Caspase-3 activiteit in het Rat Amygdala Gemeten door spectrofluorimetrie na een myocardinfarct

Het algemene doel van deze procedure is het meten van de caspase-3-activiteit in de amygdala van de rat na een myocardinfarct met behulp van spectrofluorometrie. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden binnen het vakgebied van de gedragsneurowetenschappen, zoals de gevolgen van een myocardinfarct voor de cognitieve prestaties, de geestelijke gezondheid, het verouderingsproces en de slaap. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze eenvoudig, snel en betrouwbaar is.

Over het algemeen zouden personen die nieuw zijn met deze methode problemen kunnen ervaren, omdat er behendigheid vereist is voor de chirurgie en het weefselmonsteren. De procedure zal worden gedemonstreerd door Kim Gilbert, een onderzoeksassistent in ons laboratorium. Nadat de anesthesie is geïnduceerd volgens de goedgekeurde institutionele protocollen, dient de juiste verdoving te worden bevestigd door de afwezigheid van de pootknijpreflex.

Intubeer de rat met een endotracheale tube en plaats het dier in ventrale decubituspositie op een warmteplaat om de lichaamstemperatuur op 37 °C te houden. Sluit de endotracheale tube aan op een anesthesieapparaat dat 2% isofluraan afgeeft. Bereid vervolgens de chirurgische plaats voor met chloorhexidinegluconaat en isopropylalcohol.

Breng vervolgens een oogsalf aan in beide ogen om uitdroging te voorkomen. Plaats een steriel afdekdoek over het dier om een steriel veld rondom de chirurgische plaats te creëren. Plaats de benodigde steriele chirurgische instrumenten op een ander steriel veld naast het dier.

Incise vervolgens de huid met een scalpellamesje nummer 10 of een schaar. Gebruik een schaar of een hemostatische klem om het spierweefsel weg te pellen. Gebruik daarna een schaar of een hemostatische klem om de thoraxwand te openen en plaats de thoraxspreider, en open het pericard met de hemostatische klem.

Om een coronaire occlusie te induceren, wordt eerst een 360 millimeter lange 4-0 zijden hechtdraad rond de descenderende coronaire arterie en door het aangrenzende myocardiale weefsel gelust. Steek beide uiteinden van de zijden hechtdraad in een plastic buisje van gauge 14 met een lengte van 1,25 centimeter. Trek aan beide uiteinden van de zijden hechtdraad en druk het buisje tegen de arterie aan om deze af te sluiten.

Zet de occlusie vast door de plastic buis af te klemmen met een hemostatische klem en handhaaf de occlusie gedurende 40 minuten. Laat na 40 minuten de occlusie los door de hemostatische klem te verwijderen en vervolgens de flexibele slang en de zijden hechtdraad. Sluit de thorax met een two zero hechtdraad, plaats een flexibele katheter via de thoraxholte en zuig met een spuit van 10 milliliter lucht uit de thorax om een pneumothorax te voorkomen.

Hecht de spier met 4-0 zijden hechtdraad en de huid met 3-0 zijden hechtdraad. Voordat de laatste huidhechting wordt gesloten, wordt opnieuw lucht uit de thorax getrokken met behulp van de 10 ml spuit en katheter. Voltooi het sluiten van de huid en stop vervolgens de toediening van isofluraan.

Plaats de rat in een schone kooi en houd deze in de gaten tijdens het herstel van de anesthesie. Dien analgesie toe met herhaalde dosering elke acht uur. Na het humaan onthoofden van het dier volgens de goedgekeurde procedures, wordt de kop van de rat op een schaal geplaatst die op vermalen ijs staat.

Gebruik een schaar om de schedel te openen. Gebruik vervolgens knabbelstangen om de botplaten los te maken zonder het onderliggende weefsel te beschadigen door naar boven te trekken. Plaats daarna het platte blad van een spatel tussen de onderkant van de schedel en het posterieure ventrale oppervlak van de hersenen en maak de hersenen los van de schedel door het blad voorzichtig naar voren te duwen, waarbij de hersenen uit de schedel worden getild.

Plaats de hersenen op het dorsale oppervlak. Identificeer de hypothalamus vóór het cerebellum en maak een coronale doorsnede van de hersenen vóór het posterieure uiteinde van de hypothalamus en evenzo achter het anterieure uiteinde. Identificeer de bilaterale amygdala als twee kleine sferen onder de temporale kwabben, direct naast de hypothalamus.

Kantel het brein vervolgens plat op het frontale uiteinde, met de dorsale zijde van de experimentator afgewend. Scheid daarna de hemisferen en verwijder de cortex van de aanhoudende amygdala. Zodra de amygdala zichtbaar is, wordt deze met een scalpel weggesneden.

Snijd langs de donkere naad die over de amygdala loopt om de basolaterale en centraal mediale delen te scheiden, en plaats vervolgens de twee delen in afzonderlijke gelabelde buisjes op ijs. Deze stap moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd om verslechtering van enzymen te voorkomen. Nadat de dissectieprocedure met de andere hemisfeer is herhaald, worden alle vier de vials één minuut lang in vloeibare stikstof ondergedompeld en vervolgens bewaard in de vriezer op -80 °C.

Begin met het toevoegen van 150 µL lysbuffer aan elke vijf tot 10 mg monster op ijs. Sonicate elk monster op ijs bij maximale intensiteit gedurende vijf seconden. Incubeer vervolgens 30 minuten op ijs.

Vortex het monster tijdens de incubatie elke vijf minuten gedurende vijf seconden. Voer vervolgens drie vries-dooi-cycli uit door de monsters afwisselend in vloeibare stikstof en op een thermostatisch geregelde warmteplaat ingesteld op 37 °C te plaatsen. Centrifugeer de weefselmonsters na de laatste vries-dooi-cyclus 10 minuten bij 1300 Gs bij vier °C.

Aspire vervolgens voorzichtig het supernatant en breng dit over naar een nieuwe buis op ijs. Nadat de eiwitconcentratie is bepaald volgens de instructies in het geschreven protocol, voegt u 25 micrograms eiwit toe aan een reactiebuis die 0,8 microliter 10 millimolar Ac-DEVD-AMC en reactiebuffer bevat voor een eindvolume van 200 microliters. Voor negatieve reactieproeven combineert u 25 micrograms eiwit met één microliter 800 micromolar Ac-DEVD-CHO en 0,8 microliters 10 millimolar Ac-DEVD-AMC.

Incubeer alle monsters en controles drie uur lang in het donker bij 37 °C. Nadat de incubatietijd is verstreken, wordt de reactie gestopt door aan elk monster en elke controle 600 µL 0,4 M glycine en 0,4 M natriumhydroxide bij pH 10 toe te voegen. Voeg aan elke reactie in een glazen cuvet twee ml gedestilleerd water toe.

Kwantificeer de fluorescentie via spectrofluorometrie. Meet de controles en monsters gedurende 10 seconden met één meting per seconde. Kwantificeer tot slot de specifieke activiteit in elk monster volgens de formule die nu op het scherm wordt getoond.

Dit histogram toont de caspase-3-activiteit in de amygdala van ratten die een myocardinfarct hebben doorgemaakt. De gegevens zijn uitgedrukt als het percentage van de gemiddelde activiteit in de sham-controles, gesteld op 100%. Elke groep bestond uit acht ratten. Het asteriskje geeft een significant verschil tussen de groepen aan met een p-waarde van minder dan 0,05.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zeven uur worden uitgevoerd, exclusief het interval tussen de chirurgie voor het myocardinfarct en de weefselafname. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe een myocardinfarct bij een rat kan worden geïnduceerd en hoe de caspase-3 activiteit in de amygdala van de rat kan worden gemeten met spectrofluorometrie.