Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Het algemene doel van het volgende experiment is om herhaalde metingen mogelijk te maken van de hydraulische geleidbaarheid of waterpermeabiliteit van de wanden van ulaire microvaten in het rattenmesenter onder gecontroleerde experimentele omstandigheden. Dit wordt bereikt door een ulair microvat te canuleren, zodat de oncotische en hydrostatische druk in het lumen kan worden ingesteld en de chemische samenstelling van het perfusaat nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Vervolgens wordt het vat afgesloten en kunnen rode bloedcellen die in het perfusaat zijn gesuspendeerd, welke dienen als stroommarkers, worden waargenomen terwijl ze door het lumen bewegen als indicatoren voor transvasculaire vloeistofuitwisseling.

Vervolgens worden de positie en snelheid van de marker-rode cellen geregistreerd, zij het in de richting van de occlusieplaats of ervan af. Ten slotte wordt de occlusie opgeheven en herhaald voor aanvullende metingen, of het vat wordt opnieuw gecannuleerd en worden de metingen onder gewijzigde omstandigheden herhaald.

Uiteindelijk kunnen gepaarde metingen van de hydraulische conductiviteit onder controle- en testcondities worden uitgevoerd om het meest directe onderzoek naar de factoren die de doorlaatbaarheid van microvaten reguleren, mogelijk te maken. Een voordeel van de gemodificeerde Landis-techniek om de regulatie van capillaire permeabiliteit te onderzoeken, is de perfusiestap. Microperfusie maakt het mogelijk om de permeabiliteit van de microvatwand te meten onder condities waarbij de samenstelling van het perfusaat, het uitwisselingsoppervlak en de druk in de microvaten allemaal direct worden gecontroleerd.

Deze methode kan vragen beantwoorden over de cellulaire en moleculaire mechanismen van permeabiliteitsregulatie in microvaten die representatief zijn voor intacte organen, en kan een vergelijking mogelijk maken met resultaten van gecultiveerde endotheliale monolagen, die vaak worden gebruikt om de details van moleculaire mechanismen te onderzoeken. Onze protocoldemonstratie wordt verzorgd door Joyce Clark, onze laboratoriummanager. Joyce is tijdens haar tijd hier als laboratoriummanager verantwoordelijk geweest voor veel van de verbeteringen in dit protocol.

Gebruik als eerste een elektronische puller om diverse schone borosilicaatglazen capillaire buisjes te vormen tot taps toelopende helften, elk met een puntlengte van ongeveer één centimeter, met behulp van een luchtaangedreven slijpwiel en een 0,5 micron schuurpapier in een waterbad en een micropipethouder die in een hoek van 30 graden ten opzichte van de horizontale schuinte van de micropipetten is ingesteld. Selecteer na het wassen en drogen van de micropipetten volgens het tekstprotocol micropipetten met een opening van ongeveer 50 micron lang en een verhouding tussen de lengte en breedte van de schuinte tussen 3,1 en 3,5. Deze moeten tevens een scherp toelopende punt hebben, wat helpt bij het penetreren van de taaie collageenvezels in het mesenterium.

Om fixatiehulpmiddelen te maken, houdt u kortstondig een niet-afgeschuinde, uitgetrokken glazen capillair nabij een microvlam om een stomp uiteinde te vormen. Herhaal dit om meerdere fixatiehulpmiddelen te maken en bewaar deze in een stofvrije doos. Maak vervolgens micro-occlusies door een niet-afgeschuinde, uitgetrokken capillaire buis onder een hoek in een microvlam te houden en gebruik een slangadapter of een gebroken micropipet om de buis voorzichtig ongeveer vier millimeter vanaf de punt in een hoek van circa 120 graden te buigen.

Met betrekking tot de schacht is het belangrijk dat de punt neither in de vlam is dichtgesmolten noch is afgebroken. Na het anesthetiseren van een rat en het positioneren van het mesenteriaal weefsel en de darm volgens het tekstprotocol, plaatst u de dierenschaal op de microscooptafel zodat het mesenterium zichtbaar is door de oculairs. Positioneer een door zwaartekracht gevoede druppellijn met ringer-oplossing voor zoogdieren voor een continue perfusie.

Gebruik vervolgens gaasjes bij het mesenterium om de darm op zijn plaats te houden, te helpen het vocht vast te houden en overtollige Ringer-oplossing van het oppervlak te absorberen, pas de doorstroming aan en aspireer het effluent om een constante laag te behouden, identificeer de doelmicrovaten, welke onvertakte segmenten zijn stroomafwaarts van convergente stroming en één of twee vertakkingen distaal van de echte capillairen. Zoek een onvertakt vat met een snelle bloedstroom en zonder witte bloedcellen die aan de vaatwand kleven. Positioneer de testmicrovaten in het centrum van het microscopieveld en breng de fixeerder in positie nabij de gekozen canulatieplaats.

Om de micropipet te vullen, zuigt u perfuse eight en gewassen erytrocyten op in een spuit die is voorbereid volgens het tekstprotocol; zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang aanwezig zijn. Schuif de slang in het brede uiteinde van de micropipet tot deze tegen het taps toelopende gedeelte aanstoot. Oefen een zachte, snelle druk uit op de zuiger van de spuit om de tip van de micropipet te vullen.

Wanneer de pipet vol is, verschijnt er een klein stroompje of een druppel aan de punt. Duw tijdens het terugtrekken van de slangetjes voorzichtig op de plunjer om de schacht van de micropipet te vullen. Verwijder vervolgens kleine luchtbellen in de schacht door er voorzichtig tegenaan te tikken.

Plaats de micropipet vervolgens in een pipethouder met een zijpoort die een continue vloeistofverbinding met een watermanometer mogelijk maakt. Zorg ervoor dat de houder, die is bevestigd aan een hydraulische aandrijving en micromanipulator, onder een lichte horizontale hoek is ingesteld zodat de rand van de taps toelopende micropipet de darm of de tray niet raakt. Pas met een spuit of een met water gevulde rubberen peer de hydrostatische druk op de vloeistof in de micropipet aan door de hoogte van de vloeistofkolom in de manometer aan te passen tot ongeveer 40 centimeter water boven het mesenterium.

Voordat de gevulde micropipet onder de microscoop wordt geplaatst, drukt u de klem voorzichtig op het weefsel nabij de microvaten, waarbij voldoende kracht wordt uitgeoefend om het weefsel vast te pakken. Trek de klem vervolgens iets terug, zodat het weefsel in lijn met de microvaten wordt uitgerekt en de spanning in de collageenvezels van het mesenterium wordt uitgelijnd met het vat. Lijn de micropipet uit met het vat en breng deze in het gezichtsveld via de oculairs. Plaats de punt net stroomopwaarts van de gekozen canulatieplaats en laat deze op het weefsel zakken, zodat de stroming in het vat gedeeltelijk wordt belemmerd, maar niet volledig wordt afgesloten.

Cannuleer het vat met behulp van de hydraulische aandrijving door de pipetpunt langzaam in het lumen van het vat te drijven, waarbij u er op let dat u de punt niet door de tegenovergestelde zijde van het vat duwt. Zodra de micropipet het lumen binnendringt, zal het perfusaat het bloed snel uit het lumen van het vat spoelen en de circulatie binnengaan. Verlaag de perfusiedruk door de manometer aan te passen totdat de rode bloedcellen zachtjes oscilleren in het lumen van het vat.

Hiermee wordt de balansdruk bepaald, waarmee de hydrostatische druk in de microvaten of de PC aan het distale uiteinde van het microvatsegment wordt gemeten. Handhaaf de perfusie van het vat boven deze balansdruk om micro-occlusie uit te voeren. Plaats de blocker met behulp van video en audio boven het geperfuseerde vat, nabij de onderste rand van het microscopieveld.

Registreer mondeling de locatie van de blokkeringsplaats zoals gezien in het rode I-stuk. De blokkeringsplaats is 57 Met de punt van de blokkeerder net boven het microvat geplaatst. Gebruik de fijne Z-bediening van de micromanipulator om de blokkeerder voorzichtig te laten zakken tot de doorstroming in het vat is afgesloten.

Gebruik audio om de druk op de manometer te noteren. De druk is 50. Pas vervolgens gedurende drie tot 10 seconden occlusie toe en laat deze weer los.

Om de vrije perfusie te herstellen, verplaatst u de blokkadeplek in stappen van 5 tot 10 micron stroomopwaarts in het vat richting de pipetpunt, waarbij u op elke locatie niet meer dan drie tot vijf occlusies uitvoert om schade aan de vaatwand op de blokkadeplek te voorkomen. Analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Dit tijdverloop meet de veranderingen in de hydraulische conductiviteit of LP in ratulaire microvaten die succesvol zijn gecannuleerd met vier perfuse eights.

De grootte van de LP bij constante druk werd gebruikt om veranderingen in microvaten te meten. Wandpermeabiliteit bij perfusie met 1% BSA als controle versus 10 molar van het inflammatoire agens bradykinine of bk. Zoals hier wordt getoond, veroorzaakte BK een voorbijgaande toename van de LP die binnen 10 tot 15 minuten terugkeerde naar controleniveaus.

Nadat de basiswaarden waren hersteld met 1% BSA 10 nanomolair, werd BK opnieuw geperfuseerd samen met één micromolair pH scene one fosfaat of S one P. De resultaten geven aan dat S one P de respons op bk significant dempte. Voor sommige experimentele ontwerpen is het belangrijk om zowel de solutereflectiecoëfficiënt voor een macromolecuul als de lp te schatten.

Dit wordt het beste bereikt door JV bij meerdere drukken in elk individueel microvat te meten. In dit experiment werden zowel de LP als de effectieve oncotische druk van 5% albumine in het PERFUSE-medium geschat, terwijl er geen albumine aanwezig was in het weefsel rondom de microvaten. JV over S werd gemeten bij drie verschillende drukken en hier uitgezet.

De LP is de helling van de relatie tussen JV over S en de druk, en het snijpunt op de druk-as is het effectieve oncotische drukverschil over de vaatwand. In combinatie met andere technieken, zoals immunofluorescente labeling en confocale microscopie, of zelfs transmissie-elektronenmicroscopie, biedt microperfusie een krachtige analyse van de microvasculaire endotheel- en functie met behulp van vaten met een bekende permeabiliteit. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u herhaalde metingen van de hydraulische conductiviteit of waterpermeabiliteit van capillaire microvaten in het mesenterium van de rat kunt uitvoeren onder gecontroleerde experimentele omstandigheden.

Deze benadering kan worden toegepast in momenteel beschikbare ratmodellen, maar ik ben vooral geïnteresseerd in de mogelijkheid dat deze kan worden gebruikt in nieuwe genetisch gemodificeerde ratten die beschikbaar zullen komen door de CRISPR Cas nine-technologie, en ik hoop dat deze methode op die manier wordt uitgebreid.