. </li><li> Makeneen master mix cellen + medium zodat elk putje van een 96 putjesplaat zullen 35.000 cellen in 130 gl medium bevatten (bijvoorbeeld om een master mix maken 100 putten, resuspendeer 3,5 miljoen cellen in 13 ml media). Wijzigen van het aantal cellen aan individuele experimentele ontwerpen en tijdlijnen passen. Voor celtherapie ~ 18 uur na plating, voeg 35.000 cellen per putje van een 96-wells plaat. </li><li> Met behulp van een multi-channel pipet langzaam pipet 130 pi master mix celsuspensie in elk putje van een vlakke bodem, weefselkweek behandelde 96 well plaat. Terwijl plating, plaatst de pipet tip in het midden van de put, niet de bodem van de plaat raken. OPMERKING: Hoewel plating formaat kan worden aangepast, zodat n = 4 putten voor elk van cellijnen 1-3 per plaat wordt aanbevolen. De rest van de plaat (n = 84) is gereserveerd voor cellijn # 4 (biosensor cellen). </li><li> Laat de cellen bezinken door de plaat ongestoord 10 min bij kamertemperatuur. Incubeer O / N bij 37 ° C, 5% CO 2 en &amp;# 8805; 80% relatieve vochtigheid. </li></ol> 4. Behandeling Cellen LET OP: De volgende dag, toen tau biosensor cellen 60-65% confluent, bereiden zaad transductie complexen als volgt: <ol><li> In één buis, combineer transfectie reagens, zoals Lipofectamine met verminderde serum media, zoals Opti-MEM, een master mix maken. Per putje, voeg 1,25 ul transfectiereagens en 8,75 pi verlaagde serum media. Flick buis voorzichtig mengen kort spin down en incubeer gedurende 5 min bij RT. </li><li> In een andere buis, combineer entmateriaal (aliquot lysaat uit stap 2.9) met verminderde serum media. OPMERKING: volume van entmateriaal zal variëren naar gelang van het experiment. Bij de keuze van het zaad volume, rekening houden met: overvloed van zaden in een monster en mogelijke toxiciteit. Ruwe homogenaten kan toxisch zijn voor cellen. Als zodanig, gebruikt u de laagst mogelijke volume op het gewenste effect te controleren. Eerder geteste volumes lysaat / goed bereik frOM 1-5 ul, overeenkomend met 5-20 ug totaal eiwit. Zorg ervoor dat het totale volume per putje (zaden + verlaagde serum media) is 10 pi. </li><li> Combineer de inhoud van de twee buizen van 4,1 en 4,2, flick beschreven voorzichtig mengen kort spin down (1000 xg, 5 sec) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten en maximaal 2 uur. </li><li> Voorzichtig pipet 20 ul van transductie complex aan de kant van individuele biosensor putjes. Gebruik drie technische herhalingen, indien mogelijk. Terugkeer behandelde cellen naar de incubator gedurende 24-48 uur. Incubeer onder dezelfde omstandigheden als beschreven in stap 3,6. LET OP: De juiste negatieve controle voorwaarde voor deze opstelling is biosensor cellen behandeld met lege liposomen (dwz, liposoom reagens + verlaagde serum media) vanwege de toepassing van fosfolipiden introduceert een lichte verschuiving in de fluorescentie profiel ten opzichte van cellen onbelicht aan liposoom reagens biosensor. </li></ol> 5. Oogsten Cellen voor FRET flowcytometrie <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; NB Voordat oogsten-cellen doorgaans 24-48 uur na de behandeling is het mogelijk om een ​​eerste uitlezing van zaaien activiteit te krijgen met de GFP filter op een standaard geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Cellen behandeld zonder zaad materiaal (dwz, lege liposomen) zal diffuse fluorescentie vertonen, terwijl de cellen behandeld met zaad materiaal intense punctata en reticulaire intracellulaire insluitsels (Figuur 1A - B) zal laten zien. <ol><li> Met behulp van een multi-channel pipet, zuig alle cel medium (150 pl). Trypsinize (50 gl) cellen gedurende 5 min, en blussen met 150 ul koud kweekmedium. Voeg geen PBS spoeling voorafgaand aan behandeling met trypsine bij deze stap, aangezien het mobiele heffen en daaropvolgende celverlies veroorzaken. Exclusief eventuele besmetting van dode cellen en puin tijdens flowcytometrie via gating strategieën. </li><li> Direct na afschrikken overdracht cellen aan een 96 putjes met ronde bodemplaat en centrifugeer bij 1000 g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig en gooi medium, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet. </li><li> Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 50 gl 2% paraformaldehyde, en incubeer 10 min. Als alternatief, lopen de cellen leven, hoewel fixatie levert schoner en consistente resultaten. </li><li> Centrifugeer cellen bij 1000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Aspireren en gooi paraformaldehyde, zorg om te voorkomen dat verstoring van de cel pellet. </li><li> Zacht, maar grondig, resuspendeer de celpellet in 200 ui gekoelde flowcytometrie buffer (HBSS, 1% FBS, 1 mM EDTA) en laat de plaat zo snel mogelijk naar cel klonteren te voorkomen. </li></ol> 6. FRET flowcytometrie OPMERKING: Gebruik een flowcytometer zoals MACSQuant VYB, die is uitgerust met FRET-compatibele laserlijnen en filtersets (tabel 2). Voor elke stap in deze sectie, klikt u op de put van belang het gebruik van 96 en sjabloon van de software, en klik op&quot;Spelen&quot; met sample opname en doorstroming te beginnen. Maak percelen of statistieken tafels door te klikken op het pictogram van de &#39;nieuwe analyse venster&#39;. Veranderen as parameters op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter. Naar cel populaties of fluorescentie signalen verplaatsen, vergroten of de spanningen in verband met de juiste filters te verlagen. Met dit instrument, lopen &lt;1000 events / sec om nauwkeurige eencellige toezicht te garanderen. <ol><li> Maak een Side Scatter-Area (SSC-A) versus Forward Scatter-Area (FSC-A) bivariate plot, en met cellijn # 1 draait, stel de SSC en FSC spanningen totdat de cel bevolking is in de linker kwadrant. Klik op de polygoon gereedschap en definiëren de cel populatie (Poort P1). Voor alle venstertijd parameters zie figuur 2. </li><li> Maak een FSC-H (hoogte) vs FSC-A bivariabelendiagram en toepassing Poort P1 op dit perceel door te klikken op &quot;live&quot; boven de plot, en het selecteren van P1. Met cellijn # 1hardlopen, klikt u op de polygoon gereedschap en definiëren enkele cellen (Poort P2). </li><li> Maak 3 histogram percelen, één voor elk van de filters van belang: GVB, YFP en FRET. Solliciteer Poort P2 om al deze percelen door te klikken op &quot;live&quot; boven de percelen, en het selecteren van P2. Met cellijn # 1 draait, passen spanningen zodanig dat de mediaan cel populatie in het GVB, YFP en FRET histogrammen zijn allemaal tussen 0 en 1. Om GVB en FRET meten, prikkelen cellen met de 405 nm laser, en capture fluorescentie met een 450/50 nm en 525/50 nm filter, respectievelijk. Om YFP meten, prikkelen cellen met een 488 nm laser en capture fluorescentie met een 525/50 nm filter. Laser en filterinstellingen worden verder beschreven in tabel 2. </li><li> Voeren compensatie voor GVB spillover in de FRET en YFP kanalen. OPMERKING: Compensatie is het proces van fluorescentie spillover correctie. Fluorescentie spillover treedt op wanneer de fluorescentie-emissie van een fluorochroom wordt gedetecteerd binnen een filter desibestaande situaties om het signaal te meten van een ander fluorochroom. Met de juiste vergoeding, kan het GVB spillover fluorescentie worden verwijderd uit de FRET en YFP kanalen. OPMERKING: Compensatie vereist de aanwezigheid van zowel de fluorescentie-positieve en -negatieve cellen. Dus, om te compenseren voor het GVB-positieve cellen (cellijn # 2), negatieve cellen (cellijn # 1) moet worden toegevoegd aan het monster voorafgaand aan de vlucht. <ol><li> Piek in 30 ul van cellijn # 1 ophanging van een enkele ver in 200 ul-cellijn # 2 schorsing onmiddellijk voorafgaand aan compensatie. </li><li> Klik op het pictogram &quot;Instrument Instellingen&quot;, vervolgens het tabblad &#39;compensatie&#39; en vink &#39;matrix&#39; om de vergoeding tafel te openen. </li><li> Maak een FRET-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Met cellijnen 1 + 2 draait, klik op het icoon &#39;kwadrant&#39; en trekken kwadranten zodanig dat de fluorescentie-negatieve en -positieve bevolkingsgroepen worden gescheiden door de onderste twee kwadranten (Gates LL3 eennd LR3, respectievelijk). </li><li> Maak een tabel met statistieken dat de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van FRET voor de LL3 en LR3 poorten weergeeft. Stel de parameter FRET in de vergoeding matrix tot de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen LL3 en LR3. Na deze stap, de MFI van het FRET signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de FRET kanaal. </li><li> Maak een YFP-A vs GVB-A bivariate plot, en poort P2 van toepassing, zoals beschreven in stap 6.3. Tekenen kwadranten (LL4 en LR4) gelijk aan die gedaan in stap 6.4.3. </li><li> Maak een tabel met statistieken dat de MFI van YFP geeft voor LL4 en LR4. Stel de parameter YFP in de vergoeding matrix tot de MFI van de YFP signaal is gelijk tussen LL4 en LR4. Na deze stap, de MFI van een YFP signaal is gelijk tussen ongekleurd cellen en CFP-positieve cellen, wat suggereert dat de afwezigheid van GVB spillover in de YFP kanaal. </li></ol></li><li> Follvanwege poort setup en compensatie, markeert putten van belang en lopen de rest van de plaat. </li><li> Nadat alle monsters zijn uitgevoerd, export data bestanden door te klikken &#39;bestand&#39;, dan &#39;copy&#39;. Selecteer het tabblad &#39;databestanden &quot;, markeert u de map experiment, en klik op&#39; copy &#39;. </li></ol> 7. Data Analysis OPMERKING: asparameters Change op individuele bivariate percelen door te klikken op de titel op zowel de X- of Y-as en het selecteren van de juiste filter. <ol><li> Open FCS bestanden in de flowcytometrie analyseprogramma. </li><li> Op basis van de scatter eigenschappen, gebruik dan een veelhoekige poort naar de cel populatie (SSC vs FSC) en singlet bevolking (FSC-H vs FSC-A) te definiëren van cellen behandeld met lege liposomen, vergelijkbaar met die in hoofdstuk 6 beschreven. </li><li> Als GVB compensatie werd uitgevoerd tijdens de installatie, niet verder GVB aan te passen. </li><li> Maak een FRET vs YFP bivariate plot. Met behulp van cellijn # 3Definieer een valse FRET poort door het tekenen van een veelhoekige poort die langs de helling van de FRET-positieve celpopulatie loopt. Deze poort sluit YFP single-positieve cellen die een signaal binnen het FRET filter uitzenden, en is soortgelijk aan die eerder getoond door verbieden et al getekend. 22 </li><li> Definieer een FRET poort door het plotten lege liposoom behandelde CFP / YFP cellen op een FRET vs GVB bivariate plot. Invoering van een veelhoekige poort langs de helling van de bevolking boven uitstrekt en weg van de populatie naar links. Moet deze poort de meeste cellen (~ 99%), uit te sluiten, zodat de achtergrond FRET is ≥1% van de cellen. Elke gebeurtenissen die verschuiven naar deze poort worden beschouwd als FRET-positief. OPMERKING: Elke individuele poort hierboven beschreven wordt toegepast op alle monsters vóór de aanleg van de volgende poorten. Volgende analyse worden vier afzonderlijke poorten gedefinieerd (Cell bevolking, singlet; valse FRET, FRET). </li><li> Record analyse parameters van belang, waaronder: procent FRET positiviteit en MFIFRET-positieve cellen. Handmatig berekenen van de geïntegreerde FRET dichtheid door het meten van het product van het percentage positiviteit en MFI. Opmerking: Als geïntegreerd FRET dichtheid wordt gebruikt als uitkomstmaat, set achtergrond FRET (zoals gedefinieerd in stap 7,5) en MFI groter dan of gelijk aan 1 om te voorkomen berekenen van een product dat minder dan de twee individuele factoren. </li></ol>

<ol><li>Seeley, W. W., Crawford, R. K., Zhou, J., Miller, B. L., Greicius, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+target+large-scale+human+brain+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases target large-scale human brain networks.</a> Neuron. 62 (1), 42-52 (2009).</li>
<li>Zhou, J., Gennatas, E. D., Efstathios, D., Kramer, J. H., Miller, B. L., Seeley, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+Regional+Neurodegeneration+from+the+Healthy+Brain+Functional+Connectome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Predicting Regional Neurodegeneration from the Healthy Brain Functional Connectome.</a> Neuron. 73 (6), 1216-1227 (2012).</li>
<li>Raj, A., Kuceyeski, A., Weiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Network+Diffusion+Model+of+Disease+Progression+in+Dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Network Diffusion Model of Disease Progression in Dementia.</a> Neuron. 73 (6), 1204-1215 (2012).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+of+Alzheimer%27s+disease-related+neurofibrillary+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Staging of Alzheimer's disease-related neurofibrillary changes.</a> Neurobiol Aging. 16 (3), 271-278 (1995).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (3), 155-159 (2009).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+protein+aggregate+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of protein aggregate propagation.</a> Current Opinion in Neurology. 25 (6), 721-726 (2012).</li>
<li>Kaufman, S. K., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+propagation+of+protein+aggregation+and+related+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Prion-like propagation of protein aggregation and related therapeutic strategies.</a> Neurotherapeutics. 10 (3), 371-382 (2013).</li>
<li>Holmes, B. B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+properties+of+Tau+protein%3A+the+importance+of+extracellular+Tau+as+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Prion-like properties of Tau protein: the importance of extracellular Tau as a therapeutic target.</a> J Biol Chem. 289 (29), 19855-19861 (2014).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+transmission+of+pathogenic+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell transmission of pathogenic proteins in neurodegenerative diseases.</a> Nat Med. 20 (2), 130-138 (2014).</li>
<li>Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+tau+misfolding+from+the+outside+to+the+inside+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell.</a> J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).</li>
<li>Guo, J. L., Lee, V. M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeding+of+normal+tau+by+pathological+tau+conformers+drives+pathogenesis+of+Alzheimer-like+tangles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seeding of normal tau by pathological tau conformers drives pathogenesis of Alzheimer-like tangles.</a> Journal of Biological Chemistry. , (2011).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+internalization+and+propagation+of+specific+proteopathic+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), E3138-E3147 (2013).</li>
<li>de Calignon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Tau+Pathology+in+a+Model+of+Early+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Propagation of Tau Pathology in a Model of Early Alzheimer's Disease.</a> Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-Synaptic+Spread+of+Tau+Pathology+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-Synaptic Spread of Tau Pathology In Vivo.</a> PLoS One. 7 (2), e31302(2012).</li>
<li>Holmes, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteopathic+tau+seeding+predicts+tauopathy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteopathic tau seeding predicts tauopathy in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), E4376-E4385 Forthcoming.</li>
<li>Yoshiyama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse+loss+and+microglial+activation+precede+tangles+in+a+P301S+tauopathy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model.</a> Neuron. 53 (3), 337-351 (2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. 65 (65), (2012).</li>
<li>Hagihara, H., Toyama, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+hippocampal+dentate+gyrus+from+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of hippocampal dentate gyrus from adult mouse.</a> J Vis Exp. (33), (2009).</li>
<li>Yan, Z. X., Stitz, L., Heeg, P., Pfaff, E., Roth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectivity+of+prion+protein+bound+to+stainless+steel+wires%3A+a+model+for+testing+decontamination+procedures+for+transmissible+spongiform+encephalopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Control+Hosp+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Infectivity of prion protein bound to stainless steel wires: a model for testing decontamination procedures for transmissible spongiform encephalopathies.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. 25 (4), 280-283 (2004).</li>
<li>McDonnell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning%2C+disinfection+and+sterilization+of+surface+prion+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Cleaning, disinfection and sterilization of surface prion contamination.</a> J Hosp Infect. 85 (4), 268-273 (2013).</li>
<li>Banning, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flow+cytometry-based+FRET+assay+to+identify+and+analyse+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A flow cytometry-based FRET assay to identify and analyse protein-protein interactions in living cells.</a> PLoS One. 5 (2), e9344(2010).</li>
<li>Morozova, O. A., March, Z. M., Robinson, A. S., Colby, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Features+of+Tau+Fibrils+from+Alzheimer%27s+Disease+Brain+Are+Faithfully+Propagated+by+Unmodified+Recombinant+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational Features of Tau Fibrils from Alzheimer's Disease Brain Are Faithfully Propagated by Unmodified Recombinant Protein.</a> Biochemistry. , (2013).</li>
<li>Sui, D., Liu, M., Kuo, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+aggregation+assays+using+hyperphosphorylated+tau+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein.</a> J Vis Exp. (95), e51537(2015).</li>
</ol>

Deze test is in licentie gegeven aan Janssen Pharmaceuticals.

De FRET flowcytometrie systeem hier beschreven is een krachtig hulpmiddel voor het snel en kwantitatief beoordelen van tau zaaien activiteit. Het vereist slechts een matige celkweek ervaring en een praktische kennis van FRET en flowcytometrie. Andere zaaien assays, zoals Thioflavine T - waarbij vertoont verbeterde fluorescentie indien gebonden aan beta sheet structuur - omslachtig en vereisen een zuivere, recombinant eiwit substraat. Bovendien zaaien in vitro assays voor tau slechts semi-kwantitatief en in het ...

De accumulatie van intracellulaire tau amyloids definieert tauopathieën zoals de ziekte van Alzheimer. In de vroege stadia ziekte pathologie is algemeen gelokaliseerd op discrete gebieden van de hersenen, maar met ziekteprogressie, pathologie onveranderlijk verspreidt zich over verschillende neurale netwerken 1-5. Accumuleren bewijs suggereert transcellulaire verspreiding van giftige eiwit aggregaten ten grondslag ligt aan deze pathologie (herzien in 10/06). In dit model worden proteopathic zaden (bv, tau) vrijgelaten uit de donorcellen en voer naburige cellen, transformeren inheemse tau-eiwit in de vorm misfolded via templated conformationele verandering 11-15. De hier beschreven bepaling werd ontwikkeld om dergelijke zaaien activiteit gevoelig detecteren. Het is compatibel met recombinant eiwit en biologische monsters en maakt kwantificering van minuut niveaus van proteopathic zaaien activiteit 16. HEK 293T-cellen die stabiel tot expressie tau herhaal domain (RD) met de ziekte- geassocieerde P301S mutatie gefuseerd aan ofwel CFP en YFP (hierna tau-RD-CFP / YFP cellen) dienen als stabiele biosensor van zaaien activiteit. Aangezien proteopathic zaden, de cellen behouden tau als een oplosbaar monomeer, en niet betekenisvol achtergrond FRET. Spontane opname of liposomen gemedieerde transductie van tau zaden in cellen, resulteert echter in RD-CFP en YFP RD-aggregatie, welk een FRET signaal dat wordt gemeten tussen enkele cellen via flowcytometrie produceert. Talrijke bestanddelen van deze test werden om de gevoeligheid verhogen en verlagen variabiliteit. Een monoklonaal cellijn met een 1: 1 RD-CFP / YFP expressie verhouding werd gekozen, omdat het optimale signaal: ruis. Om de gevoeligheid te verhogen, fosfolipiden worden gebruikt om zaden te voeren direct in cellen (hoewel biologische mechanismen te bestuderen van opname, kan deze worden weggelaten). Tenslotte flowcytometrie monitors FRET op populatieniveau en een enkele cel<html> level, in tegenstelling tot andere eiwitten aggregatie-assays. Het eindresultaat maatregel geïntegreerde FRET dichtheid sterk kwantitatief en neemt zowel het aantal cellen met aggregatie, en de mate waarin aggregatie heeft plaatsgevonden binnen elke cel. Al deze geoptimaliseerde parameters verhogen de gevoeligheid en reproduceerbaarheid te verzekeren. Dit systeem werd onlangs gebruikt in een uitgebreide studie in transgene muizen P301S tauopathie 17 dat de temporele ontstaan ​​en de progressie van tau zaaien activiteit ten opzichte van andere veelgebruikte tau pathologische markers (bijv, MC1, AT8, PG5 en ThioflavinS) geëvalueerd. Seeding activiteit veruit de oudste en meest robuuste marker van tau pathologie geëvalueerd voorafgaand histologische detectie tenminste 6 weken. Seeding activiteit verschijnt 1,5 maanden progressief toeneemt met de leeftijd, hetgeen een oorzakelijke rol proteopathic zaden in het ontstaan ​​en / of de progressie van neurodegeneratie 16. e_content &quot;&gt; Nauwkeurige kwantificering van minieme hoeveelheden entmateriaal uit biologische monsters studies progressie vroege ziekte te volgen te vergemakkelijken. Door verkorting proces duur en het mogelijk gebruik van jonge dieren, kan dit de efficiëntie en nauwkeurigheid van preklinische dierproeven verhogen. Bijvoorbeeld, in de P301S muis eerder beschreven, kan loodverbindingen zoals geleverd reeds 4-6 weken (onmiddellijk voor of bij het begin van zaaien activiteit) en gecontroleerd op werkzaamheid 2-4 weken later. De test dient nauwkeurig verminderingen van zaaien kwantificeren activiteit. FRET doorstroomcytometrie is in vitro screening toepassingen. Bijvoorbeeld, anti-tau reagentia (bijvoorbeeld antilichamen, kleine moleculen, etc.) kan snel worden getest op hun vermogen te blokkeren zaaien inductie direct in kweek met behulp van recombinant tau aggregaten of hersenen afgeleide lysaten als kiem bron (figuur 5). Bij deze opstelling, wanneer entmateriaal bereid afperiment duurt slechts drie dagen in beslag, met inbegrip van data-analyse. De snelle kwantificering van proteopathic zaaien activiteit kan aldus veel studies van neurodegeneratie vergemakkelijken.

<table><tbody><tr><td>TBS</td><td>Sigma</td><td>T5912</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitors (EDTA-vrij)</td><td>Roche</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-vials</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Analytische Weegschaal</td><td>Mettler Toledo</td><td>XSE 105DU</td><td></td></tr><tr><td>Weegboten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-743</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conische buis</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0501</td><td></td></tr><tr><td>Omni Sonic Ruptor Ultrasoon Homogenisator</td><td>Omni International</td><td>18-000-115</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Tip voor Ultrasoon Homogenisator</td><td>Omni International</td><td>OR-T-156</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td></td></tr><tr><td>Gerooiselverminderende Oordoppen</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-145-412</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47299</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml buisjes</td><td>USA Scientific</td><td><a href="http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-sterile.aspx">1615-5510</a></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.215</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal Runderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conische buizen</td><td>Phenix Research</td><td>SS-PH15</td><td></td></tr><tr><td>25 ml reagent reservoirs</td><td>VWR</td><td>41428-954</td><td></td></tr><tr><td>Multikanaals pipetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>TI13-690-049</td><td></td></tr><tr><td>96 welplattebodemplatten</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>96 welrondebodemplatten</td><td>Corning</td><td>3788</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 40 Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004509</td><td></td></tr><tr><td>BIOLiner Zwenkbare Emmerrotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003796</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>VWR</td><td>15170-172</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant VYB Flow Cytomter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-116</td><td></td></tr><tr><td>Chill 96 Rack</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-459</td><td></td></tr><tr><td>Flow Jo analysesoftware</td><td>Flow Jo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &mu;l pipettenpunten</td><td>Rainin</td><td>GPS-L10</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pipettenpunten</td><td>Rainin</td><td>GPS-250</td><td></td></tr><tr><td>1 ml pipettenpunten</td><td>Rainin</td><td>GPS-1000</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu;l pipettenpunten</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1800</td><td></td></tr><tr><td>5 ml serologische pijp</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-606180</td><td></td></tr><tr><td>10 ml serologische pijp</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-607180</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serologische pijp</td><td>Phenix Research</td><td>SPG-760180</td><td></td></tr></tbody></table>

gevoelige detectie van proteopathic zaaien activiteit met fret flowcytometrie

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Steeds meer bewijs ondersteunt transcellulair voortplanting van toxische eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, als een mechanisme voor de initiatie en progressie van pathologie in verschillende neurodegeneratieve ziekten, inclusief de ziekte van Alzheimer en de gerelateerde tauopathieën. De mogelijk cruciale rol van tau-zaden in de progressie van de ziekte ondersteunt sterk de noodzaak van een gevoelige test die gemakkelijk seeding-activiteit detecteert in biologische monsters. 
Door de specificiteit van fluorescentie resonantie energieoverdracht (FRET), de gevoeligheid van flowcytometrie en de stabiliteit van een monoklonale cellijn te combineren, is een ultragevoelige seeding-test ontwikkeld die compatibel is met zaaddetectie van recombinante of biologische monsters, inclusief menselijke en muis hersenhomogenaten. De test gebruikt monoklonale HEK 293T cellen die stabiel de aggregatiegevoelige herhalingsdomein (RD) van tau tot expressie brengen, dat de ziekte-geassocieerde P301S mutatie bevat, gefuseerd met ofwel CFP of YFP, die een FRET signaal produceren bij eiwitaggregatie. De opname van proteopathische tau-zaden (maar niet andere eiwitten) in de biosensorcellen stimuleert aggregatie van RD-CFP en RD-YFP, en flowcytometrie bewaakt gevoelig en kwantitatief deze aggregatie-geïnduceerde FRET. De test detecteert femtomolare concentraties (monomeer equivalent) van recombinante tau-zaden, heeft een dynamisch bereik van drie ordes van grootte en is compatibel met hersenhomogenaten van tauopathie transgene muizen en menselijke tauopathie subjecten. Met lichte aanpassingen kan de test ook seeding-activiteit van andere proteopathische zaden detecteren, zoals α-synucleïne, en is ook compatibel met primaire neuronale culturen. De gemakkelijkheid, gevoeligheid en brede toepasbaarheid van FRET flowcytometrie maakt het nuttig om een breed scala aan eiwitaggregatiestoaornissen te bestuderen.

FRET flowcytometrie maakt gevoelige kwantitatieve en snelle detectie van zaaien activiteit uit recombinante of biologische monsters. Assay opstelling is facile: monoklonaal afgeleide stabiele cellijnen die tau-RD-CFP / YFP zijn getransduceerd met entmateriaal gedurende 24-48 uur, en onderworpen aan flowcytometrie-analyse (Figuur 1A). Bij afwezigheid van zaden, biosensor cellen handhaven tau in een oplosbare, monomere vorm (Figuur 1B). In aanwezigheid van kiemen echter biosensor cellen o...

De overdracht van eiwitaggregaten, of proteopathische zaden, van cel tot cel kan ten grondslag liggen aan de progressie van pathologie in neurodegeneratieve ziekten. Hier wordt een nieuwe FRET-flowcytometrische assay beschreven die een specifieke en gevoelige detectie van zaaiactiviteit uit recombinante of biologische monsters mogelijk maakt.

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Het algemene doel van deze procedure is het detecteren van proteopathische seeding-activiteit uit recombinante of biologische bronnen, waardoor de gevoelige detectie van eiwitten, aggregaten en monsters mogelijk wordt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van neurodegeneratie. Bijvoorbeeld: hoe kunnen we veranderingen in seeding-activiteit na therapeutische interventie in diermodellen van de ziekte kwantitatief evalueren?De voordelen van deze techniek zijn onder meer de hoge specificiteit voor lage concentraties eiwitaggregaten, de uitstekende specificiteit, het gebruiksgemak en de hoge doorvoercapaciteit. Deze procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door mijzelf en co-auteur Brandon Holmes.Om het biologische zaadmateriaal voor te bereiden, begint u met het wegen van bevroren hersenweefsel in een wegwerpbootje. Breng het weefsel vervolgens over in een conische buis, voeg ijskoude homogenisatiebuffer toe zodat de uiteindelijke oplossing een volumepercentage van 10% heeft, en breng de monsters over naar een koude kamer op ijs. Stel vervolgens een probe-indicator in op de juiste instellingen en spoel de zijkant en de onderkant van de probe af.Spoel de indicatorpunt drie keer af zoals aangegeven, waarbij de probe tussen elke oplossing wordt afgeveegd. Wanneer de probe gereed is, dompel je de punt in de homogenisatiebuffer van één monster en start je de sonicatie door in totaal 25 pulsen toe te dienen. Wanneer het weefsel volledig in suspensie is, centrifugeer je het homogenisaat en breng je het supernatant over naar een schone buis.Zorg ervoor dat het gehemelte niet wordt verstoord. Hoewel er talrijke andere homogenisatietechnieken beschikbaar zijn, is probatie superieur voor het isoleren van kleine hoeveelheden protio-pathogene zaden uit biologische monsters. De mechanische dissociatie maakt een consistente en efficiënte afbraak van weefsel en daaropvolgende extractie van zaden mogelijk. Verdeel vervolgens het supernatant in aliquots en bewaar de lysaten bij -80 °C. Om de biosensorcellen onder steriele omstandigheden te herplaatsen, spoelt u elke cellijn met warme PBS, gevolgd door een incubatie van drie minuten met trypsine EDTA. Wanneer de cellen zijn losgelaten, stopt u de reactie met warm kweekmedium en brengt u de cellen onmiddellijk over naar een conische buis.Centrifugeer de resuspendeerde cellen en resuspendeer de pellet in vers medium. Tel vervolgens de cellen en maak een mastermix-celverdunning van 3.500.000 cellen per 13 milliliter medium. Breng met een meerkanaals pipet langzaam 130 microliters van de cellen over in elke put van een platbodem 96-wells plaat die behandeld is voor weefselkweek, waarbij u er op let dat de pipetpunten in het midden van de putten worden geplaatst zonder de bodem van de plaat te raken.Zodra de cellen zijn uitgeplaat, laat u ze 10 minuten ongestoord rusten bij kamertemperatuur en incubeert u de plaat vervolgens gedurende de nacht bij 37 °C, 5% CO2 en een relatieve vochtigheid van ≥ 80%. De volgende dag, wanneer de biosensorcellen 60 tot 65% confluent zijn, combineert u het serumarm medium, het liposoomreagens en de biologische zaadbron om transductiecomplexen te vormen. Pipetteer vervolgens 20 µL van het transductiecomplex langs de wand van elke individuele biosensorwell en plaats de behandelde cellen nogmaals 24 tot 48 uur in de incubator voordat u ze oogst.Onbehandelde cellen zullen slechts diffuse fluorescentie vertonen. Echter, cellen die behandeld zijn met tau-seedmateriaal zullen heldere aggregaten vertonen. Om de cellen na één tot twee dagen te oogsten, vervangt u het celkweekmedium door 50 µL trypsine-EDTA om de reactie te stoppen. Na vijf minuten voegt u 150 µL gekoeld kweekmedium toe, brengt u de cellen onmiddellijk over naar een 96-wells plaat met ronde bodem en pellet u de cellen. Aspireer de supernatanten zonder de pellets te verstoren en resuspendeer de cellen vervolgens voorzichtig maar grondig in 50 µL 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.Centrifuge de cellen vervolgens opnieuw en resuspendeer de pellets zo snel mogelijk in 200 µL gekoelde flowcytometrie-buffer. Laad na fixatie de plaat op een compatibele flowcytometer en genereer een plot van side scatter area versus forward scatter area per variant. Pas vervolgens, terwijl cellijn één wordt geanalyseerd, de voltages voor side scatter en forward scatter aan totdat de celpopulatie zich in het kwadrant linksonder bevindt.Definieer vervolgens met de polygoontool de celpopulatie als gate P1. Maak nu een bivariant plot van forward scatter height versus forward scatter area en pas de P1-gate toe. Definieer daarna de enkelvoudige cellen als gate P2 en genereer van elk één histogram.Pas voor de C-F-P-Y-F-P- en fret-filters gate P toe op twee tot drie verschillende histogrammen, waarvan elk één voor de C-F-P-Y-F-P- en fret-filters voor compensatie. Voeg 30 µL van de suspensie van cellijn één toe aan 200 µL van de suspensie van cellijn twee. Klik vervolgens op het pictogram voor instrumentinstellingen, gevolgd door het tabblad compensatie, en vink matrix aan om de compensatietabel te openen.Genereer een plot van het FRET-oppervlak versus het CFP-oppervlak per variabele en pas poort P2 toe. Klik vervolgens, terwijl cellijn 1 en cellijn 2 worden uitgevoerd, op het kwadrant-icoon en teken kwadranten zodanig dat de fluorescentie-negatieve en -positieve populaties door de onderste twee kwadranten worden gescheiden. Maak nu een statistiekentabel die de mediane fluorescentie-intensiteit of MFI van FRET weergeeft voor de poorten LL3 en LR3, en pas de FRET-parameter in de compensatiematrix aan totdat de MFI van het FRET-signaal ongeveer gelijk is tussen LL3 en LR3.Maak vervolgens een plot van de YFP-oppervlakte tegenover de CFP-oppervlakte met kwadranten. Pas de YFP-parameter in de compensatiematrix aan totdat de MFI van het YFP-signaal in de kwadranten ongeveer gelijk is, vergelijkbaar met wat eerder is getoond voor FRET-flowcytometrie.De primaire fluorescentie-overlap vindt plaats door CFP dat wordt uitgezonden in het FRET-detectiekanaal, wat gecorrigeerd kan worden via fluorescentiecompensatie met behulp van enkelkleurige positieve controlecellen. Wanneer alle gates zijn ingesteld en het CFP-signaal is gecompenseerd, selecteert u de wells van belang en analyseert u de rest van de plaat om de gegevens te evalueren. Definieer eerst de cellen en enkelvoudige cellen met behulp van dezelfde parameters als we gebruiken voor het instellen van de flow-analyse.Gebruik vervolgens cellijn drie om de YFP-enkelpositieve cellen uit te zetten in een plot van FRET versus YFP per variant. Teken een polygonale gate die langs en weg van de helling van de FRET-positieve celpopulatie loopt om een 'false FRET gate' te definiëren, die YFP-spillover in het FRET-filter uitsluit. Nadat de 'false FRET gate' op alle monsters is toegepast, worden de met lege liposomen behandelde CFP-YFP-cellen uitgezet in een plot van FRET versus CFP per variant en wordt er een polygonale gate geplaatst langs de helling van de populatie die zich naar boven en naar links weg van de populatie uitstrekt.Alle gebeurtenissen die in deze gate vallen, worden beschouwd als fret-positief en het percentage cellen zal correleren met de gebruikte seed titer tijdens de behandeling. Noteer ten slotte de relevante analyseparameters, waaronder het percentage fret-positiviteit en de mediane fluorescentie-intensiteit van de fret-positieve cellen. Bereken vervolgens het product van het positiviteitspercentage en de MFI om de geïntegreerde fret-dichtheid handmatig te bepalen.In de afwezigheid van tau-aggregaten of seeds wordt tau in een oplosbare monomerische toestand gehouden, wat wordt weergegeven door een consistent diffuus en FRET-negatief fluorescent signaal. Na de introductie van tau-seeds in de biosensorcellen wordt endogene tau omgezet in een geaggregeerde en FRET-positieve toestand via FRET-kwantificering. Flowcytometrie-analyse bevestigt vervolgens dat femtomolaire concentraties recombinant tau voldoende zijn voor detectie hier.Hersenstamweefsel van tauopathie-muizen, geofferd op verschillende leeftijden, dient als representatieve hersenregio die een consistente detectie van seeding-activiteit bij de dieren aantoont vanaf een leeftijd van 1,5 maand. In dit experiment vertoonde hersenhomogenaat van proefpersonen met de ziekte van Alzheimer een robuuste seeding-activiteit, terwijl leeftijdsgenoten in de controlegroep en proefpersonen met de ziekte van Huntington dit niet deden, wat de assay-specificiteit voor tau-aggregaten aantoont. Onbehandelde primaire neuronale culturen, getransduceerd met tau-CFP- en tau-YFP-lentivirale constructen, vertoonden een diffuus fluorescent signaal na behandeling met recombinant tau-seeds.Endogene tau vormt echter grote aggregaten die detecteerbaar zijn via fret flowcytometrie, zelfs in afwezigheid van liposoom-gemedieerde transductie. Wanneer zaadbronnen vooraf worden geïncubeerd met geneesmiddelen die de tau-opname remmen, zoals heparine, en worden behandeld in afwezigheid van liposomen, kan de zaadactiviteit in zowel recombinante fis als tauopathie-muizenhersenmonsters worden geblokkeerd. Eenmaal beheerst.Deze techniek kan in drie dagen worden voltooid, waarbij elke dag slechts één tot twee uur aan benchwerk nodig is. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat voor bepaalde stappen interne optimalisatie vereist zal zijn. Bijvoorbeeld bij het bepalen van effectieve titers van protio-pathogene zaden uit diverse biologische bronnen.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u FRET-flowcytometrie-experimenten opzet, uitvoert en analyseert met als doel het detecteren van proteopathische seeding-activiteit uit recombinante en biologische bronnen.

sensitive-detection-proteopathic-seeding-activity-with-fret-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Het IP-FCM methode is gepresenteerd, die een gevoelige, robuust, biochemische evaluatie van de natieve eiwit-eiwit interacties mogelijk maakt, zonder dat genetische manipulatie of grote steekproeven.

IP-FCM: Immunoprecipitatie gedetecteerd door middel van flowcytometrie

The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

The video demonstrates a fluorescence resonance energy transfer (FRET) flow cytometry assay to detect the seeding activity of protein aggregates isolated from biological samples. Mammalian cells expressing tau reporter proteins are incubated with liposome transduction complexes containing tau seeds. These seeds mediate the aggregation of the reporter proteins, leading to generating a FRET positive signal in the flow cytometer.

A FRET Flow Cytometry Technique to Detect Tau-Seed Induced Reporter Protein Aggregation

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Veel verschillende methoden bestaan ​​voor de meting van extracellulaire blaasjes (EV) met flowcytometrie (FCM). Verschillende aspecten moeten worden overwogen bij het bepalen van de meest geschikte methode om te gebruiken. Twee protocollen voor het meten van EV's worden gepresenteerd, met behulp van individuele detectie of een kraal-gebaseerde benadering.

Technieken voor de Analyse van de extracellulaire blaasjes Met behulp van flowcytometrie

Terwijl infiltrerende macrofagen continu worden aangeworven op volwassen weefsels uit circulerende precursoren, zitten inwendige macrofagen hun weefsel tijdens ontwikkeling, waar ze worden gehandhaafd zonder verdere input van stamvaders. De voorlopers voor ingezette macrofagen werden recent geïdentificeerd. Hier presenteren wij methoden voor de genetische lotvorming van de ingezeten makrofage stamvaders.

Identificatie van Erythromyeloid Progenitors En Hun Nakomelingen In De Muis Embryo Door Flow Cytometry

Gepresenteerd hier is een protocol voor het meten van prolifererende CD4+ T cellen in reactie op antigene eiwitten of peptiden met behulp van kleurstof verdunning. Deze bepaling is bijzonder gevoelig voor zeldzame antigeen-specifieke T-cellen en kan worden gewijzigd om het klonen van antigeen-specifieke cellen te vergemakkelijken.

Kwantificering van prolifererende humane antigeen-specifieke CD4+ T-cellen met behulp van Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester

Dit artikel beschrijft een FRET-based flow cytometrie protocol voor het kwantificeren van eiwit zelf montage in zowel S. cerevisiae en HEK293T cellen.

Opsporen en karakteriseren van zelf-assemblage van eiwitten in vivo door flow Cytometrie

Een noodzakelijke stap in de ontwikkeling van aptameren tegen kanker is om de binding aan het doelwit te testen. We demonstreren een flowcytometrische test om deze binding te bestuderen, waarbij we het belang benadrukken van het opnemen van een negatieve controle aptamer en kankercellen die positief of negatief zijn voor dat specifieke eiwit.

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde, high-throughput screeningsmethode om geneesmiddelen met kleine moleculen te identificeren die de activering van β2-integrine op menselijke neutrofielen remmen.

Een op flowcytometrie gebaseerde high-throughput techniek voor het screenen van integrineremmende geneesmiddelen

Hier wordt een op fosfoflowcytometrie gebaseerde methode beschreven om de signalering stroomafwaarts van de mTORC1-, JAK/STAT5- en MAPK-routes te analyseren in acute menselijke myeloïde leukemiecellen die xenotransplanteerd zijn in muizen en verkregen uit beenmergaspiraten. p-STAT5-, p-4EBP1-, p-RPS6- en p-ERK1/2-niveaus worden tegelijkertijd gemeten met behulp van een spectrale flowcytometer van de volgende generatie met hoge gevoeligheid.

Intracellulaire fosfoflowcytometrie van acute myeloïde leukemie Patiënt-afgeleide xenotransplantaties

Leer een gevoelige FRET-flowcytometrie-assay voor het detecteren van proteopathische seeding-activiteit in recombinante en biologische monsters. Deze methode biedt hoge specificiteit voor lage niveaus eiwitaggregaten en is geschikt voor doorvoeronderzoek naar neurodegeneratieve ziekten.

Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Meer video's verkennen