Name: Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer de gemodificeerde Landis-techniek om hydraulische geleidbaarheid van microvaten in rattenmesenterium te meten. Deze methode maakt herhaalde metingen van microvatdoorlaatbaarheid onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies HL44485 en HL28607.

Ethiek Verklaring: Alle procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. Voorafgaande Fabrication van Micropipetten, fixeren en blokkers <ol><li> Trek verscheidene schone borosilicaatglas capillairen doormidden met een elektronische puller ingesteld dat, wanneer teruggetrokken, de gestrekte deel van de buis ongeveer 1 cm in lengte en de twee helften enigszins symmetrisch. Zorg dat de tapsheid in overeenstemming met de afmetingen in figuur 1. Gebruik beide helften van micropipetten, restrainers en blockers. <ol><li> Bevel de micropipetten met behulp van een lucht aangedreven slijpschijf 30 met 0,5 micrometer schuurpapier gebaad met water. Stel de hoek van de micropipet houder, zodat het ongeveer 30 graden van horizontaal. </li><li> Grondig te wassen en drogen van de micropipetten met behulp van zuigkracht om schone aceton trekken door de tip en de schacht. Inspecteer de micropipetten (Figuur 1A) met behulp van een kleine rechtopstaande microscoop met 4 × en 40 × doelstellingen voorzien van een alligator clip micropipet houder en een oculair dradenkruis. </li><li> Selecteer micropipetten met tip opening ongeveer 50 micrometer lang met een schuine kant waarvan de lengte / breedte verhouding is tussen de 3.1 en 3.5 en met een sterk taps toelopende punt dat helpt doordringen in de taaie collageen vezels in het mesenterium. </li><li> Slaan 15-20 micropipetten van lichtjes verschillende grootte in een stofvrije doos. </li></ol></li><li> Maak restrainers met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken glas capillair kort bij een MICROVLAM een stomp uiteinde (Figuur 1B) te vormen. Opslaan meerdere in een stofvrije doos. </li><li> Maak microoccluders met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken capillaire buis onder een MICROVLAM buigt (met een slang adapter, bijv., 23G), de dunne stift (ongeveer 4 mm van top) tot een hoek van bijna 120 graden maakt met de as ( <strong&gt; figuur 1C). Maken en op te slaan meerdere. </li></ol> 2. Animal Voorbereiding en Chirurgie <ol><li> Verdoven mannelijke (350-450 g) of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (200-300 g) met pentobarbital natrium (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subcutane injectie; beschermen mesenterium door geen intraperitoneale injectie. </li><li> Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen houden verdoofd door aanvullende injecties (30 mg / kg) indien nodig. Bepaal de diepte van de anesthesie door teen knijpen of cornea reflex. Na voltooiing van de experimentele procedure, euthanaseren de rat via overdosis pentobarbital of intracardiale injectie van een verzadigde kaliumchloride onder verdoving. </li></ol> 3. Bereid Solutions en Erythrocyten voor gebruik als Flow Markers <ol><li> Bereid zoogdieren Ringer&#39;s oplossing voor superfusate en controle perfusaat oplossing (kenmerkend zoogdieren Ringer&#39;s oplossing bevattende 10 mg / ml vetzuurvrij runderserumalbumine, BSA). <ol><li> Filter perfusaat door 0,2 um spuit filters om minuscule deeltjes die de micropipet tip kunnen blokkeren te verwijderen; filter in kleine schone container. </li></ol></li><li> Bereid erytrocyten door trekken ongeveer 0,2 ml bloed uit de staartader van de verdoofde rat in een 20G naald op een kleine spuit met 0,05 ml heparine (1000 U / ml) en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis bevattende ongeveer 14 ml zoogdier oplossing van Ringer-oplossing . <ol><li> Centrifuge zachtjes pak rode cellen (ongeveer max 200 xg gedurende 7 min). Trekken uit het supernatant en resuspendeer de rode cellen in Ringer-oplossing. </li><li> Na centrifugeren en verwijderen van supernatant driemaal verlaten het verpakte rode cellen op de bodem van de buis voor later gebruik. Merk op dat deze procedure kan bloedplaatjes in het uiteindelijke perfusates tot minder dan 0,1% van het normale niveau 31. </li></ol></li></ol> 4. Schik de Tissue op de AnimalDienblad <ol><li> Scheren de buik van de verdoofde rat van onder de navel tot zwaardvormig proces. Zorg ervoor dat het geschoren gebied strekt zich uit rond de rechterzijde (voor rat geplaatst aan de rechterkant), zodat haar niet vormen een lont aan de superfusate trekken uit van het weefsel ook. Verwijder gesneden haren met een natgemaakte gaasje of weefsel. <ol><li> Houd de huid met een stompe getande pincet en een middellijn incisie (2-3 cm lang) door de huid met behulp van een stevige schaar. Met een fijne (iris) schaar maken een soortgelijke incisie door de linea alba, het opheffen van de buikwand met gekartelde tang om te voorkomen dat schade aan de darmen. </li><li> Met het dier op zijn kant op het dier lade, trek de darmen uit de buikholte met behulp van wattenstaafje applicators (houten stok) gedrenkt in Ringer&#39;s oplossing en stompe gekartelde tang. Schik de darm in het weefsel goed, zodat het mesenterium is gedrapeerd over de pilaar voor het bekijken door de microscoop (pote zorg om te voorkomen dat het aanraken van het mesenteriumntially beschadigen microvaten) met ofwel een tang of katoen. Opmerking: Het dier tray (figuur 2A) kan worden geconstrueerd uit plexiglas en vereist een weefsel vormt (ongeveer 3 mm diep), een optisch helder pijler (bijvoorbeeld gepolijst kwarts ongeveer 2 cm diameter en 5 mm hoog.), En een verwarmingskussen aangepast aan de temperatuur van het dier te handhaven. De dikte van de pijler mag niet hoger zijn dan de werkafstand van de doelstelling. </li></ol></li><li> Plaats het dier lade op de microscooptafel zodat het mesenterium zichtbaar door de oculairs. </li><li> Positioneer een zwaartekracht gevoede infuus lijn continu superfuse het mesenterium met zoogdieren Ringer&#39;s oplossing gehandhaafd op 35-37 ° C. Gebruik gaasjes aan de darm zijn plaats te houden, helpen vocht vasthouden, en lont overtollige Ringer&#39;s oplossing van het oppervlak. Pas de doorstroming en zuig het effluent een consistente superfusate dikte behouden. </li><li> Identificeren doel venulaire haarvaten, dievertakte segmenten benedenstrooms van convergerende stroming, één of twee vertakkingen distaal true capillairen. Vind een onvertakte vat (idealiter 600 tot 1000 urn lang) met stevige bloedstroom en vrij van witte bloedcellen plakken op de vaatwand. </li><li> Positioneer de test microvaatje in het midden van het veld microscoop en zet de restrainer in positie in de buurt van de gekozen cannulatie website. </li></ol> 5. Vul Micropipet en Mount in Holder <ol><li> Net voordat cannuleren, schorten de rode cellen in het perfusaat. Voeg 7 pl erytrocytenconcentraat met 0,5 ml perfusaat in een schone reageerbuis boorsilicaat. Opmerking: hematocriet van 1-3% kunnen worden gebruikt, maar consistente hematocriet leiden tot consistente perfusaat concentraties van stoffen die vrijkomen uit de erytrocyten. </li><li> Breng een 1 ml spuit met een 23G slangadapter en PE-50 buizen (5-15 cm lengte). Trek het perfusaat / rode cel mengsel in de spuit. Omkeren spuit te mengen en te verdrijven alle luchtbellen uit slangen enadapter. Voor een hogere efficiëntie, pasvorm slang aan verschillende spuiten voor het experiment begint en bewaar ze in een stofvrije doos of plastic zak. </li><li> Vul het micropipet door het bevorderen van de slang in het grote einde van de micropipet totdat het aanligt tegen de taps toelopende regio. Breng een zachte snelle druk op de zuiger om de micropipet tip vullen. Opmerking: Een kleine stroom of een druppeltje moet zichtbaar zijn op de tip om volledige vulling bewijs. </li><li> Trek de buis, terwijl zachtjes te duwen op de zuiger om het bredere deel van de micropipet as te vullen. Verwijder kleine belletjes in de brede as door voorzichtig flicking de micropipet as. Opmerking: Een soortgelijke procedure is geïllustreerd 32. </li><li> Plaats de micropipet in een pipet houder met een zijpoort die een continue vloeistof verbinding met een water manometer maakt. Opdat de houder, die een hydraulische aandrijving worden gebruikt om zeer fijne voortbeweging van de micropipet controle is bevestigd is onder een kleine hoek (15-25 °)de horizontale zodat de rand van de micropipet tapsheid heeft de darm of bak niet raken. </li><li> Monteer de hydraulische aandrijving op een beweegbare micromanipulator, waarin x, y en z-drives moet nauwe afstemming op de proef vat (figuur 2) in te schakelen. </li><li> Stel de hydrostatische druk waarbij de vloeistof in de micropipet met een injectiespuit of met water gevulde rubberen bol om de hoogte van de vloeistof verandert de waterkolom van de manometer tot ongeveer 40 cmH 2 O boven het mesenterium. </li><li> Canule het microvaatje zo snel mogelijk na het vullen van de pipet; rode cellen naar de bodem van de pipet, zodat na ongeveer 40 min weinig rode cellen stroomt in het vat. </li></ol> 6. Microcannulation en microvasculaire Pressure Measurement <ol><li> Voor het positioneren van de gevulde micropipet onder de microscoop, druk de weerhouder op het weefsel nabij het microvaatje toepassing van voldoende kracht te grijpen het weefsel. Teken desteunkorven rug enigszins uitrekken het weefsel in overeenstemming met de microvaatjes, zodat de spanningen in het mesenteriale collageenvezels zijn afgestemd op het vat. <ol><li> Lijn de micropipet met het schip en laat deze in het oog door de oculairs. Plaats de punt juist stroomopwaarts van de gekozen canulatieplaats en laat deze op het weefsel, zodat deze gedeeltelijk belemmert stroming binnen het vat, maar niet te verstoppen. </li></ol></li><li> Canule het schip door het rijden van de pipet langzaam in het vat lumen met behulp van de hydraulische aandrijving. Wees niet te duwen door de onderkant van het schip. Opmerking: Als de micropipet komt het lumen, het perfusaat snel wast het bloed in het vat buiten het lumen en perfusievloeistof vrij stroomt in omloop distaal van het dier op de proef microvaatje, verplaatsen van sommige van de normale doorbloeding in de downstream vaten. </li><li> Verlaag de perfusiedruk door aanpassing van de manometer totdat het bloed (zoals aangegevendoor het dier rode bloedcellen) wordt terug getrokken in de perfusie segment; Dit bepaalt de balans druk waarbij de erytrocyten voorzichtig oscilleren in het lumen van het vat en meet de hydrostatische microvaatje druk (Pc) aan het distale uiteinde van het microvaatje segment. Onderhouden schip perfusie bij elke druk boven deze balans druk. </li></ol> 7. Microocclusion en verzameling van gegevens <ol><li> Optionele stap: Voor het gebruik van de micro-occluder om het schip te blokkeren, druk in het weefsel in een niet-gebruikte gedeelte van mesenterium ver van een schip, zodat de punt accumuleert een boete pad van weefsel dat de experimentele vaartuig beschermt tijdens herhaalde micro- afsluitingen. </li><li> Plaats de blocker boven de geperfuseerde vat nabij de onderrand van het veld microscoop. </li><li> Noteer de volgende met video en audio. <ol><li> Verbaal noteer de locatie van de blokkadelocatie en onderste schermrand zoals op het oculair reticule. </li><li> Met de puntvan de blocker geplaatst boven het microvaatje, met de fijne z controle van de micromanipulator voorzichtig lager de blocker totdat de stroming in het vat is afgesloten. Let op de manometer druk (Pc) met audio. Solliciteer occlusie meestal voor 3-10 seconden, en dan los, het herstel van gratis perfusie. Verplaats de blokkadelocatie het vaartuig naar de pipetpunt in 5-10 micrometer stappen basis van tijd (&gt; 5 min na de initiële blok op een plaats), het aantal occlusies (3-5), om vaatwand schade aan de blokkadelocatie voorkomen . </li></ol></li></ol> 8. Analyse van de gegevens en de meting van L p (waterdoorlaatbaarheid) <ol><li> Tijdens het afspelen, bepalen de beginafstand (ℓ 0) een marker rode cel om de occlusie plaats door toepassing van een beeld van een micrometer en de bekende posities van de afbeeldingen. Bepaal de beginsnelheid (dl / dt) van de marker cel van haar positie in een aantal frames tijdens de 3-10 seconden van de opgenomen beelden. Afschrikkenmine vat de straal (r) van de beelden genomen tijdens occlusie (figuur 3). </li><li> Bereken J v / S voor elke occlusie als (dl / dt) x (1 / ℓ 0) x (r / 2). Bereken Lp bij een constante druk (J v / S) gedeeld door de aandrijvende druk (microvaatje druk - effectieve colloïd osmotische druk; zie bespreking). </li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Details van Lp berekeningen. Hoewel transvasculaire vloeistofbeweging optreedt terwijl het vaartuig vrij geperfundeerd, die uitwisseling veel te klein om te worden gemeten tijdens vrije perfusie omdat het meestal minder dan 0,01% van het vaartuig perfusiesnelheid. Wanneer echter perfusie transiënt wordt gestopt door afsluiten van het microvaatje, transvasculaire stroom (dwz filtratie) wordt gemeten door de beweging van marker rode cellen in het lumen de vloeistofkolom tussen een marker rode ...

Microperfusion in het vaatstelsel inhoudt vaststelling gecontroleerde stroom van een kunstmatige perfusaat van bekende samenstelling via een micropipet in een bloedvat gewoonlijk minder dan 40 micrometer in diameter. De geperfuseerde vaartuig blijft in zijn normale omgeving en weefsel wordt geperfuseerd met bloed van het dier tot het moment van de canule. Bij gebruik in combinatie met een reeks van videobeelden of fluorometrische technieken in situ microperfusion maakt meting van water en opgeloste stof stroomt over de wanden van kleine bloedvaten onder omstandigheden waarbij de drijvende krachten van deze stromen zijn bekend en de permeabiliteit eigenschappen van de vaatwand kan worden direct geëvalueerd. Verder, door het regelen van de samenstelling van de vloeistof rond het microvaatje in het weefsel (perfusaat en superfusate), de regulering van microvaatje permeabiliteit en uitwisseling kan worden onderzocht doordat de endotheelcellen die het microvaatje wand te worden blootgesteld aan diverse eXperimental voorwaarden voor nauwkeurig gemeten tijd (sec HR) (agonisten, gewijzigde perfusie voorwaarden, fluorescerende indicatoren intracellulaire samenstelling en signalering te meten). Bovendien kunnen ultrastructurele of cytochemische evaluaties van belangrijke cellulaire moleculaire structuren reguleren van de barrière onderzocht in dezelfde microvaatjes waarin doorlaatbaarheid wordt direct gemeten. De benadering vormt aldus een brug tussen onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen die endotheliale barrièrefunctie passen in gekweekte endotheliale monolagen en onderzoek intacte microvaatjes. Bekijk de volgende beoordelingen voor verdere evaluatie 1-6. Een beperking van microperfusion is dat het alleen in microvasculaire bedden die dun, transparant zijn en voldoende structurele integriteit cannulatie met een glazen micropipet mogelijk kan worden gebruikt. Terwijl de vroege onderzoeken gebruikt kikker bloedvaten in mesenterium en dun cutane pectoris muscle 7,8, verreweg het meest gebruikte preparaat in zoogdierlijke modellen de ratten mesenterium 9-15. De meeste onderzoeken hebben zich gericht op acute veranderingen in vasculaire permeabiliteit bestudeerd over een periode van 1-4 uur, maar meer recente onderzoeken zijn uitgebreid tot metingen aan individuele vaartuigen 24-72 uur na een initiële perfusie 12,16. De recent ontwikkelde CRISPR technologie, die belooft om meer genetisch gemodificeerde rat modellen beschikbaar te stellen voor het bestuderen van de vasculaire permeabiliteit regelgeving 17 moeten de in deze mededeling beschreven methoden kunnen worden toegepast in venulaire microvaten van het mesenterium in deze belangrijke nieuwe rat modellen. De werkwijze vereist een omgekeerde microscoop uitgerust met een op maat gebouwde microscooptafel groot genoeg is om zowel de dieren preparaat en ten minste drie micromanipulators gebruikt om positie microtools nabij geperfundeerde vat en een perfusie micropipet passen aan het vat houdenlumen. Bijvoorbeeld een aangepaste platform voor een xy microscoop podium (ongeveer 90 × 60 cm) kunnen worden vervaardigd uit een 1 cm dikke stalen plaat met een rust-proof coating. Het podium is om een ​​technische index tafel of twee dove-tail dia&#39;s gemonteerd in een rechte hoek en ondersteund op Teflon pilaren of een bal transfers voor beweging in het horizontale vlak bevestigd. Een typische rig (zie figuur 2) heeft veel gemeen met de microscoop en micropositionering apparatuur die wordt gebruikt voor een reeks van intravitale microcirculatie experimenten zoals die tot enkele bloedvat flow en hematocriet, lokale zuurstof levering van bloed perfusie haarvaten, regulering van de vasculaire gladde meten spierspanning, en de lokale microvasculaire ophoping van fluorescerende tracers geïnjecteerd in de hele omloop. 18-26 Het fundamentele aspect van de techniek is het meten van de volumestroom (J v) over een bepaald oppervlak (S) van het microvaatje wand. Volbrengendit via de gemodificeerde Landis techniek hierin beschreven een eenvoudige omgekeerde microscoop voldoende. Een kleine videocamera gemonteerd op de afbeelding poort en het videosignaal, met een toegevoegde tijdbasis, wordt weergegeven op een videomonitor en geregistreerd in digitale vorm op een computer of een digitaal of analoog signaal op een videorecorder. Zodra de canule microvaatje wordt het gedeelte van het microvaatje zichtbaar voor de camera kan worden veranderd door bewegen van de manipulatoren en fase als een eenheid zonder verstoring van de canule. Meting van transvasculaire stromen kunnen ook worden gecombineerd met uitgebreide onderzoekingen met een gesofisticeerde fluorescentiemicroscoop met geschikte filters zoals installaties voor metingen van opgeloste permeabiliteit, fluorescent verhouding bewaking van cytoplasmatisch calcium of andere cellulaire mechanismen en confocale beeldvorming 6,12,13, 27. Een belangrijk voordeel van microperfusion aanpak is de mogelijkheid om herhaalde metingen maken op hetzelfde vaartuig, Onder gecontroleerde verandering van de drijvende kracht, zoals hydrostatische en oncotische drukken, of geïnduceerde verandering in het vat reacties op ontstekingen. De meest voorkomende ontwerp is een gepaarde vergelijking van gemeten doorlatendheid (Lp) op hetzelfde vaartuig met het vaartuig eerst geperfuseerd via een micropipet gevuld met een controle perfusaat en de rode celsuspensie een basislijn permeabiliteit staat vast, daarna met een tweede pipet het testmiddel toegevoegd aan het perfusaat. Meerdere canuleringen zijn mogelijk met de cyclus herhaald na reperfusie de controle pipet. Het onderhavige protocol toont de infusen en microperfusion van een venular vaartuig rat mesenterium water fluxen over het microvaatje wand nemen en te meten het L p van de vaatwand, een bruikbare index van de permeabiliteit van de gemeenschappelijke route voor water en opgeloste stoffen tussen de intacte endotheliale barrière. De procedure wordt de gewijzigde Landis techniq genoemdUE omdat de oorspronkelijke Landis principe van het gebruik van de relatieve beweging van rode cellen als maat van transvasculaire vloeistofuitwisseling na perfusie geblokkeerd bewaard 28, maar het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld de hydrostatische en albumine oncotische drukverschillen over het microvaatje wand) beschikbaar na microperfusion is veel groter dan in uncannulated bloed perfusie microvaten 8,29.

<table><tbody><tr><td>MICROSCOPE, TABELLE EN STAGE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>invers microscoop (metallurgisch type) met trinocular hoofd voor video: voorbeeld</td><td>Olympus</td><td>CK-40</td><td>probeer de oculairen hoger ten opzichte van de stage te plaatsen--je moet door de oculairen kijken terwijl je rond de bovenkant van de stage reikt over de tussenliggende micromanipulatoren</td></tr><tr><td>invers microscoop (metallurgisch type) met trinocular hoofd voor video: voorbeeld</td><td>Leica</td><td>DMIL</td><td>probeer de oculairen hoger ten opzichte van de stage te plaatsen--je moet door de oculairen kijken terwijl je rond de bovenkant van de stage reikt over de tussenliggende micromanipulatoren</td></tr><tr><td>objectief met smalle diameter, lange werkafstand: voorbeeld</td><td>Nikon</td><td>Nikon E Plan 10&times;/0.25 LWD</td><td></td></tr><tr><td>stageplatform--1/2 inch of 1 cm plaatstaal</td><td>laswerkplaats</td><td></td><td>dit moet zwaar zijn om trillingen te verminderen</td></tr><tr><td>Unislide x-y tafel: duivenstaart glijbanen</td><td>Velmex</td><td>AXY4006W1</td><td></td></tr><tr><td>VIDEO</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD videocamera: voorbeeld</td><td>Pulnix</td><td>TM-7CN (niet langer beschikbaar)</td><td>geen kleur nodig</td></tr><tr><td>video-opnamesysteem met audio--generiek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>video-afspeelsysteem (volledig stilstaand frame, enkele framebeweging)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleine microfoon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROMANIPULATORS, HOUDERS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulator, XYZ (3)</td><td>Prior/Stoelting (niet langer beschikbaar)</td><td></td><td>zoek naar fijne Z en groter bereik van reizen in grove aandrijvingen voor gemakkelijke positionering</td></tr><tr><td>hydraulische sondeaandrijving, één weg</td><td>FHC</td><td>50-12-1C</td><td>moet een handmatige aandrijving of elektronische aandrijving kopen</td></tr><tr><td>manuele trommelaandrijving&nbsp;</td><td>FHC</td><td>50-12-9-02</td><td></td></tr><tr><td>of hydraulische aandrijving, 3-weg</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MX610 (1-weg) of MX630 (3-weg)</td><td>geweldig voor korte armen, gevuld met water en moet elke 2 jaar worden teruggestuurd om te worden bijgevuld</td></tr><tr><td>connectoren/stang/houders</td><td>Siskiyou Corporation</td><td>MXC-2.5, MXB etc.</td><td></td></tr><tr><td>pin vis</td><td>Starrett</td><td>162C</td><td>om de begrenzer vast te houden</td></tr><tr><td>pipethouder</td><td>World Prescision Instruments</td><td>MPH3</td><td></td></tr><tr><td>watermanometer ~120 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MICROSCOPEN SCHEIDISCH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>helder Plexiglas voor microscoop schaal voor dier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3/4 inch gepolijste kwarts schijf ~1/4 inch hoog</td><td>Quartz Scientific Inc.</td><td>custom</td><td>&nbsp;(of gepolijst plexiglas, glas); zorg ervoor dat de hoogte minder is dan de werkafstand van het objectief</td></tr><tr><td>Plexiglas lijm (Weld-on 4: VOORZICHTIG CARCINOGEN)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>medisch lijm voor weefselputje</td><td>NuSil</td><td>MED-1037</td><td></td></tr><tr><td>All-purpose siliconen rubber hittemat, 5" L x 2" W</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03125-20</td><td>verwarmer voor microscoop schaal--heeft snoer en controller nodig--240V versie beschikbaar</td></tr><tr><td>Netvoedingsadapter voor Kapton Heaters en Kits, 6 ft, 120 VAC</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-03122-75</td><td></td></tr><tr><td>STACO 3PN1010B Variabel-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Uit</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-01575-00</td><td></td></tr><tr><td>PIPET MAKERIJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>verticale pipet puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-30 met nichrome gloeidraad</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm OD dunne wand capillaire buis</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>B150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>pipet grinder luchtsteen en dissectiemicroscoop--zie referentie in tekst</td><td></td><td></td><td>of koop een pakket van Sutter Instruments of World Precision Instruments</td></tr><tr><td>RX Honing Machine, System II</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td>MAC-10700 Rx System II Machine</td><td>alternatief voor luchtsteen, gebruik met een dissectiemicroscoop onder een hoek gemonteerd</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp; met keramische slijpschijf</td><td>RX Honing Machine Corporation</td><td></td><td>gebruik "zoals het is" of bevestig slijpfilm</td></tr><tr><td>slijpfilm vellen, 0.3 of 0.5 um</td><td>3M</td><td>onderdeelnr. 051144 80827</td><td>268X Imperial slijpfilm vellen met zelfklevende achterkant--kan worden gekocht bij Amazon</td></tr></tbody></table>

microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in rat mesenterium

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experimenten om de permeabiliteit eigenschappen individueel geperfundeerde microvaatjes meten een brug slaan tussen onderzoek naar de moleculaire en cellulaire mechanismen reguleren van vasculaire permeabiliteit in gekweekte endotheliale cel monolagen en de functionele eigenschappen van uitwisseling gehele microvasculaire bedden. Werkwijze voor canule en perfuseren venulaire haarvaten van rat mesenterium en meet de doorlatendheid van het microvaatje wand wordt beschreven. De belangrijkste apparatuur die nodig is voorzien van een intravitale microscoop met een grote aangepaste stadium dat micromanipulators ondersteunt drie verschillende Microtools positioneren: (1) een afgeschuinde glas micropipet om canule en perfuseren de microvessel; (2) een glazen micro-occlusie te transient blokkeren perfusie en maken meting van transvasculaire waterstroom beweging bij een gemeten hydrostatische druk, en (3) een stompe glasstaaf de mesenteriale weefsel stabiliseren op de plaats van de canule. De gemodificeerde Landis micro-occlusie technique gebruikt rode cellen gesuspendeerd in kunstmatige perfusaat als markers van transvasculaire vloeiende beweging, en ook maakt herhaalde metingen van deze stromen als experimentele omstandigheden worden gewijzigd en hydrostatische en colloïd osmotische drukverschil over de microvaatjes worden zorgvuldig gecontroleerd. Metingen van doorlatendheid eerste gebruik van een controlegroep perfusaat, dan na opnieuw canulatie van dezelfde microvessel met de test perfusates vrijgave gepaarde vergelijkingen van de microvessel respons onder deze goed gecontroleerde omstandigheden. Pogingen om de methode uit te breiden tot bloedvaten in het mesenterium van muizen met genetische modificaties wordt naar vasculaire permeabiliteit modificeren waren ernstig beperkt door het ontbreken van lange rechte en onvertakte microvaatjes in de muis mesenterium, maar de recente beschikbaarheid van de ratten met gelijke genetische modificaties behulp het CRISPR / Cas9 technologie zal naar verwachting nieuwe gebieden van onderzoek, waar de hierin beschreven methoden kunnen worden toegepast openen. </p&gt;

Figuur 4 toont de resultaten van het meten van het tijdsverloop van veranderingen in Lp in een rat venulaire microvaatje achtereenvolgens canule met vier perfusates. 33 De omvang van Lp berekend bij een constante druk werd gebruikt als een maat voor veranderingen in microvaatje permeabiliteit, eerste in de controle staat van een perfusievloeistof met 1% runderserumalbumine toen het vat werd blootgesteld aan het ontstekingsmiddel bradykinine (Bk) met een tweede micropipet...

De gemodificeerde Landis-techniek maakt gepaarde meting mogelijk van de hydraulische geleidbaarheid van individuele microvaten in de mesenterium van normale en genetisch gemodificeerde ratten onder controle- en testomstandigheden met behulp van microperfusietechnieken. Het biedt een handige methode om mechanismen te evalueren die de doorlaatbaarheid van microvaten en transvasculair uitwisseling onder fysiologische omstandigheden reguleren.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om herhaalde metingen mogelijk te maken van de hydraulische geleidbaarheid of waterpermeabiliteit van de wanden van ulaire microvaten in het rattenmesenter onder gecontroleerde experimentele omstandigheden. Dit wordt bereikt door een ulair microvat te canuleren, zodat de oncotische en hydrostatische druk in het lumen kan worden ingesteld en de chemische samenstelling van het perfusaat nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Vervolgens wordt het vat afgesloten en kunnen rode bloedcellen die in het perfusaat zijn gesuspendeerd, welke dienen als stroommarkers, worden waargenomen terwijl ze door het lumen bewegen als indicatoren voor transvasculaire vloeistofuitwisseling.Vervolgens worden de positie en snelheid van de marker-rode cellen geregistreerd, zij het in de richting van de occlusieplaats of ervan af. Ten slotte wordt de occlusie opgeheven en herhaald voor aanvullende metingen, of het vat wordt opnieuw gecannuleerd en worden de metingen onder gewijzigde omstandigheden herhaald.Uiteindelijk kunnen gepaarde metingen van de hydraulische conductiviteit onder controle- en testcondities worden uitgevoerd om het meest directe onderzoek naar de factoren die de doorlaatbaarheid van microvaten reguleren, mogelijk te maken. Een voordeel van de gemodificeerde Landis-techniek om de regulatie van capillaire permeabiliteit te onderzoeken, is de perfusiestap. Microperfusie maakt het mogelijk om de permeabiliteit van de microvatwand te meten onder condities waarbij de samenstelling van het perfusaat, het uitwisselingsoppervlak en de druk in de microvaten allemaal direct worden gecontroleerd.Deze methode kan vragen beantwoorden over de cellulaire en moleculaire mechanismen van permeabiliteitsregulatie in microvaten die representatief zijn voor intacte organen, en kan een vergelijking mogelijk maken met resultaten van gecultiveerde endotheliale monolagen, die vaak worden gebruikt om de details van moleculaire mechanismen te onderzoeken. Onze protocoldemonstratie wordt verzorgd door Joyce Clark, onze laboratoriummanager. Joyce is tijdens haar tijd hier als laboratoriummanager verantwoordelijk geweest voor veel van de verbeteringen in dit protocol.Gebruik als eerste een elektronische puller om diverse schone borosilicaatglazen capillaire buisjes te vormen tot taps toelopende helften, elk met een puntlengte van ongeveer één centimeter, met behulp van een luchtaangedreven slijpwiel en een 0,5 micron schuurpapier in een waterbad en een micropipethouder die in een hoek van 30 graden ten opzichte van de horizontale schuinte van de micropipetten is ingesteld. Selecteer na het wassen en drogen van de micropipetten volgens het tekstprotocol micropipetten met een opening van ongeveer 50 micron lang en een verhouding tussen de lengte en breedte van de schuinte tussen 3,1 en 3,5. Deze moeten tevens een scherp toelopende punt hebben, wat helpt bij het penetreren van de taaie collageenvezels in het mesenterium.Om fixatiehulpmiddelen te maken, houdt u kortstondig een niet-afgeschuinde, uitgetrokken glazen capillair nabij een microvlam om een stomp uiteinde te vormen. Herhaal dit om meerdere fixatiehulpmiddelen te maken en bewaar deze in een stofvrije doos. Maak vervolgens micro-occlusies door een niet-afgeschuinde, uitgetrokken capillaire buis onder een hoek in een microvlam te houden en gebruik een slangadapter of een gebroken micropipet om de buis voorzichtig ongeveer vier millimeter vanaf de punt in een hoek van circa 120 graden te buigen.Met betrekking tot de schacht is het belangrijk dat de punt neither in de vlam is dichtgesmolten noch is afgebroken. Na het anesthetiseren van een rat en het positioneren van het mesenteriaal weefsel en de darm volgens het tekstprotocol, plaatst u de dierenschaal op de microscooptafel zodat het mesenterium zichtbaar is door de oculairs. Positioneer een door zwaartekracht gevoede druppellijn met ringer-oplossing voor zoogdieren voor een continue perfusie.Gebruik vervolgens gaasjes bij het mesenterium om de darm op zijn plaats te houden, te helpen het vocht vast te houden en overtollige Ringer-oplossing van het oppervlak te absorberen, pas de doorstroming aan en aspireer het effluent om een constante laag te behouden, identificeer de doelmicrovaten, welke onvertakte segmenten zijn stroomafwaarts van convergente stroming en één of twee vertakkingen distaal van de echte capillairen. Zoek een onvertakt vat met een snelle bloedstroom en zonder witte bloedcellen die aan de vaatwand kleven. Positioneer de testmicrovaten in het centrum van het microscopieveld en breng de fixeerder in positie nabij de gekozen canulatieplaats.Om de micropipet te vullen, zuigt u perfuse eight en gewassen erytrocyten op in een spuit die is voorbereid volgens het tekstprotocol; zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de slang aanwezig zijn. Schuif de slang in het brede uiteinde van de micropipet tot deze tegen het taps toelopende gedeelte aanstoot. Oefen een zachte, snelle druk uit op de zuiger van de spuit om de tip van de micropipet te vullen.Wanneer de pipet vol is, verschijnt er een klein stroompje of een druppel aan de punt. Duw tijdens het terugtrekken van de slangetjes voorzichtig op de plunjer om de schacht van de micropipet te vullen. Verwijder vervolgens kleine luchtbellen in de schacht door er voorzichtig tegenaan te tikken.Plaats de micropipet vervolgens in een pipethouder met een zijpoort die een continue vloeistofverbinding met een watermanometer mogelijk maakt. Zorg ervoor dat de houder, die is bevestigd aan een hydraulische aandrijving en micromanipulator, onder een lichte horizontale hoek is ingesteld zodat de rand van de taps toelopende micropipet de darm of de tray niet raakt. Pas met een spuit of een met water gevulde rubberen peer de hydrostatische druk op de vloeistof in de micropipet aan door de hoogte van de vloeistofkolom in de manometer aan te passen tot ongeveer 40 centimeter water boven het mesenterium.Voordat de gevulde micropipet onder de microscoop wordt geplaatst, drukt u de klem voorzichtig op het weefsel nabij de microvaten, waarbij voldoende kracht wordt uitgeoefend om het weefsel vast te pakken. Trek de klem vervolgens iets terug, zodat het weefsel in lijn met de microvaten wordt uitgerekt en de spanning in de collageenvezels van het mesenterium wordt uitgelijnd met het vat. Lijn de micropipet uit met het vat en breng deze in het gezichtsveld via de oculairs. Plaats de punt net stroomopwaarts van de gekozen canulatieplaats en laat deze op het weefsel zakken, zodat de stroming in het vat gedeeltelijk wordt belemmerd, maar niet volledig wordt afgesloten.Cannuleer het vat met behulp van de hydraulische aandrijving door de pipetpunt langzaam in het lumen van het vat te drijven, waarbij u er op let dat u de punt niet door de tegenovergestelde zijde van het vat duwt. Zodra de micropipet het lumen binnendringt, zal het perfusaat het bloed snel uit het lumen van het vat spoelen en de circulatie binnengaan. Verlaag de perfusiedruk door de manometer aan te passen totdat de rode bloedcellen zachtjes oscilleren in het lumen van het vat.Hiermee wordt de balansdruk bepaald, waarmee de hydrostatische druk in de microvaten of de PC aan het distale uiteinde van het microvatsegment wordt gemeten. Handhaaf de perfusie van het vat boven deze balansdruk om micro-occlusie uit te voeren. Plaats de blocker met behulp van video en audio boven het geperfuseerde vat, nabij de onderste rand van het microscopieveld.Registreer mondeling de locatie van de blokkeringsplaats zoals gezien in het rode I-stuk. De blokkeringsplaats is 57 Met de punt van de blokkeerder net boven het microvat geplaatst. Gebruik de fijne Z-bediening van de micromanipulator om de blokkeerder voorzichtig te laten zakken tot de doorstroming in het vat is afgesloten.Gebruik audio om de druk op de manometer te noteren. De druk is 50. Pas vervolgens gedurende drie tot 10 seconden occlusie toe en laat deze weer los.Om de vrije perfusie te herstellen, verplaatst u de blokkadeplek in stappen van 5 tot 10 micron stroomopwaarts in het vat richting de pipetpunt, waarbij u op elke locatie niet meer dan drie tot vijf occlusies uitvoert om schade aan de vaatwand op de blokkadeplek te voorkomen. Analyseer de gegevens volgens het tekstprotocol. Dit tijdverloop meet de veranderingen in de hydraulische conductiviteit of LP in ratulaire microvaten die succesvol zijn gecannuleerd met vier perfuse eights.De grootte van de LP bij constante druk werd gebruikt om veranderingen in microvaten te meten. Wandpermeabiliteit bij perfusie met 1% BSA als controle versus 10 molar van het inflammatoire agens bradykinine of bk. Zoals hier wordt getoond, veroorzaakte BK een voorbijgaande toename van de LP die binnen 10 tot 15 minuten terugkeerde naar controleniveaus.Nadat de basiswaarden waren hersteld met 1% BSA 10 nanomolair, werd BK opnieuw geperfuseerd samen met één micromolair pH scene one fosfaat of S one P. De resultaten geven aan dat S one P de respons op bk significant dempte. Voor sommige experimentele ontwerpen is het belangrijk om zowel de solutereflectiecoëfficiënt voor een macromolecuul als de lp te schatten.Dit wordt het beste bereikt door JV bij meerdere drukken in elk individueel microvat te meten. In dit experiment werden zowel de LP als de effectieve oncotische druk van 5% albumine in het PERFUSE-medium geschat, terwijl er geen albumine aanwezig was in het weefsel rondom de microvaten. JV over S werd gemeten bij drie verschillende drukken en hier uitgezet.De LP is de helling van de relatie tussen JV over S en de druk, en het snijpunt op de druk-as is het effectieve oncotische drukverschil over de vaatwand. In combinatie met andere technieken, zoals immunofluorescente labeling en confocale microscopie, of zelfs transmissie-elektronenmicroscopie, biedt microperfusie een krachtige analyse van de microvasculaire endotheel- en functie met behulp van vaten met een bekende permeabiliteit. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u herhaalde metingen van de hydraulische conductiviteit of waterpermeabiliteit van capillaire microvaten in het mesenterium van de rat kunt uitvoeren onder gecontroleerde experimentele omstandigheden.Deze benadering kan worden toegepast in momenteel beschikbare ratmodellen, maar ik ben vooral geïnteresseerd in de mogelijkheid dat deze kan worden gebruikt in nieuwe genetisch gemodificeerde ratten die beschikbaar zullen komen door de CRISPR Cas nine-technologie, en ik hoop dat deze methode op die manier wordt uitgebreid.

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Normale volwassen gevasculariseerde weefsel van zoogdieren die fysiologische angiogenese en die mist nog niet is blootgesteld aan chirurgische ingreep wordt gebruikt om te bestuderen: (i) de instelling en ontwikkeling van angiogenese na intraperitoneale toediening van test-agenten, en (ii) wijziging van angiogenese na systemische toediening van geselecteerde test agenten.

Rat mesenterium Angiogenese Assay

Dit artikel beschrijft een eenvoudig model voor het stimuleren angiogenese in de rat mesenterium. Het model produceert dramatische toename in capillaire kiemen, vasculaire gebied en vasculaire dichtheid over een relatief korte tijd cursus in een weefsel die het mogelijk maakt en face visualisatie van hele microvasculaire netwerken tot in de enkele cel niveau.

Rat mesenterium uittreding: een model voor het onderzoeken van de Cellular Dynamics betrokken bij het Angiogenese

Pressure myography wordt gebruikt om vasoactiviteit van kleine slagaders die aanhoudende vernauwing ontwikkelen wanneer onder druk te beoordelen. Het manuscript geeft een gedetailleerd protocol te beoordelen geïsoleerde segmenten van kleine mesenterische arteriën van ratten vaatactiviteit en het effect van de intraluminale druk op de vasculaire diameter.

Het beoordelen Myogene Response en vasoactiviteit In Resistance Mesenteriale slagaders behulp Pressure myography

De geïsoleerde bloed geperfundeerd long bereiding maakt het mogelijk om microvaatje netwerken visualiseren op het longoppervlak. Hier beschrijven we een aanpak om de permeabiliteit van enkele bloedvaten in geïsoleerde longen te kwantificeren met behulp van real-time fluorescentie beeldvorming.

Kwantificeren Single microvessel permeabiliteit in Geïsoleerde-Blood geperfuseerde Rat Lung Voorbereiding

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Angiogenese omvat interacties tussen meerdere cellen en systemen die onderzocht moeten worden in een fysiologisch relevante omgeving. Het doel van deze studie is om de capaciteit van het kweekmodel van de rat mesenterium te demonstreren om tijdsverloopvergelijkingen van intacte microvasculaire netwerken tijdens angiogenesis te maken.

Een<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Methode voor Time-lapse imaging van gekweekte Rat Mesenteriale microvasculaire Networks

Dit manuscript wordt beschreven in vitro videomicroscopie protocollen voor de beoordeling van de vasculaire functie in rat weerstand van de cerebrale bloedvaten. Het manuscript wordt ook beschreven technieken voor het evalueren van microvessel dichtheid met fluorescently geëtiketteerde lectine en weefsel perfusie met behulp van Laser Doppler flowmetrie.

Evaluatie van vasculaire controlemechanismen met behulp van videomicroscopie van geïsoleerde resistentie slagaders van ratten

In dit protocol werd de endotheelbarrièrefunctie van de submandibulaire klier (SMG) geëvalueerd door verschillende moleculair gewogen fluorescerende tracers in vivo in de hoekaders van proefdiermodellen te injecteren onder een laserscanmicroscoop met twee fotonen.

In vivo Vasculaire permeabiliteitsdetectie bij submandibulaire klier van muizen

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

Leer de gemodificeerde Landis-techniek om hydraulische geleidbaarheid van microvaten in rattenmesenterium te meten. Deze methode maakt herhaalde metingen van microvatdoorlaatbaarheid onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Meer video's verkennen