Name: Zuivering van Mouse Brain Schepen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Leer de zuivering van hersenvaten bij muizen met behoud van structurele integriteit via centrifugatie en filtratie. Deze methode vereist geen antilichamen en maakt bloed-hersenbarrièreonderzoek mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de Labex MemoLife en door de ARSEP (Fondation pour l&#39;aide à la recherche sur la sclerose en plaques)

1. Oplossingen en Materialen <ol><li> Bereid oplossingen isolatie vaartuig: B1, voeg 1,5 ml HEPES 1M tot 150 ml van HBSS; B2, voeg 3,6 g dextran 20 ml B1; B3, voeg 1 g BSA tot 100 ml B1. </li><li> Wijzig de filterhouder door het snijden van de onderkant van de bovenste deel schroeven. </li><li> Bereid immunokleuring oplossingen: Fixatie oplossing 4% paraformaldehyde in PBS pH 7,4; Permeabilisatie / blokkeeroplossing verdund geit serum tot 5% Triton X100 en 0,25% in PBS pH 7,4. Opmerking: Fixatie afhankelijk van het soort primaire antilichamen gebruikt. </li></ol> 2. Dissection Opmerking: steriele omstandigheden zijn niet nodig, tenzij schepen worden gebruikt voor celkweek doeleinden. <ol><li> Bereid een bekerglas van 150 ml met 20 ml van B1. Houd op ijs en bedek met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen. </li><li> Diep verdoven de muis onder een kap met een klein papieren handdoek gedrenkt in 1 ml zuiver Isoflurane die wordt toegevoegd into de kooi. Anesthesie wordt gecontroleerd door een gebrek aan reactie op een teen knijpen. Dood de muis door cervicale dislocatie. OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd in overeenstemming met de nationale en institutionele regelgeving. </li><li> Optioneel: Voer intracardiale perfusie met 20 ml PBS 1x naar bloedgehalte 24 elimineren. </li><li> Sectie van de huid met een scalpel van de nek tot de neus en trek het weg. Verwijder alle vervuilende haren met PBS 1x. </li><li> Aan de schedel te openen, plaatst u eerst een schaar naar voren om de olfactorische gloeilamp, en open de schaar om de schedel scheuren in twee delen. </li><li> Verwijderen van de hersenen met behulp van een brein spatel voorzichtig. Ontleden de choroid plexus van de laterale ventrikels zoals ze het bloedvat voorbereiding 38 zou besmetten. OPMERKING: Optioneel: De laatste voorbereiding zal parenchymale en hersenvliezen schepen bevatten. Indien niet gewenst, kan meninges worden afgepeld na de beschreven 38 werkwijze. </li><li> Transfer de hersenen in de beker met B1-oplossing op ijs. Tot 8 hersenen kunnen samen worden behandeld. </li></ol> 3. Brain Tissue Homogenisering <ol><li> Met behulp van twee scalpels, handmatig en krachtig sloeg de hersenen in de B1 oplossing vervolgens het verkrijgen van kleine stukjes van ongeveer 2 mm. </li><li> Homogeniseren van de bereiding van een geautomatiseerd Dounce homogenisator, het uitvoeren van 20 slagen bij 400 rpm. Zorg dat de glasbuis wordt gehandhaafd in ijs en het bovendeel van de douncer in oplossing bij het op en neer bewegen, teneinde de vorming van luchtzakken te voorkomen. Indien meerdere monsters worden voorbereid, was de douncer met geïoniseerd water tussen elke homogenisering. </li></ol> 4. Vessel Zuivering <ol><li> Breng het homogenaat in een 50 ml plastic buis en naar de centrifugeren bij 2000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Een grote witte interface (meestal myeline) wordt gevormd op de bovenkant van het vat pellet (rood wanneer geen perfusie uitgevoerd). </li><li> Verwijder het supernatant. Het schip pellet en de witte interface zal elkaar gehecht blijven. Voeg 20 ml van ijskoude B2-oplossing en schud de buis met de hand en krachtig gedurende 1 minuut. </li><li> Ga verder naar de tweede centrifugatie bij 4.400 g gedurende 15 min bij 4 ° C. De myeline vormen nu een dichte witte laag op het oppervlak van het supernatant. </li><li> Haal voorzichtig het myeline laag van de buiswanden door houden de buis en langzaam draaien om de supernatant langs de wanden passen. Gooi myeline het supernatant. De pellet die de vaten blijft op de bodem van de buis bevestigd. </li><li> Dep de binnenwand van de buis met een absorberend papier gewikkeld rond een 5 ml kunststof pipet en verwijder alle resterende vloeistoffen, vermijd contact met het schip pellet. Bewaar het buisje ondersteboven op een absorberend papier om achtergebleven vloeistof af te voeren. </li><li> Hang de pellet in 1 ml ijskoude B3 oplossing door en neer te pipetteren met een laag-bindende tips, keeping de buis op ijs, voeg dan nog eens 5 ml B3 oplossing. Zorg ervoor dat schepen gedispergeerd zo veel mogelijk en hoeft aggregaten vormen. </li></ol> 5. Filtratie <ol><li> Bereid een bekerglas op ijs met 30 ml ijskoude oplossing B3. Dek af met parafilm om luchtvervuiling te voorkomen. </li><li> Plaats een 20 urn zeef op een gemodificeerde filterhouder bovenop een Becker kolf en evenwicht door toepassing van 10 ml ijskoude oplossing B3. </li><li> Giet de bereiding vaartuig op het filter en de vaten spoelen met 40 ml ijskoude oplossing B3. </li><li> Herstellen van de filter met schone pincet en onmiddellijk onder te dompelen in de beker die de B3-oplossing. De schepen van de filter los door voorzichtig schudden. </li><li> Giet het bekerglas gehalte in een 50 ml plastic buis en centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li><li> Opmerking: Als alternatief kan schorsing van de hersenen schepen &#39;uit stap 4.6 worden gefilterd op een 100 pm-zeef.In dit geval worden grotere schepen voorkeur aan de achter, terwijl de doorstroom bevat microvaten (voornamelijk capillairen), die vervolgens worden gefiltreerd op een 20 urn zeef zoals hierboven. </li><li> Resuspendeer de pellet van microvaatjes in 1 ml ijskoude B3 bevat en hevel door pipetteren deze in een 1,5 ml Eppendorf buis. Centrifugeer bij 2000 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. </li></ol> 6. Fixatie, Permeabilisatie en blokkeren <ol><li> Transfer schepen door pipetteren in 0,2 ml PCR-buisjes met PBS met behulp van een 1,0 ml lage binding tip. Wees niet aanraken van de schepen als ze kunnen zich aan de buitenkant van de tip. Voer alle volgende stappen onder een binoculair microscoop. </li><li> Voor elk van de volgende mediumveranderingen, laat de buisjes op ijs tot de vaten beneden bereikt, pipet en het grootste deel van de vloeistoffen via lange ding gel-loading pipet tips. </li><li> Verwijder het grootste deel van de PBS en voeg 200 ul fixeeroplossing.De schepen door zacht schudden schorten en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Pipet de fixeeroplossing en te vervangen door 200 ul 1x PBS (eerste wasbeurt), incubeer gedurende 5 minuten bij RT en herhaal deze stap 3 keer. Elke keer, controleren dat de schepen correct gezonken naar de bodem van de buizen en de pipet uit 1x PBS, het waarborgen van de vaartuigen niet aangeraakt. </li><li> Na de laatste wasbeurt, 1x PBS vervangen door permeabilisatie / blokkerende oplossing en incubeer 1 uur bij KT, de vaten opnieuw suspenderen door zachtjes schudden van tijd tot tijd. </li></ol> 7. Immunokleuring <ol><li> Vervang de permeabilisatie / blokkerende oplossing met de mix van primaire antilichamen (zie referenties van de antilichamen hier en verdunningen gebruikt in de Materials template tabel) verdund in de permeabilisatie / blokkeren oplossing en incubeer bij 4 ° CO / N. </li><li> Na 3 wassingen in PBS bij kamertemperatuur, incubeer de vaten met het mengsel van secundaire antilichamen verdund in PBS gedurende 2 uurbij kamertemperatuur. </li><li> Opmerking: we raden het uitvoeren van nucleaire kleuring met Hoechst (1: 2000) of DAPI (1: 2000) om schepen tegen mogelijke besmetting van haren of stof onder de microscoop te onderscheiden. </li><li> Na 3 wassingen in PBS, resuspendeer de vaartuigen in 50 pl PBS. </li></ol> 8. Montage en Observation <ol><li> Bereid een tip met een gesiliconiseerde glazen capillair: snijd een P200 pipet met behulp van een scalpel en pas de capillaire binnen. Het volume van het capillair is bij benadering 40 pl. </li><li> De schepen over te dragen aan een glasplaatje met behulp van de gesiliconiseerde glazen capillaire en de vloeistof verwijder voorzichtig met een stuk absorberend papier. </li><li> Breng een druppel van de montage medium op de schepen en het bezit van een dekglaasje op 45º waardoor de daling tot aan de rand van de slip te verspreiden. Laten gaan van de dekglaasje en laat medium langzaam verspreiden. Laat het drogen O / N bij RT met bescherming tegen licht. Schepen kunnen onder een tl worden nageleefdent confocale microscoop. </li></ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Blood-Brain+Barrier+in+Health+and+Chronic+Neurodegenerative+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders.</a> Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discovery Today. 12 (1-2), 54-61 (2007).</li>
<li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+are+required+for+blood-brain+barrier+integrity+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis.</a> Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).</li>
<li>Armulik, A., Genové, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+regulate+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pericytes regulate the blood-brain barrier.</a> Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).</li>
<li>Hall, C. N., Reynell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+pericytes+regulate+cerebral+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Capillary pericytes regulate cerebral blood flow in health and disease.</a> Nature. 508 (7494), 55-60 (2014).</li>
<li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels%3A+an+electron+microscopic+3D+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: an electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li>
<li>Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-endothelial+interactions+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).</li>
<li>Allaman, I., Brain Magistretti, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+Metabolism%3A+Focus+on+Astrocyte-Neuron+Metabolic+Cooperation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Energy Metabolism: Focus on Astrocyte-Neuron Metabolic Cooperation.</a> Cell Metabolism. 14 (6), 724-738 (2011).</li>
<li>Attwell, D., Buchan, A. M., Charpak, S., Lauritzen, M., MacVicar, B. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+and+neuronal+control+of+brain+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glial and neuronal control of brain blood flow.</a> Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).</li>
<li>Iadecola, C., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+regulation+of+the+cerebral+microvasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial regulation of the cerebral microvasculature.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1369-1376 (2007).</li>
<li>Brendel, K., Meezan, E., Carlson, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+a+purified%2C+metabolically+active+preparation+from+bovine+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: a purified, metabolically active preparation from bovine cerebral cortex.</a> Science (New York, N.Y.). 185 (4155), 953-955 (1974).</li>
<li>Yousif, S., Marie-Claire, C., Roux, F., Scherrmann, J. -M., Declèves, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+drug+transporters+at+the+blood-brain+barrier+using+an+optimized+isolated+rat+brain+microvessel+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of drug transporters at the blood-brain barrier using an optimized isolated rat brain microvessel strategy.</a> Brain Research. 1134, 1-11 (2007).</li>
<li>Dallaire, L., Tremblay, L., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+metabolically+active+capillaries+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of metabolically active capillaries of the blood-brain barrier.</a> Biochemical Journal. 276 ((Pt 3)), 745(1991).</li>
<li>Boado, R. J., Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain-type+glucose+transporter+mRNA+is+specifically+expressed+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The brain-type glucose transporter mRNA is specifically expressed at the blood-brain barrier.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 166 (1), 174-179 (1990).</li>
<li>Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+of+the+blood-brain+barrier%3A+Distribution+of+enzymes+between+the+luminal+and+antiluminal+membranes+of+brain+capillary+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Polarity of the blood-brain barrier: Distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells.</a> Brain Research. 192 (1), 17-28 (1980).</li>
<li>Daneman, R., Zhou, L., Agalliu, D., Cahoy, J. D., Kaushal, A., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mouse+Blood-Brain+Barrier+Transcriptome%3A+A+New+Resource+for+Understanding+the+Development+and+Function+of+Brain+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The Mouse Blood-Brain Barrier Transcriptome: A New Resource for Understanding the Development and Function of Brain Endothelial Cells.</a> PLoS ONE. 5 (10), e13741(2010).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-Sequencing+Transcriptome+and+Splicing+Database+of+Glia%2C+Neurons%2C+and+Vascular+Cells+of+the+Cerebral+Cortex.%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-Sequencing Transcriptome and Splicing Database of Glia, Neurons, and Vascular Cells of the Cerebral Cortex.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Boulay, A. -C., Saubaméa, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sarcoglycan+complex+is+expressed+in+the+cerebrovascular+system+and+is+specifically+regulated+by+astroglial+Cx30+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Sarcoglycan complex is expressed in the cerebrovascular system and is specifically regulated by astroglial Cx30 channels.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 9(2015).</li>
<li>Boulay, A. -C., Mazeraud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+quiescence+of+the+brain+is+set+by+astroglial+Connexin+43%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immune quiescence of the brain is set by astroglial Connexin 43.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (10), 4427-4439 (2015).</li>
<li>Ball, H. J., McParland, B., Driussi, C., Hunt, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+vessels+from+the+mouse+brain+for+gene+expression+analysis+using+laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating vessels from the mouse brain for gene expression analysis using laser capture microdissection.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 206-213 (2002).</li>
<li>Murugesan, N., Macdonald, J., Ge, S., Pachter, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+CNS+microvascular+endothelium+by+immune-guided+laser-capture+microdissection+coupled+to+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the CNS microvascular endothelium by immune-guided laser-capture microdissection coupled to quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 755, 385-394 (2011).</li>
<li>Okada, S. L. M., Stivers, N. S., Stys, P. K., Stirling, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Ex+Vivo+Laser-induced+Spinal+Cord+Injury+Model+to+Assess+Mechanisms+of+Axonal+Degeneration+in+Real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), (2014).</li>
<li>Winkler, E. A., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+pericytes+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central nervous system pericytes in health and disease.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1398-1405 (2011).</li>
<li>Ezan, P., André, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+astroglial+connexins+weakens+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deletion of astroglial connexins weakens the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2012).</li>
<li>Simard, M., Arcuino, G., Takano, T., Liu, Q. S., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+at+the+gliovascular+interface%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Signaling at the gliovascular interface.</a> The Journal of neuroscience. 23 (27), 9254-9262 (2003).</li>
<li>Dubois, L. G., Campanati, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliomas+and+the+vascular+fragility+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gliomas and the vascular fragility of the blood brain barrier.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 418(2014).</li>
<li>Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+metabolically+active+capillaries+from+rat+brain1%2C2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of metabolically active capillaries from rat brain1,2.</a> Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).</li>
<li>Hjelle, J. T., Baird-Lambert, J., Cardinale, G., Specor, S., Udenfriend, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+microvessels%3A+the+blood-brain+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolated microvessels: the blood-brain barrier in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4544(1978).</li>
<li>Head, R. J., Hjelle, J. T., Jarrott, B., Berkowitz, B., Cardinale, G., Spector, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+brain+microvessels%3A+preparation%2C+morphology%2C+histamine+and+catecholamine+contents%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Vessels%22%5BJournal%5D)">Isolated brain microvessels: preparation, morphology, histamine and catecholamine contents.</a> Blood Vessels. 17 (4), 173-186 (1980).</li>
<li>Pardridge, W. M., Sakiyama, R., Coty, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+transport+of+vitamin+D+and+A+derivatives+through+the+rat+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Restricted transport of vitamin D and A derivatives through the rat blood-brain barrier.</a> Journal of neurochemistry. 44 (4), 1138-1141 (1985).</li>
<li>Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+and+canine+endothelial+cells+from+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels.</a> Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).</li>
<li>Luo, J., Yin, X., Sanchez, A., Tripathy, D., Martinez, J., Grammas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+endothelial+cells+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of endothelial cells from rat brain.</a> Methods Mol Biol. 1135, 357-364 (2014).</li>
<li>Munikoti, V. V., Hoang-Minh, L. B., Ormerod, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+digestion+improves+the+purity+of+harvested+cerebral+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic digestion improves the purity of harvested cerebral microvessels.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 80-85 (2012).</li>
<li>Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+brain+capillary+endothelial+cells+exhibit+improved+barrier+properties+under+the+influence+of+hydrocortisone%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone.</a> Brain Res. 1053 (1-2), 162-174 (2005).</li>
<li>Bowman, P. D., Betz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+capillary+endothelium+from+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Primary culture of capillary endothelium from rat brain.</a> In Vitro. 17 (4), 353-362 (1981).</li>
<li>Bowyer, J. F., Thomas, M., Patterson, T. A., George, N. I., Runnells, J. A., Levi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Visual+Description+of+the+Dissection+of+the+Cerebral+Surface+Vasculature+and+Associated+Meninges+and+the+Choroid+Plexus+from+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Visual Description of the Dissection of the Cerebral Surface Vasculature and Associated Meninges and the Choroid Plexus from Rat Brain.</a> Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).</li>
<li>Ohtsuki, S., Yamaguchi, H., Asashima, T., Terasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+Method+to+Isolate+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells+by+Magnetic+Cell+Sorting+and+Dominant+mRNA+Expression+of+Multidrug+Resistance-associated+Protein+1+and+4+in+Highly+Purified+Rat+Brain+Capillary+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Establishing a Method to Isolate Rat Brain Capillary Endothelial Cells by Magnetic Cell Sorting and Dominant mRNA Expression of Multidrug Resistance-associated Protein 1 and 4 in Highly Purified Rat Brain Capillary Endothelial Cells.</a> Pharmaceutical Research. 24 (4), 688-694 (2007).</li>
<li>Warren, M. S., Zerangue, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+gene+expression+profiles+of+ABC+transporters+in+brain+microvessel+endothelial+cells+and+brain+in+five+species+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human.</a> Pharmacological Research. 59 (6), 404-413 (2009).</li>
<li>Geier, E. G., Chen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Solute+Carrier+Transporters+in+the+Human+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Profiling Solute Carrier Transporters in the Human Blood-Brain Barrier.</a> Clinical Pharmacology and Therapeutics. 94 (6), 636-639 (2013).</li>
<li>Seetharaman, S., Barrand, M. A., Maskell, L., Scheper, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+Resistance-Related+Transport+Proteins+in+Isolated+Human+Brain+Microvessels+and+in+Cells+Cultured+from+These+Isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Multidrug Resistance-Related Transport Proteins in Isolated Human Brain Microvessels and in Cells Cultured from These Isolates.</a> Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1151-1159 (1998).</li>
<li>Urich, E., Patsch, C., Aigner, S., Graf, M., Iacone, R., Freskgard, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+self-assembled+spheroidal+model+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Multicellular self-assembled spheroidal model of the blood brain barrier.</a> Sci Rep. 3, 1500(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De bloed-hersenbarrière regelt de doorgang van fysiologische stoffen in en uit het CZS en beschermt tegen potentieel schadelijke stoffen in het bloed. Het is betrokken bij diverse CNS ziekten, waaronder neurodegeneratieve ziekten 2 en hersentumoren 28. De extreem lage permeabiliteit van de BBB belemmert ook de doorgang van therapeutische middelen gericht op neurale cellen en de ontwikkeling van methoden voornemens reversibel openen BBB zonder nadelige gevolgen voor de hersenen is een zeer actief on...

De correcte werking van het centrale zenuwstelsel (CNS) is een sterk gereguleerd extracellulaire omgeving en zijn metabole eisen zijn groot in vergelijking met andere organen 1. Het CNS is ook zeer gevoelig voor een groot aantal chemicaliën, algemeen onschadelijk perifere organen maar om het, neurotoxisch. Om een ​​correcte werking te garanderen, de meeste van de CNS &#39;vaatstelsel vormt een endotheliale barrière; de bloed-hersenbarrière (BBB), die de stroom van moleculen en ionen en de passage van immuuncellen tussen bloed en hersenen controleert, waardoor goede homeostase 2 handhaven, maar ook beperken van de intrede van therapeutische geneesmiddelen, waardoor belemmerd behandelingen neurologische aandoeningen 3. Op cellulair niveau wordt de BBB voornamelijk ondersteund door uitgebreide tight junctions tussen endotheelcellen, gepolariseerde expressie van efflux transporters en een zeer lage prijs transcytose 4. Eigenschappen en functies van de BBB worden meestal veroorzaakt door neighboring cellen 4. Vooral pericytes een belangrijke rol spelen bij het ​​induceren en handhaven van de BBB 5,6. Omdat contractiele cellen, pericyten reguleren ook de doorbloeding 7 net als de gladde spiercellen omliggende grote schepen. Tenslotte astrocyten, grote gliale cellen van de hersenen, om grote processen eindvoetjes van astrocyten ongeveer uitgeroepen meeste hersenen vasculatuur 8 en moduleren BBB integriteit en immune rust 9, de overdracht van metabolieten neuronen 10, en induceren de nauwe koppeling tussen neuronale activiteit en bloedstroom 11,12. De mogelijkheid om de moleculaire en cellulaire eigenschappen van het cerebrovasculaire systeem bestuderen cruciaal is om beter te karakteriseren zijn bijdrage aan de hersenen en fysiopathologie. Om deze vraag te pakken, hebben strategieën om cerebrovasculaire systeem van de hersenen te isoleren ontwikkeld, die het mogelijk maken voor de voorbereiding van de intacte fragmenten hersenen vat. Cerebrale vaartuig purification werd aanvankelijk beschreven met boviene hersenen 13 en verbeterd en aangepast aan andere diersoorten, vooral knaagdieren 14. In dit laatste onderzoek, het gebruik van filters van variërende grootte werd geïntroduceerd hersenvaten in fracties verrijkt in vaten van verschillende diameters te scheiden. Interessant is dat in dergelijke preparaten, endotheelcellen hielden hun metabolische eigenschappen 15, transporter functionaliteit 16 en 17 polarisatie. Hier beschrijven we in detail dit protocol en verder aan te tonen dat geïsoleerde schepen de meeste van hun behoud in situ constructies. Endotheelcellen blijven verbonden door krappe kruispunten en omgeven door een continue basale lamina. Pericyten en gladde spiercellen blijven de endotheliale laag, evenals perivasculaire astrocyten membranen bevestigd. Echter, astrocyten, microgliacellen, neuronen en oligodendrocyten geëlimineerd. Tenslotte beschrijven we een procedure uit te voeren immunokleuring op geïsoleerde vaten hersenen. </p&gt; Tot nu toe de meeste van de moleculaire en cellulaire studies over de cerebrovasculaire systeem zijn uitgevoerd op gezuiverd hersenen vat cellen gedissocieerd door-celsortering gebruik van mobiele specifieke reporter muis stammen of-immunokleuring gebaseerde procedures 18,19. Hoewel deze technieken maakt de isolatie van bijna zuiver cerebrovasculaire celpopulaties, geïsoleerde cellen volledig verliezen hun in situ morfologie en interacties, die op hun beurt sterk hun moleculaire en cellulaire eigenschappen beïnvloedt. Het protocol hier beschreven, waardoor de isolatie van hele cerebrovasculaire fragmenten zonder de noodzaak van specifieke antilichamen en transgene muizen vlekken, een goed alternatief de algemene structuur van geïsoleerde hersenvaten behouden dus vermindering weerslag op hun moleculaire eigenschappen. Geïsoleerde schepen kunnen dan worden gebruikt voor het bestuderen van de activiteit van genen, eiwitsynthese en regelgeving op de BBB zoals onlangs beschreven 20,21 </sup&gt;. Tot slot, in vergelijking met lasermicrodissectie 22,23 het huidige protocol is goedkoop, gemakkelijk uit te voeren en snel aanpasbaar aan een laboratorium.

<table><tbody><tr><td>Tissue Grinder Size C</td><td>Thomas scientific</td><td>3431E25</td><td></td></tr><tr><td>centrifuge 5415&nbsp;R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5811000320</td><td></td></tr><tr><td>High-performance, Modular Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Compact System Provides High Quality Leica LED1000</td><td>Leica</td><td>LED1000</td><td></td></tr><tr><td>low binding tips (P1000)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>14200T</td><td></td></tr><tr><td>Swinnex 47 mm filter holder PP 8/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=SX0004700">SX0004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Nylon net filter disc Hydrophilic 20 &micro;m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY2004700">NY2004700</a></td><td></td></tr><tr><td>Nylon net filter disc Hydrophilic 100 &micro;m 47 mm 100/Pk</td><td>Millipore</td><td><a href="http://www.millipore.com/catalogue/itemdetail.do?id=NY1H04700">NY1H04700</a></td><td></td></tr><tr><td>Standard Wall Borosilicate Tubing</td><td>Sutter Instrument</td><td>B150-86-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>1014356290F</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips, Thickness 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>P10143263NR1</td><td></td></tr><tr><td>0.2 ml Thin-walled tubes and domed cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0266</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;PARAFILM M (roll size 4 in. &times; 125 ft)</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>Life technology</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14175129">14175-129</a></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Life technology</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Dextran from Leuconostoc spp. Mr ~70,000</td><td>Sigma</td><td>31390</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Euromedex</td><td>ET330</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>bisBenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Mounting medium Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 488 Conjugate; Dilution 1/100</td><td>Life technology</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>Agrin (rabbit) ; dilution 1/400</td><td>kindly provided by Dr Markus A Ruegg</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti ZO-1 (mouse, clone 1A12)</td><td>Life technology</td><td>33-9100</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti Smooth Muscle Actin (mouse, clone 1A4)</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>&nbsp;dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti GFAP (mouse, clone GA5)</td><td>Sigma</td><td>G3893</td><td>&nbsp;dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti AQP4 (rabbit)</td><td>Sigma</td><td>A5971</td><td>&nbsp;dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti Cx43 (mouse, Clone&nbsp; 2)</td><td>BD Biosciences</td><td>610061</td><td>&nbsp;dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti Olig2 (rabbit)</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>&nbsp;dilution 1:200</td></tr><tr><td>Anti NF-M (mouse)</td><td>provided by Dr Beat M. Riederer, University of Lausanne, Switzerland.</td><td>&nbsp;dilution 1:10</td><td></td></tr><tr><td>Anti Iba1 (rabbit)</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>&nbsp;dilution 1:400</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technology</td><td>A11029</td><td>&nbsp;dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Life technology</td><td>A11034</td><td>&nbsp;dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td><td>Life technology</td><td>A21424</td><td>&nbsp;dilution 1:2,000</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Life technology</td><td>A21429</td><td>&nbsp;dilution 1:2,000</td></tr></tbody></table>

zuivering van mouse brain schepen

Purification of Mouse Brain Vessels

In de hersenen meeste vasculaire systeem bestaat uit een selectieve barrière, de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​de uitwisseling van moleculen en immuuncellen tussen de hersenen en het bloed regelt. Bovendien is de enorme neuronale metabolische vraag vereist van moment tot moment regulering van de bloedstroom. Met name afwijkingen van deze verordeningen zijn etiologische kenmerken van de meeste hersenen pathologieën; zoals glioblastoom, beroerte, oedeem, epilepsie, degeneratieve ziekten (ex: ziekte van Parkinson, ziekte van Alzheimer), hersentumoren, alsook inflammatoire aandoeningen zoals multiple sclerose, meningitis en sepsis-geïnduceerde hersenendysfuncties. Dus, het begrijpen van de signalering gebeurtenissen moduleren van de cerebrovasculaire fysiologie is een grote uitdaging. Veel inzicht in de moleculaire en cellulaire eigenschappen van de verschillende celtypen die het cerebrovasculaire systeem samengesteld kan worden verkregen uit primaire cultuur of celsortering van vers gedissocieerde hersenweefsel. Echter,eigenschappen zoals mobiele polariteit, morfologie en intercellulaire verhoudingen niet gehandhaafd in dergelijke preparaten. Het protocol dat hier beschreven is ontworpen om hersenen vat fragmenten te zuiveren met behoud van structurele integriteit. We tonen aan dat geïsoleerde vaten bestaan ​​uit endotheliale cellen afgedicht door tight junctions die worden omringd door een continue basale lamina. Pericyten, blijven gladde spiercellen en de perivasculaire astrocyt eindvoetjes van astrocyten membranen de endotheellaag bevestigd. Tot slot beschrijven we hoe immunokleuring experimenten uit te voeren op gezuiverd hersenen schepen.

Hier, een protocol waardoor de mechanische isolatie van de hersenen schepen 14 beschrijven we. Figuur 1 geeft een overzicht van de belangrijkste stappen van deze techniek. De architectuur van de hersenvaten is ingewikkeld en omvat verschillende celtypes, dwz endotheelcellen verzegeld door tight junctions omgeven door pericyten, gladde spiercellen, en astrocyten voet 9 processen. Aldus, na isolering van de hersenvliezen, wilden wij de structuur van gezuiverde vaartuigen kar...

We beschrijven een protocol dat de zuivering van het vasculaire compartiment van de muizenhersenen mogelijk maakt. Geïsoleerde hersenvaten omvatten endotheelcellen die zijn verbonden door strakke verbindingen en omringd door een continue basale lamina, pericyten, vasculaire gladde spiercellen, evenals perivasculaire astrogliale membranen.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

In the brain, most of the vascular system consists of a selective barrier, the blood-brain barrier (BBB) that regulates the exchange of molecules and ...

Het algemene doel van deze procedure is om het vasculaire compartiment van de muizenhersenen te zuiveren terwijl de structurele integriteit behouden blijft, door middel van een reeks centrifugaties bij lage snelheid en filtraties, zonder dat specifieke antilichamen of transgene stammen nodig zijn. Er is veel getracht om technieken te ontwikkelen die cellulaire, moleculaire en farmacologische onderzoeken naar de bloed-hersenbarrière mogelijk maken. Door het ontbreken van scheidingsstappen, gradiënten, kolommen of centrifugaties bij hoge snelheid is de zuivering van hersenvaten via deze procedure zeer eenvoudig, snel en goedkoop.De hersenvaten blijven structureel intact, waarbij de endotheelcellen zijn afgesloten door tight junctions en omringd worden door de basale lamina, vasculaire gladde spiercellen en perivasculaire astrocytAire membranen. Dit protocol kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de functie van het vasculaire compartiment van de bloed-hersenbarrière en maakt het mogelijk om de moleculaire samenstelling ervan te bestuderen; de procedure wordt gedemonstreerd door een postdoc uit het team van Martin Coen S. Snijd, voordat u met de procedure begint, de onderkant van het bovenste schroefgedeelte van de filterhouder af.Gebruik vervolgens een scalpel om de huid van de nek van de muis tot aan de neus in te snijden en trek de huid terug. Was de schedel met PBS om eventuele vervuilende haren te verwijderen en steek vervolgens een schaar in de schedel anterieur aan de bulbi olfactorii. Open de schaar om de schedel in stukken te breken en verwijder de hersenen met de spatel.Dissect vervolgens de plexus choroideus uit de laterale ventrikels en breng de hersenen over naar een bekerglas van 150 milliliter met 20 milliliter B one-oplossing op ijs. Gebruik daarna twee scalpels om de hersenen krachtig te hakken in weefselfragmenten van twee millimeter, en gebruik een automatische homogenisator om het weefsel op ijs te homogeniseren gedurende 20 slagen bij 400 RPM. Om de vaten te zuiveren, brengt u het homogenaat over naar een plastic buis van 50 milliliter en centrifugeert u de weefselbrij.In een centrifuges met een zwaairotor vormt zich bovenop het pellet in het vat een grote witte interface die voornamelijk uit myeline bestaat. Verwijder het supernatant en voeg 20 milliliters ijskoude B twee-oplossing toe, waarna de buis één minuut krachtig wordt geschud. Na een tweede centrifugatie vormt de myeline een dichte witte laag aan het oppervlak van het supernatant.Draai de buis langzaam zodat de B twee-oplossing langs de wand naar beneden loopt terwijl deze wordt weggegoten, en verwijder het myeline samen met het supernatant. Gebruik vervolgens een plastic pipet omwikkeld met absorberend papier om eventueel resterende vloeistof van de wanden van de buis te verwijderen. Pas op dat u het pellet van de vaten niet aanraakt en plaats de buis ondersteboven op ijs.Resuspendeer vervolgens de pellet in één milliliter ijskoude B3-oplossing, gevolgd door de toevoeging van nog eens vijf milliliter B3-oplossing, waarbij u erop let dat de blaasjes geen aggregaten vormen. Plaats nu een nylon mesh-filter van 20 micron bovenop een Bekerglas en equilibreer het filter met 10 milliliter ijskoude B3-oplossing. Giet de preparatie van de blaasjes door het filter en spoel de blaasjes voorzichtig na met nog eens 40 milliliter ijskoude B3-oplossing.Gebruik vervolgens schone pincetten om het filter onmiddellijk over te brengen naar een bekerglas met 30 milliliter verse B three-oplossing, en laat de vaten van het filter los door voorzichtig te schudden. Giet de inhoud van het bekerglas in een plastic buis van 50 milliliter. Resuspendeer na centrifugatie de pellet in één milliliter ijskoude B three-oplossing voorafgaand aan de immunokleuring.Breng de vaten over naar 0,2 milliliter PCR-buisjes en plaats de buisjes op ijs totdat het weefselsediment zich op de bodem van de buisjes heeft afgezet. Gebruik vervolgens gel-laadpunten om het grootste deel van de vloeistof op te zuigen. Plaats daarna een gesiliconiseerde glazen capillair van 40 micrometer in een P 200 pipetpunt en gebruik de capillair om de vaten over te brengen naar een objectglas; wanneer de vaten zijn neergedaald, wordt de vloeistof voorzichtig verwijderd met een stukje absorberend papier.Breng vervolgens een enkele druppel montage medium aan op de vaten en plaats een dekglas onder een hoek van 45 graden, zodat het montage medium langs de rand van het glas kan verspreiden totdat het dekglas op zijn plaats zit. In deze afbeelding kan continue RIN-labeling rond neurale endotheelcellen worden waargenomen, wat de retentie van de basale lamina op de gezuiverde vaten bevestigt. Componenten van de endotheliale tight junctions, zoals ZO one, worden eveneens gedetecteerd op de gezuiverde vaten.Verder wijzen NG2- en gladspieractine-labeling respectievelijk op het behoud van intacte parasieten en vasculaire gladspiercellen. Perivasculaire astrogliaire membraaneiwitten connexine 43 en aquaporine 4 worden ook gedetecteerd aan het oppervlak van de gezuiverde vaten, wat duidt op het aanvullende behoud van perivasculaire astrocytenmembranen tijdens het zuiveringsproces; er worden echter slechts verspreide en korte GFAP-positieve vezels waargenomen op de geïsoleerde vaten, wat onthult dat de cellichamen van de astrocyten niet zijn meegezuiverd. Slechts enkele neuronale vezels blijven aan de vaten gehecht.Op dezelfde manier worden er geen IBA one- en oli two-positieve cellen gedetecteerd, wat bevestigt dat microglia en oligodendrocyten niet samen zijn gezuiverd. Wij raden dringend aan om de huidige plexus te verwijderen vóór homogenisatie van de hersenen, aangezien wij dit hebben ervaren als een mogelijke bron van contaminatie; werk in een schone omgeving en voorkom contaminatie door haar en stof, aangezien antilichamen een hoge aspecifieke affiniteit hebben voor deze materialen.Het is daarnaast belangrijk om altijd ook een kernkleuring uit te voeren. Het is mogelijk om bloedcellen uit de gezuiverde vaten te verwijderen door voorafgaand aan de vatextractie een intracardiale perfusie met PBS uit te voeren. Wij hebben met succes RNA en eiwitten geëxtraheerd uit vaten die via deze procedure zijn gezuiverd, zowel uit vers bereide als uit ingevroren vatpellets.We hebben ook fluorescente probes en confocale microscopie gebruikt om de ex vivo endotheliale transportfunctie van de vaten te bestuderen. We wensen u veel succes met uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel presenteren we een eenvoudige, praktische techniek voor cerebrovasculaire gieten, dat is eenvoudig uit te voeren en kan worden gebruikt om het imago van de vasculaire boom van de volwassen hersenen van muizen.

Cerebrovasculaire Gieten van de volwassen muis voor 3D Imaging en morfologische analyse

This video demonstrates the isolation of intact vessels from a mouse's brain that constitute the blood-brain barrier (BBB) along with neurons and glial cells. The isolated vessels can be used as an in vitro model to study their role in maintaining brain homeostasis.

Isolating Mouse Brain Vessels: A Protocol to Isolate Intact Vessels from Murine Brain Sample

This video demonstrates the isolation of capillaries from fresh porcine brains. The process involves removing the meninges, isolating the grey matter from the brain tissue, homogenizing and filtering the grey matter to isolate the capillaries, and finally using enzymatic digestion to purify the capillaries further.

Purifying Capillaries From a Porcine Brain

This video demonstrates a method for isolating cerebral pericytes from a mouse brain. The isolated cells are cultured in pericyte-specific media to promote pericyte proliferation.

Isolating and Culturing Mouse Cerebral Pericytes

This video demonstrates a method for isolating the endothelial tubes from mouse cerebral parenchyma. Through a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation, the process yields an intact tube with endothelial cells.

Preparing Cerebral Endothelial Tubes from Mouse Parenchymal Arterioles

Hersenmicrovasculaire endotheelcellen (BMEC) zijn onderling verbonden door specifieke junctionele eiwitten die een sterk gereguleerde barrière vormen die bloed en het centrale zenuwstelsel (CZS) scheiden, de zogenaamde bloed-hersenbarrière (BBB). De isolatie van primaire muis-hersenmicrovasculaire endotheelcellen, zoals besproken in dit protocol, maakt gedetailleerde in vitro studies van de BBB mogelijk.

Isolatie van Primary Muriene Brain microvasculaire endotheelcellen

We beschrijven hier een reproduceerbaar protocol voor het isoleren van de muis cirkel van Willis.

Protocol voor het isoleren van de muis Cirkel van Willis

We presenteren een protocol voor de extractie van Murine cerebrale pericytes. Gebaseerd op een antibioticum-vrije verrijkings georiënteerde pericyte extractie, is dit protocol een waardevol hulpmiddel voor in vitro studies die een hoge zuiverheid en hoge opbrengst bieden, waardoor het aantal gebruikte proefdieren afneemt.

Een hoge Uitvoermethode om cerebrale Pericytes van de muis te isoleren

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca2 +] en membraanpotentiaal.

Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

We demonstreren chemisch inducerende grote bloedvatverwijding bij muizen als een model voor het onderzoeken van cerebrovasculaire disfunctie, dat kan worden gebruikt voor modellering van vasculaire dementie en de ziekte van Alzheimer. We demonstreren ook het visualiseren van het vaatstelsel door het injecteren van een siliconenrubbersamenstelling en het bieden van duidelijke visuele richtlijnen voor het meten van veranderingen in de grootte van bloedvaten.

Een visuele benadering voor het induceren van dolichoectasia bij muizen om door grote bloedvaten gemedieerde cerebrovasculaire disfunctie te modelleren

Leer de zuivering van hersenvaten bij muizen met behoud van structurele integriteit via centrifugatie en filtratie. Deze methode vereist geen antilichamen en maakt bloed-hersenbarrièreonderzoek mogelijk.

Zuivering van Mouse Brain Schepen

Meer video's verkennen