VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal

Het algemene doel van deze procedure is om de clonale samenstelling van lymfoommonsters te karakteriseren voor de identificatie van patronen in de clonale evolutie bij lymfoomrecidieven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van lymfomen, zoals de wijze waarop recidiverende tumoren voortkomen uit de oorspronkelijke tumoren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de nieuwste high-throughput sequencing-technologie aanpast om een uitgebreidere kaart van de gemeenschappelijkheden bij lymfomen mogelijk te maken.

In dit protocol wordt DNA geëxtraheerd uit dunne coupes van zowel in OCT ingebed bevroren weefsel als uit in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed normaal of maligne weefsel, om DNA te extraheren uit in OCT ingebed bevroren weefsel. Verteer eerst 10 tot 30 dunne coupes in vier milliliter nucleïnezuur-lysisbuffer met protease K en 0,625% SDS gedurende één nacht in een waterbad van 37 °C. Voeg de volgende dag één milliliter verzadigde vijf molar natriumchloride toe aan het verteringsmengsel, schud krachtig gedurende 15 seconden en centrifugeer 15 minuten lang bij 1.100 ×g.

Breng het supernatant bij kamertemperatuur over naar een nieuwe centrifugebuis van 15 milliliter. Voeg twee volumes 100%ethanol toe en meng door de buis zes tot acht keer om te keren; centrifugeer vervolgens 60 minuten bij 5.000 ×g bij vier graden Celsius. Om het geprecipiteerde DNA te verzamelen, wordt de DNA-pellet tweemaal gewassen met 70%ethanol en telkens 15 minuten gecentrifugeerd bij 5.000 ×g.

Om het pellet te verzamelen, lossen we het DNA-pellet overnight op een shaker bij kamertemperatuur op in 100 tot 400 µL TE-buffer om DNA te extraheren uit dunne coupes van in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed weefsel. Voer eerst de deparaffinering uit door de paraffinecoupes tweemaal 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in 1 mL xyleen. Verzamel de weefselcoupes door te centrifugeren bij 13.000 ×g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder vervolgens residuele xyleen door de coupes twee keer 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in één milliliter 100% ethanol. Verzamel de weefselcoupes door deze vijf minuten te centrifugeren bij 13.000 ×g. Laat de coupes bij kamertemperatuur 10 tot 15 minuten aan de lucht drogen.

Voeg een vers bereide protease-oplossing toe aan de monsters tot een eindvolume van 50 tot 100 µL en incubeer deze een nacht bij 37 °C. Verhit de monsters de volgende dag gedurende 10 minuten bij 95 °C om de proteinase te inactiveren. De DNA-opbrengst van de extracties die in het vorige segment zijn gedemonstreerd, bedraagt 5 tot 200 µg, afhankelijk van de grootte van het weefsel.

De volgende stap is het beoordelen van de kwaliteit van elk DNA-monster in een PCR-buisje. Voeg 25 µL TDNA-polymerase toe aan 45 µL mastermix van een commerciële ladderkit. Voeg vijf µL DNA toe aan het PCR-buisje en meng dit goed door ten minste vijf keer op en neer te pipetteren.

Amplificeer het DNA volgens de voorwaarden die in de protocoltekst worden beschreven. Meng vervolgens 20 µL van de PCR-reactie met vier µL van six x loading dye en breng dit aan op een 2% AGROS-gel. Wanneer de elektroforese is voltooid, kleur je de AGROS-gel met ethidiumbromide en detecteer je de PCR-producten.

Met een gel-beeldvormingssysteem zullen de monsters die vijf PCR-producten opleveren met groottes van 100, 200, 300, 400 en 600 basenparen uitsluitend worden gebruikt om VDJ-ampliconen te genereren. De amplificatie van het gerecombineerde I-G-H-V-D-J-segment vanuit framework-regio één of IGV HFR één wordt in deze video gedemonstreerd. De amplificatie van het gerecombineerde I-G-H-B-D-J-segment vanuit framework-regio twee volgt een vergelijkbare procedure en wordt in de protocoltekst beschreven in een PCR-buismengsel.

Voeg 45 µL mastermix uit de buis met het label "mix two" van een commerciële somatische IGH HYPERMUTATION assay voor geldetectie-kit, 0,25 µL TAC DNA-polymerase en 5 µL sample-DNA toe. Amplificeer het DNA volgens de condities die in de protocoltekst worden beschreven. Om suboptimaal DNA te amplificeren, kunnen de PCR-condities worden aangepast door de annealingstijd te verlengen of het aantal amplificatiecycli te verhogen. Scheid de volledige PCR-producten via elektroforese op een 2% agarosegel. Kleur de agarosegel met een 0,5 µg/mL ethidiumbromide-oplossing en detecteer de PCR-producten.

Met een gel-imagingsysteem wordt een monoklonaal amplicon verwacht met een grootte tussen de 310 en 380 basenparen. Snijd het gelgedeelte dat het monoklonale amplicon bevat uit. Zuiver vervolgens het DNA uit het uitgesneden gel met een standaard gel-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant.

Om deze procedure te starten, brengt u het gezuiverde V-D-J-P-C-R-product over naar een PCR-buisje en voegt u de Resus-suspensiebuffer uit de DNA-monstervoorbereidingskit toe om het volume aan te vullen tot 60 µL. Voeg 40 µL end-repair-mix uit de DNA-monstervoorbereidingskit toe, meng grondig en incubeer de reactie 30 minuten bij 30 °C in een voorverwarmde thermocycler met een voorverwarmd blokdeksel van 100 °C. Meng vervolgens 136 µL magnetische beads en 24 µL PCR-kwaliteitswater in een buisje van 1,5 mL, breng de gehele end-repair-reactie over in het buisje en meng dit goed met de bead-oplossing.

Plaats de buisjes gedurende twee minuten op een magnetische standaard om de scheiding van de beads van de oplossing mogelijk te maken. Aspireer het supernatant en was de beads tweemaal met vers bereid 80%ethanol. Aspireer de ethanoloplossing volledig en laat de beads 15 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

Haal na 15 minuten de buisjes van het magnetische rek en resuspendeer de beads in 17,5 µL Resus Suspension Buffer. Plaats de buisjes gedurende twee minuten terug op het magnetische rek om de beads te scheiden van de Resus Suspension Buffer. Overbreng de Resus Suspension Buffer, die nu het end-repairproduct bevat, naar een schoon PCR-buisje.

De volgende stap is het toevoegen van een a-overhang aan het end-repair product. Voeg 12,5 microliters van de a-tailing mix toe aan de PCR-buis met het end-repair product en meng dit grondig. Incubeer de PCR-buizen 30 minuten bij 37 graden Celsius in een voorverwarmde thermocycler met een voorverwarmd deksel van 100 graden Celsius.

Voeg voor de adapterligatie 2,5 microliter Resus suspensiebuffer, 2,5 microliter ligatiemix en 2,5 microliter DNA-adapterindex toe aan de a-tailingreactie. Incubeer de reactie 30 minuten bij 30 graden Celsius in een voorverwarmde thermocycler met een voorverwarmd deksel op 100 graden Celsius. Voeg na 30 minuten vijf microliter stopligatiebuffer toe aan elke reactie en meng dit grondig.

Voeg 42,5 µL goed gemengde magnetische beads toe aan elke reactie en was met 80% ethanol zoals eerder beschreven. Voeg 50 µL Resus suspensiebuffer toe om het adapter-geligeerde product te elueren. Reinig het adapter-geligeerde product voor een tweede maal met behulp van 50 µL goed gemengde ampu XP beads en elueer het product in 25 µL Resus suspensiebuffer in een schone PCR-buis.

Om het VDJ-amplicon te amplificeren, voegt u vijf µL PCR-primer-cocktail en 25 µL PCR-mastermix toe aan de PCR-buis met het adapter-geligeerd product en mengt u dit grondig; voer de amplificatie uit in een thermocycler volgens de condities die in de protocoltekst worden beschreven. Wanneer de amplificatie is voltooid, wordt de reactie gezuiverd met 50 µL goed gemengde magnetische beads en wordt het eindproduct geëlueerd in 30 µL Resus Buffer. De VTJ-ampliconbibliotheek wordt vervolgens gevalideerd, samengevoegd en gesequenced zoals beschreven in de protocoltekst.

Omdat de complexiteit van de VVG-sequencingbibliotheek laag is, raden we aan om 20 tot 50% goedgekeurde sequencingmonsters toe te voegen om nauwkeurige base calling mogelijk te maken. Deze representatieve gelbeelden tonen V-D-J-P-C-R-ampliconproducten van DNA geëxtraheerd uit lymfoompatiëntenmonsters. De kwaliteit van het V-D-J-P-C-R-amplicon voor en na de constructie van de bibliotheek werd beoordeeld met een bioanalyzer.

De verschuiving in grootte van 334 basenparen naar 459 basenparen duidt op de toevoeging van de adapter om de clonale evolutie van een recidiefgeval van diffuus grootcellig B-cellymfoom te volgen. Er werd een fylogenetische analyse uitgevoerd van de somatische hypermutatie- of SHM-profielen van de belangrijkste zware keten VDJ-rearrangementen tussen de monsters van de diagnose en het recidief.

De modus van late divergente clonale evolutie werd waargenomen. Er werden nieuwe grafische methoden ontwikkeld om clonale evolutie te visualiseren. De getoonde patronen zijn multidimensionale schalingsplots van een laat divergent en een vroeg divergent recidiefmodel.

De straal van elke cirkel geeft het aantal subklonen aan dat overeenkomt met een specifiek SHM-profiel. Blauw komt overeen met de diagnosemonster en rood met het recidiefmonster. Evenzo laten ongerichte grafieken zien dat de distributie van subkloon-aantallen in het laat-divergente geval afwijkt van het vroeg-divergente geval.

De randen komen overeen met twee SHM-profielen met een stringafstand van één letter scheiding en de kleurenschaalbalk geeft de proportie sequenties aan die in kaart zijn gebracht op een specifiek SHM-profiel dat overeenkomt met het rode diagnosemonster of het gele recidiefmonster. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om kruiscontaminatie tussen monsters te vermijden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de kwaliteit van lymfoomtumor monsters kan worden beoordeeld.

Deze aanpak kan ook worden gebruikt om minimale residuele ziekte te traceren en de immuunbewakingsrespons op kankers te onderzoeken. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.