Gevoelige detectie van Proteopathic Zaaien activiteit met FRET flowcytometrie

Het algemene doel van deze procedure is om protio pathische zaaiactiefheid van recombinante of biologische bronnen te detecteren, waardoor de gevoelige detectie van eiwitten, aggregaten en een monster mogelijk wordt. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van neurodegeneratie te beantwoorden. Hoe kunnen we bijvoorbeeld kwantitatief evalueren veranderingen in zaaiactiefheid na therapeutische interventie in diermodellen van ziekten?

De voordelen van deze techniek zijn de hoge specificiteit voor lage niveaus van eiwitaggregaten. De uitmuntende specificiteit, de eenvoud van gebruik en de hoge doorvoer. Het demonstreren van deze procedure zal vandaag worden uitgevoerd door mijzelf, samen met co-auteur Brandon Holmes.

Om het biologische zaadmateriaal voor te bereiden, begint u met het wegen van bevroren hersenweefsel in een wegwerpboterbootje. Breng vervolgens het weefsel over in een conische buis, voeg ijskoud homogenisatiebuffer toe, zodat de uiteindelijke oplossing 10% van het volume is, en breng de monsters over naar een koude kamer op ijs. Pas vervolgens een sonde aan zodat de indicator op de juiste instellingen staat en spoel de zij- en bodemkant van de sonde schoon.

Doe de indicatortip drie keer aan zoals aangegeven, en veeg de sonde af tussen elke oplossing. Wanneer de sonde klaar is, dompelt u de punt in het homogenisatiebuffer van één monster en start u het soniceren door 25 totaal pulsen te leveren. Wanneer het weefsel volledig in suspensie is, centrifugeert u het homogenaat en brengt u het supernatant over naar een schone buis.

Zorg ervoor dat u het gehemelte niet verstoort. Hoewel er tal van andere homogenisatietechnieken beschikbaar zijn, is sonderen superieur voor het isoleren van kleine hoeveelheden protio pathische zaden uit biologische monsters. De mechanische dissociatie maakt een consistente en efficiënte afbraak van weefsel en daaropvolgende zaadextractie mogelijk.

Vervolgens verdeelt u het supernatant en bewaart u de lysaten bij min 80 graden Celsius. Om de biosensorcellen onder steriele omstandigheden terug te spelen, spoelt u elke cellijn met warm PBS en voert u een drie minuten durende incubatie met trypsine EDTA uit. Wanneer de cellen loslaten, stopt u de reactie met warm kweekmedium en brengt u de cellen onmiddellijk over naar een conische buis.

Centrifugeer de cellen opnieuw en suspendeer het pellet in vers medium. Tel vervolgens de cellen en maak een mastermix van celverdunning van 3.500.000 cellen per 13 milliliter medium. Gebruik een multikanaals pipet om langzaam 130 microliter van de cellen in elk putje van een platte bodem 96-welplaat met weefselkweekbehandeling over te brengen, waarbij u ervoor zorgt dat de pipettips in het midden van de putjes worden geplaatst zonder de bodem van de plaat aan te raken.

Laat de cellen eenmaal geplaatst is, gedurende 10 minuten ongestoord op kamertemperatuur bezinken en incubeer vervolgens de plaat een nacht bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en minimaal 80% relatieve vochtigheid. De volgende dag, wanneer de biosensorcellen 60 tot 65% confluent zijn, combineert u gereduceerd serum medium liposoomreagens en biologische zaadbron om transductiecomplexen te maken. Gebruik vervolgens een pipet om 20 microliter van het transductiecomplex langs de zijkant van elke individuele biosensorput te pipetten en breng de behandelde cellen terug naar de incubator voor nog eens 24 tot 48 uur voordat u gaat oogsten.

Onbehandelde cellen zullen alleen diffuse fluorescentie vertonen. Cellen die zijn behandeld met tau zaadmateriaal, zullen echter heldere aggregaten vertonen. Na één tot twee dagen om de cellen te oogsten, vervangt u het celkweekmedium door 50 microliter trypsine EDTA om de reactie te stoppen. Na vijf minuten met 150 microliter gekoeld kweekmedium, brengt u de cellen onmiddellijk over naar een 96-welplaat met ronde bodem en pellet de cellen, aspireert u de S-supernaten zonder de pellets te verstoren, en suspendeert u de cellen vervolgens voorzichtig maar grondig opnieuw in 50 microliter 2% paraformaldehyde gedurende 10 minuten.

Centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw en suspendeer de pellets zo snel mogelijk in 200 microliter gekoeld flowcytometriebuffer. Laad na fixatie de plaat op een fret-compatibele flowcytometer en genereer een zijwaartse verstrooiingsgebied versus voorwaarts verstrooiingsgebied door variantplot. Pas vervolgens, met cellijn een draaiend, de zijwaartse en voorwaartse verstrooiingsspanningen aan totdat de celpopulatie in het linker beneden kwadrant is.

Gebruik vervolgens de polygoontool om de celpopulatie als poort P een te definiëren. Maak nu een voorwaartse verstrooiingshoogte versus voorwaarts verstrooiingsgebied door variantplot en pas de P een-poort toe. Definieer vervolgens de enkele cellen als poort P twee en genereer elk één histogram.

Voor de C-F-P-Y-F-P- en fretfilters, pas poort P twee toe op drie verschillende histogrammen, elk voor de C-F-P-Y-F-P- en fretfilters voor compensatie. Voeg 30 microliter van de cellijn één suspensie toe aan 200 microliter van de cellijn twee suspensie. Klik vervolgens op het pictogram instrumentinstellingen gevolgd door het compensatietabblad en controleer de matrix om de compensatietabel te openen.

Genereer een fretgebied versus CFP-gebied door variantplot en pas poort P twee toe. Klik vervolgens, met cellijn één en cellijn twee draaiend, op het kwadrantpictogram en teken kwadranten zodanig dat de fluorescente negatieve en positieve populaties worden gescheiden door de onderste twee kwadranten. Maak nu een statistiektabel die de mediaan fluorescentie-intensiteit of MFI van fret voor de LL drie en LR drie poorten weergeeft en pas de fret-parameter in de compensatiematrix aan tot de MFI van het fretsignaal ongeveer gelijk is tussen LL drie en LR drie.

Maak vervolgens een YFP-gebied versus CFP-gebied door variantplot met kwadranten. Pas de YFP-parameter in de compensatiematrix aan tot de MFI van het YFP-signaal ongeveer gelijk is tussen de kwadranten. Vergelijkbaar met wat eerder werd getoond voor fret-flowcytometrie.

De primaire fluorescente overloop vindt plaats vanuit CFP dat wordt uitgezonden in het fret-detectiekanaal