Name: Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Leer caspase-3-activiteit meten in de rattenamygdala na een myocardinfarct met spectrofluorimetrie. Deze betrouwbare methode helpt onderzoekers apoptose in de hersenen kwantificeren en de gevolgen van hartinfarcten voor cognitie en mentale gezondheid bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada Kim Gilbert heeft een studententijd van Fonds de la recherche du Québec - Santé.

Dieren worden behandeld in overeenstemming met de regelgeving van de lokale Animal Care Committee, in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadese Raad van Animal Care. Ratten zijn gehuisvest individueel onder constante condities (temperatuur van 21-22 ° C en vochtigheid van 40-50%), waaronder een 12 uur donker-licht cyclus, te beginnen om 08:00. Chow pellets en kraanwater zijn ad libitum gedurende het onderzoek. Een acclimatisatie periode van 3 dagen na levering door de leverancier is toegestaan ​​voor het experiment. Mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht tussen 300-800 g werden routinematig gebruikt met dit protocol. 1. MI Surgery <ol><li> Induceren anesthesie met intraperitoneale injecties van ketamine 60 mg / kg en xylazine 10 mg / kg. Bevestig de juiste verdoving door de afwezigheid van reflex wanneer de poten worden geknepen. </li><li> Scheren operatiewond. Intuberen rat met endotracheale slangen: catheter (16G 1,77 inch) en plaats van dieren in de laterale decubitus positie. Plaats de dieren op een verwarmingselement om de temperatuur rond de 37 ° C te houden. Sluit de endotracheale slang aan isofluraan 2%. </li><li> Bereid chirurgische site met chloorhexidinegluconaat en isopropylalcohol. Tijdens de operatie, gebruik steriele handschoenen en gesteriliseerde instrumenten. Breng oogzalf beide ogen tot droog voorkomen terwijl onder narcose. Zet steriele veld op dieren en de instrumenten op een andere steriele veld naast het dier. </li><li> Incise huid met een scalpel # 10. Afpellen spierweefsel met een hemostatische klem. Plaats het dier ventrale decubitus positie. Open thoracale muur met een hemostatische klem en de positie van de borst oprolmechanisme. Open hartzakje met een hemostatische klem. </li><li> Coronaire occlusie, lus produceert een 360 mm lange 4-0 zijden hechtdraad rondom de dalende kransslagader, die door de aangrenzende myocardweefsel. Steek beide uiteinden van de zijden hechtdraad in een 14G, 1,25 cm lange plastic buis. </li><li> Trek beide uiteinden van de zijden hechtdraad en push de buis naar beneden tegen de slagader om het af te sluiten, gedurende 40 min. Veilig occlusie door klemmen de plastic buis met een hemostatische klem. </li><li> Na 40 min, laat de occlusie door het vrijgeven van de hemostatische klem, gevolgd door het verwijderen van de flexibele slang en de zijden hechtdraad. Opmerking: Sham controle ratten dezelfde operatie minus de occlusie van de kransslagader ondergaan. </li><li> Voordat de borstwand, een flexibel katheter (18G, 4,5 cm) tot de borstholte om lucht te trekken uit de thorax met een 5-ml spuit om pneumothorax voorkomen. </li><li> Sluiten thorax holte met 2-0 hechtdraad, steek de spier met 4-0 zijden hechtdraad en de huid met 3-0 zijden hechtdraad. </li><li> Voor het sluiten van de laatste huid punt weer trekken lucht uit de thorax met 5-ml spuit door de katheter die eerder in de thorax holte geplaatst. </li><li> Hechtdraad laatste huid punt. Stoppen isofluraan ventilatie. </li><li> Monitor rat ontwaken. Heeft een dier niet onbeheerd laten staan ​​totdat het Regained voldoende bewustzijn borstligging handhaven. </li><li> Behandel rat elke 8 uur gedurende 24 uur met een pijnstiller (buprenorfine, 0,05 mg / kg ip) en een antibioticum (een enkelvoudige dosis duplocillin, 0,2 mg / kg ip). </li><li> Na de operatie, huis ratten individueel op het moment van het offer, dat wil zeggen, 3 dagen na MI. </li><li> Infarctgrootte, voornamelijk necrose, wordt uitgedrukt als het percentage infarct weefsel in het risicogebied van de linker ventrikel. Dit kan gemeten met triphenyltetrazolium kleuring 11. </li></ol> 2. Amygdala Isolatie <ol><li> Plaats het dier hoofd eerst in een kegelvormige zakje met zijn neus uitsteekt uit de nauwe eindopening. Beveiligde rat om elke beweging te vermijden. Positioneer het hoofd op de juiste wijze op de guillotine, tussen de schaar messen. Onthoofden dier. </li><li> Plaats het hoofd van de rat in een schotel gehouden op crushed ijs. Voer alle procedures weefsel isolatie op gemalen ijs (4 ° C). </li><li> Opengesneden skull met een schaar voorzichtig los bot scheden met been rongeurs door te trekken en het vermijden van verminken het weefsel eronder. </li><li> Leg de platte kant van een spatel tussen de onderkant van de schedel en het achterste ventrale oppervlak van de hersenen en zorgvuldig losmaken hersenen van de schedel diept het blad voorwaarts langs de onderkant van de schedel tot de hersenen langzaam kan worden opgetild uit de schedel. Gooi de schedel. </li><li> Plaats de hersenen op zijn dorsale oppervlak. Identificeer hypothalamus (structuur tegenover het cerebellum) en snijd de hersenen coronaalwaarts vóór het voorste uiteinde en achter het achterste uiteinde; gooi de voorste en achterste delen van de hersenen als nodig voor andere doeleinden. </li><li> Visualiseer de amygdalas als kleine bolletjes onder de temporale kwabben, bilateraal, net naast de hypothalamus. </li><li> Flip de hersenen plat op de voorste einde, dorsale oppervlak weg van de experimentator. </li><li> Beginnen met de linker of rechterkant van de hersenen. Scheid de hemibollen en dan de cortex van de aangrenzende amygdala. Snijd weg ongeveer 8 mm van deze losse cortex aan de isolatie van de amygdala mogelijk te maken. Weggesneden amygdala met scalpel. </li><li> Isoleer de basolaterale deel van de amygdala van zijn centromedial deel door te snijden langs het donker hechtdraad dat over het loopt, bijna de helft en de helft. Deze structuur is niet altijd gemakkelijk te identificeren. </li><li> Zet amygdala subparts in afzonderlijke geïdentificeerd flesjes en blijf op crushed ijs. </li><li> Herhaal dissectie procedure bij de andere hersenhelft. </li><li> Dompel ampullen in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut. Houd flacon in -80 ° C vriezer totdat het nodig is. </li></ol> 3. Caspase-3 Activity <ol><li> Bereid lysis buffer met 0,32 M sucrose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur, 2 mM dithiothreitol, 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride, 10 ug / ul leupeptine , 10 ug / ul pepstatine A en 10 ug / ul van aprotinine. </li><li>Voeg 150 ul lysisbuffer aan elk monster (5-10 mg). Houden op het ijs. Ultrasone trillingen elk monster op ijs gedurende 5 sec bij maximale intensiteit (40 W). Incubeer weefsel in lysis buffer op ijs gedurende 30 min. Vortex elk monster gedurende 5 min. </li><li> Voer 3 vries / ontdooi cycli door het plaatsen van monsters in vloeibare stikstof afwisselend en een thermostatisch geregelde verwarmingsplaat ingesteld op 37 ° C. Centrifuge weefsel bij 13.000 g (4 ° C) gedurende 10 min. Verwijder voorzichtig supernatant en in buis te houden op het ijs. </li><li> Bereid standaard eiwitconcentraties tussen 0 en 10 ug / ml met runderserumalbumine. Bereid blanks met slechts buffer. </li><li> Voeg 200 ul van Bradford-reagens aan elke standaard. Lees standaard bij 595 nm. Voor eiwitniveaus, voeg 5 ul monster supernatant aan 795 pl gedestilleerd water en 200 pl Bradford-reagens. Lees elk monster bij 595 nm en gekwantificeerd eiwit met standaardcurve. </li><li> Bereid reactiebuffer met 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl 2 &lt;/ sub&gt;, 1 mM ethyleenglycol-azijnzuur, 0,1% van 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat en 1 mM dithiothreitol. </li><li> Voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en caspase-3 substraten positieve en negatieve reactieve monsters. Voor negatieve monsters, voeg reactiebuffer, 25 ug eiwit, 0,4 gl Ac-DEVD-CHO 800 pM en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Voor positieve monsters, voeg 25 ug eiwit reactiebuffer en 0,8 pl Ac-DEVD-AMC 10 mM. Verwerken alle negatieve en positieve monsters in drievoud. Vul het eindvolume van elk monster tot 200 ul door toevoegen reactiebuffer. </li><li> Opbrengst negatieve controles door toevoeging van 188,7 pl reactiebuffer tot 0,5 gl Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 gl Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer. Voor positieve controles, voeg 189,2 pi reactiebuffer, 0,8 pi van Ac-DEVD-AMC 10 mM en 10 pl lysisbuffer. </li><li> Incubeer monsters encontroles in het donker gedurende 3 uur bij 37 oC </li><li> Stop de reactie met 600 ul 0,4 M glycine en 0,4 M NaOH (pH 10) in elk monster en controle. </li><li> Kwantificeren fluorescentie door spectrofluorimetrie bij excitatie golflengte van 365 nm en emissie golflengte van 465 nm. Voeg 2 ml gedestilleerd water om de reactie in glas cuvet. Lees controles en monsters voor 10 sec met 1 punt bij elke sec. </li><li> Kwantificeren specifieke activiteit in elk monster: ((Fluorescentie van negatieve monsters minus fluorescentie van positieve monsters) x volume van 2,8 ml) gedeeld door (incubatietijd 3 uur x hoeveelheid eiwit 25 mg). </li></ol>

<ol><li>Denault, J. B., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases%3A+keys+in+the+ignition+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Caspases: keys in the ignition of cell death.</a> Chemical Reviews. 102, 4489-4500 (2002).</li>
<li>Boucher, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-ischemic+cardioprotection+by+A2A+adenosine+receptors%3A+dependent+of+phosphatidylinositol+3-kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Post-ischemic cardioprotection by A2A adenosine receptors: dependent of phosphatidylinositol 3-kinase pathway.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 43, 416-422 (2004).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celecoxib+after+the+onset+of+reperfusion+reduces+apoptosis+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Celecoxib after the onset of reperfusion reduces apoptosis in the amygdala.</a> Apoptosis. 12, 1945-1951 (2007).</li>
<li>Kaloustian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+time+course+in+the+limbic+system+after+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Apoptosis time course in the limbic system after myocardial infarction in the rat.</a> Brain Research. 1216, 87-91 (2008).</li>
<li>Rousseau, G., Bah, T. M., Godbout, R. Chapter 19, Post-Myocardial Infarction Depression. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRousseau%2C+G+%22Novel+Strategies+in+Ischemic+Heart+Disease+%22">Novel Strategies in Ischemic Heart Disease </a>. Lakshmanadoss, U. , 333-362 (2012).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+detected+in+the+amygdala+following+myocardial+infarction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Apoptosis detected in the amygdala following myocardial infarction in the rat.</a> Biological Psychiatry. 59, 430-433 (2006).</li>
<li>Arseneault-Breard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Lactobacillus+helveticus+R0052+and+Bifidobacterium+longum+R0175+reduces+post-myocardial+infarction+depression+symptoms+and+restores+intestinal+permeability+in+a+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Combination of Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175 reduces post-myocardial infarction depression symptoms and restores intestinal permeability in a rat model.</a> British Journal of Nutrition. 107, 1793-1799 (2012).</li>
<li>Bah, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escitalopram+reduces+circulating+pro-inflammatory+cytokines+and+improves+depressive+behavior+without+affecting+sleep+in+a+rat+model+of+post-cardiac+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Escitalopram reduces circulating pro-inflammatory cytokines and improves depressive behavior without affecting sleep in a rat model of post-cardiac infarct depression.</a> Behavioural Brain Research. 225, 243-251 (2011).</li>
<li>Bah, T. M., Kaloustian, S., Rousseau, G., Godbout, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+with+pentoxifylline+has+antidepressant-like+effects+in+a+rat+model+of+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment with pentoxifylline has antidepressant-like effects in a rat model of acute myocardial infarction.</a> Behavioural Pharmacology. 22, 779-784 (2011).</li>
<li>Gilbert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+post-myocardial+infarction+depression+in+rats+by+n-3+fatty+acids+or+probiotics+starting+after+the+onset+of+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Attenuation of post-myocardial infarction depression in rats by n-3 fatty acids or probiotics starting after the onset of reperfusion.</a> British Journal of Nutrition. 109, 50-56 (2013).</li>
<li>Gilbert, K., Bernier, J., Godbout, R., Rousseau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolvin+D1%2C+a+metabolite+of+omega-3+polyunsaturated+fatty+acid%2C+decreases+post-myocardial+infarct+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Drugs%22%5BJournal%5D)">Resolvin D1, a metabolite of omega-3 polyunsaturated fatty acid, decreases post-myocardial infarct depression.</a> Marine Drugs. 12, 5396-5407 (2014).</li>
<li>Wann, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+signs+of+depression+and+apoptosis+in+the+limbic+system+following+myocardial+infarction%3A+effects+of+sertraline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioural signs of depression and apoptosis in the limbic system following myocardial infarction: effects of sertraline.</a> Journal of Psychopharmacology. 23, Oxford, England. 451-459 (2009).</li>
<li>Gorr, T. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+re-visited%3A+critical+perusal+of+under-appreciated+technical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%3A+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Western blotting re-visited: critical perusal of under-appreciated technical issues.</a> Proteomics: Clinical Applications. , (2015).</li>
<li>McKernan, D. P., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%27Killing+the+blues%27%3A+a+role+for+cellular+suicide+%28apoptosis%29+in+depression+and+the+antidepressant+response%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">'Killing the blues': a role for cellular suicide (apoptosis) in depression and the antidepressant response.</a> Progress in Neurobiology. 88, 246-263 (2009).</li>
<li>Green, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+pathways%3A+paper+wraps+stone+blunts+scissors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apoptotic pathways: paper wraps stone blunts scissors.</a> Cell. 102, 1-4 (2000).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Onze ervaring met dit protocol in de afgelopen 10 jaar geleid tot de identificatie van de kritieke methodologische kwesties. Ten eerste, snelle hersenen dissectie in een petrischaal op gemalen ijs belangrijk prepareerkwaliteit handhaven. Ten tweede dient men zich te realiseren dat weefsel sonicatie korter de cerebrale amygdala vergelijking met andere typen weefsels, zoals het hart (10 sec) en nieren (20 sec). Ten derde moet grote zorg worden genomen om het substraat nauwkeurig te mengen voordat het aan de monsters. We tegenkwamen variabele signalen wanneer het mengen volgorde was onvoldoende. Ten vierde moeten geen bellen in de kwarts cel bij het lezen van de monsters. Anders kan het signaal worden veranderd. We hebben een verandering in de afgelopen jaren de reproduceerbaarheid van de resultaten te vergroten: verhoging substraatvolume volume minder dan 1 pi voorkomen. Toch kunnen kleine verschillen optreden tussen opeenvolgende testen en tenminste 3 controlemonsters worden gebruiktcontrol variaties. Fluorescentie metingen van deze controles worden gemiddeld en het gemiddelde wordt gesteld op 100%. Fluorescentie maatregelen experimentele monsters worden omgezet in percentage van de controlemonsters. Een andere beperking van deze techniek is dat slechts een deel van het weefsel wordt toegepast en derhalve kan caspase-3 activiteit wordt onderschat. Inderdaad, het tijdvenster van apoptose kort in een bepaalde cel en kan worden gemist hoewel het voorkomt in aangrenzende gebieden op het moment van bemonstering 1,4,15. Het omgekeerde is ook mogelijk: apoptosis kan bijzonder intens in porties van weefsel, wat resulteert in een overschatting van caspase-3 activiteit. Wij raden het gebruik van de resterende weefsels (amygdala) voor aanvullende technieken, zoals TUNEL testen of Bax / Bcl2 ratio (zie inleiding). Spectrofluorimetrie ten minste twee voordelen boven Western blotting. Ten eerste genereert direct kwantitatieve gegevens. Ten tweede, het meet enzymatische eenctivity zelf in plaats van eiwit of RNA-expressie, die geen verband kan zijn, en het is bekend dat eiwit expressie kan worden verhoogd zonder wijziging van enzymatische activiteit. Bovendien kan spectrofluorimetrie worden uitgevoerd op andere weefsels of met andere diersoorten en kunnen worden aangepast voor andere caspase subtypen, met verschillende substraten, zodat veilig vergelijkingen kunnen worden gemaakt. Concluderend dit document wordt het gebruik van spectrofluorimetrie met caspase-3 activiteit te meten in de amygdala, waarin wordt aangetoond dat apoptose optreedt in deze regio van het limbische systeem 3 dagen na MI.

Caspasen of Cysteine-afhankelijke-aspartaat gerichte proteasen zijn een familie van enzymen betrokken bij verschillende homeostase processess 1. Caspasen kan grofweg worden ingedeeld op basis van hun rol in apoptose of ontsteking. Caspase-1, -4, -5 en -12 zijn betrokken bij ontstekingen terwijl die betrokken zijn bij apoptose kan sub-geclassificeerd als initiator caspases (caspase-8 en -9) en beul caspases (caspase-3, -6 en -7 ). Caspasen spelen een belangrijke rol in vele ziekten, vooral in aandoeningen waarin apoptose buitensporig kan zijn, zoals waargenomen na myocardinfarct (MI) of cerebrale ischemie. In het rattenmodel van post-MI syndroom gebruikt in ons lab is vastgesteld dat caspase-3 wordt geactiveerd niet alleen in het myocardium 2, maar ook in het limbische systeem dat is betrokken bij de beheersing van stemming en emoties 3-6. Ook wordt gezien dat caspase-3 wordt geactiveerd in verschillende regiohet limbische systeem, zoals de hippocampus en amygdala en deze activering pieken ongeveer 3 dagen na ischemisch insult 4. Interessant is dat caspase-3-activiteit correleert met post-MI gedrags- stoornissen, en de demping door middel van farmacologische en nutritionele interventies vermindert deze verwondingen, hetgeen duidt op een mogelijk verband tussen caspase-3 en post-MI depressie 7-12. Caspase-3 activatie kan worden gemeten met verschillende technieken. Western blotting constateert de enzymatische eigenschappen van de caspasen en kunnen actieve enzymen en hun pro-enzymvormen detecteren. Western blotting echter semi-kwantitatief en kleine variaties kunnen worden verloren door zwak signaal-ruisverhoudingen 13. Een betere techniek is gebaseerd op de splitsing van een substraat (DEVD-AMC) van caspase-3 die een fluorogene verbinding vrijgeeft en kan worden gemeten door spectrofluorimetrie. Caspase-3 activatie is een betrouwbare merker van apoptose. Meting van apoptose can instabiel zijn omdat het tijdvenster van optreden is kort, en naburige cellen kunnen apoptotische lichamen of cellen 14 phagocytize. Apoptose kan verder worden bevestigd door andere technieken, zoals terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) test, dat DNA fragmentatie die voortvloeit uit apoptotische signaaltransductie cascades 6, of de verhouding van pro- / anti-apoptotische proteïnen, zoals Bax / detecteert Bcl2 6.

<table><tbody><tr><td>Spectroflurometer</td><td>Photon technology Instrument (now Horiba)</td><td>Ratiomaster M-40</td><td>met DeltaRAM&nbsp; Random Access Monochromator&nbsp;</td></tr><tr><td>Respirator</td><td>Harvard apparatus</td><td>683</td><td>kleine dierdierenventilatie</td></tr><tr><td>Glas cuvet</td><td>NSG precision cells</td><td>3G10</td><td>Optical Glass (340-2.500 nm) 10 mm pad</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Cole Parmer</td><td>4710&nbsp; serie</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Varian</td><td>Cary 50 Bio</td><td></td></tr></tbody></table>

caspase-3 activiteit in het rat amygdala gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Caspase-3 Activity in the Rat Amygdala Measured by Spectrofluorometry After Myocardial Infarction

Myocardinfarct (MI) heeft dramatische middellange en lange termijn gevolgen van de fysiologische en gedragsmatige niveau, maar de betrokken mechanismen zijn nog onduidelijk. Ons laboratorium heeft een rattenmodel van post-MI syndroom dat verminderde hartfunctie, neuronaal verlies in het limbische systeem, cognitieve stoornissen en gedragsmatige tekenen van depressie wordt ontwikkeld. Op neuronaal niveau, caspase-3 activatie bemiddelt post-MI apoptose in verschillende limbische gebieden, zoals de amygdala - piek op 3 dagen na MI. Cognitieve en gedragsmatige stoornissen lijken 2-3 weken na MI en deze correleren statistisch met de maatregelen van caspase-3-activiteit. De hier beschreven protocol wordt gebruikt om MI induceren verzamelen amygdala weefsel en meet caspase-3 activiteit met spectrofluorimetrie. MI induceren, wordt de dalende kransslagader afgesloten gedurende 40 min. Het protocol voor de evaluatie van caspase-3 activatie begint 3 dagen na MI: de ratten opgeofferd en de amygdala geïsoleerde rapiDly uit de hersenen. De monsters worden snel bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C bewaard tot werkelijke analyse. De techniek uitgevoerd voor caspase-3 activatie beoordelen op basis van splitsing van een substraat (DEVD-AMC) van caspase-3, die een fluorogene verbinding die kan worden gemeten door spectrofluorimetrie vrijgeeft. De methodologie kwantitatieve en reproduceerbare maar de vereiste apparatuur duur en de procedure voor het kwantificeren van de monsters tijdrovend. Deze techniek kan worden toegepast op andere weefsels, zoals het hart en de nieren. DEVD-AMC kan worden vervangen door andere substraten op de activiteit van andere caspasen meten.

De amygdala werd geïsoleerd 8 sham (controle) en 8 MI ratten drie dagen na de inductie van de ischemie / reperfusie protocol. Caspase-3 activiteit werd gemeten in dit weefsel met een fluorochroom dat kan worden gesplitst door actief caspase-3 en gedetecteerd door spectrofluorometrie. Positieve en negatieve metingen (zie stap 3.11, 3.12 en 3.16) werden in drievoud uitgevoerd en gemeten gedurende 10 sec, met 1 punt bij elke sec. Verschillen tussen positieve en negatieve controles werden berekend en het gemiddelde van de verschillen voor alle schijn tissue uitgevoerd tijdens deze proef werd gesteld op 100%. Resultaten van MI ratten werden opgeschaald volgens deze referentie en figuur 1 illustreert de eindresultaten: het geeft een significant hogere activiteit in MI ratten vergeleken met placebo (p &lt;0,05). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53207/53207fig1.jpg" /> Figuur 1. Caspase-3activiteit in de amygdala MI ratten, uitgedrukt als percentage van de gemiddelde activiteit in schijncontroles, ingesteld op 100% (8 ratten per groep). * Geeft significant verschil tussen de groepen (p &lt;0,05). De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM.

Myocardiaal infarct (MI) wordt niet alleen gevolgd door een verminderde hartfunctie, maar ook door apoptose in de amygdala, een hersengebied dat betrokken is bij de gedragsgevolgen van MI. Dit protocol beschrijft hoe MI kan worden geïnduceerd, amygdala-weefsel kan worden verzameld en caspase-3-activiteit, een marker van apoptose, daarin kan worden gemeten.

Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Myocardial infarction (MI) has dramatic mid- and long-term consequences at the physiological and behavioral levels, but the mechanisms involved are still ...

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de caspase-3-activiteit in de amygdala van de rat na een myocardinfarct met behulp van spectrofluorometrie. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden binnen het vakgebied van de gedragsneurowetenschappen, zoals de gevolgen van een myocardinfarct voor de cognitieve prestaties, de geestelijke gezondheid, het verouderingsproces en de slaap. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig, snel en betrouwbaar is.Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen kunnen ervaren, omdat er behendigheid vereist is voor de chirurgie en het weefselmonsteren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kim Gilbert, een onderzoeksassistent in ons laboratorium. Nadat de anesthesie is geïnduceerd volgens de goedgekeurde institutionele protocollen, dient de juiste verdoving te worden bevestigd door de afwezigheid van de pootknijpreflex.Intubeer de rat met een endotracheale tube en plaats het dier in ventrale decubituspositie op een warmteplaat om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden. Sluit de endotracheale tube aan op een anesthesieapparaat dat 2% isofluraan afgeeft. Bereid vervolgens de chirurgische plaats voor met chloorhexidinegluconaat en isopropylalcohol.Breng vervolgens een oogsalf aan in beide ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats een steriel afdekdoek over het dier om een steriel veld rondom de chirurgische plaats te creëren. Plaats de benodigde steriele chirurgische instrumenten op een ander steriel veld naast het dier.Incise vervolgens de huid met een scalpellamesje nummer 10 of een schaar. Gebruik een schaar of een hemostatische klem om het spierweefsel weg te pellen. Gebruik daarna een schaar of een hemostatische klem om de thoraxwand te openen en plaats de thoraxspreider, en open het pericard met de hemostatische klem.Om een coronaire occlusie te induceren, wordt eerst een 360 millimeter lange 4-0 zijden hechtdraad rond de descenderende coronaire arterie en door het aangrenzende myocardiale weefsel gelust. Steek beide uiteinden van de zijden hechtdraad in een plastic buisje van gauge 14 met een lengte van 1,25 centimeter. Trek aan beide uiteinden van de zijden hechtdraad en druk het buisje tegen de arterie aan om deze af te sluiten.Zet de occlusie vast door de plastic buis af te klemmen met een hemostatische klem en handhaaf de occlusie gedurende 40 minuten. Laat na 40 minuten de occlusie los door de hemostatische klem te verwijderen en vervolgens de flexibele slang en de zijden hechtdraad. Sluit de thorax met een two zero hechtdraad, plaats een flexibele katheter via de thoraxholte en zuig met een spuit van 10 milliliter lucht uit de thorax om een pneumothorax te voorkomen.Hecht de spier met 4-0 zijden hechtdraad en de huid met 3-0 zijden hechtdraad. Voordat de laatste huidhechting wordt gesloten, wordt opnieuw lucht uit de thorax getrokken met behulp van de 10 ml spuit en katheter. Voltooi het sluiten van de huid en stop vervolgens de toediening van isofluraan.Plaats de rat in een schone kooi en houd deze in de gaten tijdens het herstel van de anesthesie. Dien analgesie toe met herhaalde dosering elke acht uur. Na het humaan onthoofden van het dier volgens de goedgekeurde procedures, wordt de kop van de rat op een schaal geplaatst die op vermalen ijs staat.Gebruik een schaar om de schedel te openen. Gebruik vervolgens knabbelstangen om de botplaten los te maken zonder het onderliggende weefsel te beschadigen door naar boven te trekken. Plaats daarna het platte blad van een spatel tussen de onderkant van de schedel en het posterieure ventrale oppervlak van de hersenen en maak de hersenen los van de schedel door het blad voorzichtig naar voren te duwen, waarbij de hersenen uit de schedel worden getild.Plaats de hersenen op het dorsale oppervlak. Identificeer de hypothalamus vóór het cerebellum en maak een coronale doorsnede van de hersenen vóór het posterieure uiteinde van de hypothalamus en evenzo achter het anterieure uiteinde. Identificeer de bilaterale amygdala als twee kleine sferen onder de temporale kwabben, direct naast de hypothalamus.Kantel het brein vervolgens plat op het frontale uiteinde, met de dorsale zijde van de experimentator afgewend. Scheid daarna de hemisferen en verwijder de cortex van de aanhoudende amygdala. Zodra de amygdala zichtbaar is, wordt deze met een scalpel weggesneden.Snijd langs de donkere naad die over de amygdala loopt om de basolaterale en centraal mediale delen te scheiden, en plaats vervolgens de twee delen in afzonderlijke gelabelde buisjes op ijs. Deze stap moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om verslechtering van enzymen te voorkomen. Nadat de dissectieprocedure met de andere hemisfeer is herhaald, worden alle vier de vials één minuut lang in vloeibare stikstof ondergedompeld en vervolgens bewaard in de vriezer op -80 °C.Begin met het toevoegen van 150 µL lysbuffer aan elke vijf tot 10 mg monster op ijs. Sonicate elk monster op ijs bij maximale intensiteit gedurende vijf seconden. Incubeer vervolgens 30 minuten op ijs.Vortex het monster tijdens de incubatie elke vijf minuten gedurende vijf seconden. Voer vervolgens drie vries-dooi-cycli uit door de monsters afwisselend in vloeibare stikstof en op een thermostatisch geregelde warmteplaat ingesteld op 37 °C te plaatsen. Centrifugeer de weefselmonsters na de laatste vries-dooi-cyclus 10 minuten bij 1300 Gs bij vier °C.Aspire vervolgens voorzichtig het supernatant en breng dit over naar een nieuwe buis op ijs. Nadat de eiwitconcentratie is bepaald volgens de instructies in het geschreven protocol, voegt u 25 micrograms eiwit toe aan een reactiebuis die 0,8 microliter 10 millimolar Ac-DEVD-AMC en reactiebuffer bevat voor een eindvolume van 200 microliters. Voor negatieve reactieproeven combineert u 25 micrograms eiwit met één microliter 800 micromolar Ac-DEVD-CHO en 0,8 microliters 10 millimolar Ac-DEVD-AMC.Incubeer alle monsters en controles drie uur lang in het donker bij 37 °C. Nadat de incubatietijd is verstreken, wordt de reactie gestopt door aan elk monster en elke controle 600 µL 0,4 M glycine en 0,4 M natriumhydroxide bij pH 10 toe te voegen. Voeg aan elke reactie in een glazen cuvet twee ml gedestilleerd water toe.Kwantificeer de fluorescentie via spectrofluorometrie. Meet de controles en monsters gedurende 10 seconden met één meting per seconde. Kwantificeer tot slot de specifieke activiteit in elk monster volgens de formule die nu op het scherm wordt getoond.Dit histogram toont de caspase-3-activiteit in de amygdala van ratten die een myocardinfarct hebben doorgemaakt. De gegevens zijn uitgedrukt als het percentage van de gemiddelde activiteit in de sham-controles, gesteld op 100%. Elke groep bestond uit acht ratten. Het asteriskje geeft een significant verschil tussen de groepen aan met een p-waarde van minder dan 0,05.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zeven uur worden uitgevoerd, exclusief het interval tussen de chirurgie voor het myocardinfarct en de weefselafname. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een myocardinfarct bij een rat kan worden geïnduceerd en hoe de caspase-3 activiteit in de amygdala van de rat kan worden gemeten met spectrofluorometrie.

caspase-3-activity-rat-amygdala-measured-spectrofluorometry-after

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De rat model van acuut myocard infarct (AMI) is nuttig om het gevolg van een MI op cardiale pathofysiologische en fysiologische functie te bestuderen.

Acuut myocardinfarct in ratten

This video demonstrates how to measure proteasome activity in different subcellular compartments of the lateral amygdala from fear-conditioned and control rat brains using a fluorogenic peptide assay. The proteasome cleaves the fluorogenic peptide substrate, releasing fluorescent molecules, which are quantified using a plate reader to assess proteasome activity in the nuclear and synaptic protein fractions. Increased nuclear activity suggests changes in gene expression, while reduced synaptic...

Measuring Proteasome Activity in Different Subcellular Compartments of the Rat Brain

Myocardiale ischemie-reperfusie model van rattenhart wordt verbeterd door gebruik te maken van een zelfgemaakt retractor, polyvinylchloride buis, en een unieke knoopmethode. Elektrocardiogram, trifenyltetrazoliumchloride en histologische kleuring en procentuele overlevingsanalyseresultaten toonden aan dat de verbeterde modelgroep hogere succes- en overlevingskansen heeft dan de reeds bestaande modelgroep.

Verbeterd knaagdiermodel van myocardiale ischemie en reperfusieletsel

In vivo modellen van ratten zijn onmisbare hulpmiddelen om de pathologische mechanismen en therapeutische doelen voor ischemische beroerte te onderzoeken. Dit werk beschrijft het uitvoeren van immunofluorescentiekleuring in hersenplakjes met een infarct na occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) bij ratten.

Evaluatie van celdoodsignalering door immunofluorescentie in een rattenmodel van ischemische beroerte

Driedimensionale (3D) reconstructie van hartschade bij gerefused acuut myocardinfarct (repAMI) maakt getrouwe kwantificering en co-lokalisatie van geassocieerde ziekte-beïnvloedende patronen mogelijk. Hier wordt een automatiseerbare lichtbladgeleide beeldvormingsbenadering geboden voor gelijktijdige meting van hartschade, risicogebied en immuuncelrespons.

Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie

Chirurgische inductie van ischemische hersenschade in de rat is een veel gebruikt model voor een beroerte onderzoek. Hier laten we zien de inductie van focale cerebrale ischemie door occlusie van de midden cerebrale slagader. Visualisatie van de resulterende infarct door histologische kleuring en magnetische resonantie beeldvorming wordt ook getoond.

Focus cerebrale ischemie Model door Endovasculaire Suture Occlusie van de midden cerebrale slagader in de Rat

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om de activiteit van cis-regulatorische elementen (dat wil zeggen, enhancer / promotor) te kwantificeren in levende muis netvlies via explantatie elektroporatie. DNA-voorbereiding, retinale dissectie, elektroporatie, retinale Explantatie cultuur, en post-fixatie analyse en kwantificering worden beschreven.

Kwantificeren van de activiteit van Cis-Regulatorische elementen in de muis Retina door Explantatie Elektroporatie

Live-cell imaging van caspase-3-gemedieerde apoptose in vereeuwigd N19-oligodendrocyt celculturen met behulp van...

Monitoring gekliefde caspase-3 activiteit en apoptose van geïmmortaliseerde Oligodendrogliale cellen met behulp van live-cell imaging en Cleaveable fluorogene-dye Substraten Na Kalium-geïnduceerde membraandepolarisatie

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de therapeutische effecten van diepe hersenstimulatie (DBS) chirurgie moet onderzocht worden. De methoden die in dit manuscript worden gepresenteerd, beschrijven een experimentele benadering om de cellulaire gebeurtenissen geactiveerd door DBS te onderzoeken door de genexpressieprofiel van kandidaatgenen te analyseren die neurogenese na DBS-chirurgie kunnen bevorderen.

Analyse van genexpressie Veranderingen in het Rat Hippocampus Na Deep Brain Stimulation van de Anterior Thalamic Nucleus

Leer caspase-3-activiteit meten in de rattenamygdala na een myocardinfarct met spectrofluorimetrie. Deze betrouwbare methode helpt onderzoekers apoptose in de hersenen kwantificeren en de gevolgen van hartinfarcten voor cognitie en mentale gezondheid bestuderen.

Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Meer video's verkennen