Name: VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 7 s
Description: Leer VDJ-Seq voor diepgaande analyse van klonale evolutie in B-cellymfoom met behulp van high-throughput sequencing. Deze methode onthult patronen van tumorheterogeniteit en behandelingsresistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen Dr. Rita Shaknovich en leden van Elemento lab, Melnick lab en Tam lab bedanken voor de doordachte discussies. We willen ook de Genomics Resources Core Facility aan Weill Cornell Medical College bedanken voor het uitvoeren van de VDJ-sequencing. YJ werd ondersteund door ASH Scholar Award. WT en OE worden ondersteund door Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE wordt ondersteund door de NSF CAREER award, de Starr Cancer Consortium en de Hirschl Trust. We willen ook Katherine Benesch, JD, MPH bedanken voor haar genereuze ondersteuning aan dit project.

1. VDJ Amplification 1,1) DNA Extraction uit tumormonsters <ol><li> Uittreksel DNA van dunne secties (10-20 micrometer) van bevroren oktober ingebed normaal of kwaadaardig weefsel. <ol><li> Digest 10-30 snijden van dunne ingebed weefsel gesneden op een cryostaat microtoom in 4 ml Lysis Buffer Nucleic (0,0075 M Tris HCI, pH 8,2, 0,3 M NaCl, 0,002 M Na2EDTA) met Proteinase K (0,5 mg / ml, eindconcentratie ) en 0,625% SDS in een 15 ml centrifugebuis in een 37 ° C waterbad gedurende de nacht. </li><li> Voeg 1 ml verzadigd NaCl (5 M) aan het digestiemengsel en schud krachtig gedurende 15 seconden. </li><li> Centrifugeer bij 1100 xg gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Breng het supernatant naar een nieuwe 15 ml centrifugebuis en voeg twee volumes 100% ethanol. </li><li> Meng door het buisje 6-8 keer. Centrifugeer bij 5000 xg gedurende 60 min bij 4 ° C om het geprecipiteerde DNA te verzamelen. </li><li> Was de DNA pellet tweemaal met 70% ethanol. Centrifuge bij 5000 xg gedurende 15 min elke keer om de pellet te verzamelen. </li><li> Los DNA in 100-400 pi TE-buffer bij kamertemperatuur op een schudder overnacht. De DNA-opbrengst 5-200 ug (eindconcentratie tussen 50-500 ng / ul) afhankelijk van de grootte van het weefsel </li></ol></li><li> Extraheer DNA uit dunne gedeelten (10-20 um) van met formaline gefixeerd paraffine ingebed (FFPE) normaal of kwaadaardig weefsel. <ol><li> Incubeer paraffinecoupes in 1 ml xyleen tweemaal bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten telkens in een 1,5 ml microcentrifugebuis om de-paraffinize. Verzamel de weefselcoupes door het draaien bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Incubeer secties in 1 ml 100% ethanol tweemaal bij kamertemperatuur 10 minuten telkens resten xylenen te verwijderen. Verzamel de weefselcoupes door het draaien bij 13.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De paraffine wordt volledig opgelost op dit moment en alleen de weefselsectie resteert. </li><li> Air-droog de secties bij kamertemperatuur temperature gedurende 10-15 min. </li><li> Voeg een 0,5 mg / ml proteïnase K oplossing met 1 x PCR buffer (verdund uit 10 x PCR buffer met nuclease-vrij water). Voeg de proteïnase K oplossing van de monsters in een uiteindelijk volume van 50-100 pi en incubeer overnacht bij 37 ° C. </li><li> Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 10 min te inactiveren Proteïnase K. Opmerking: In deze stap wordt het monster DNA opgelost in de PCR buffer en kunnen worden gebruikt in de stappen 1.2 en 1.3 direct. De DNA-opbrengst 0,5 tot 20 ug (eindconcentratie tussen 10-200 ng / ul) afhankelijk van de grootte van het weefsel. </li></ol></li></ol> 1.2) DNA Quality Assessment <ol><li> Meng 0,25 ul Taq DNA polymerase met 45 pi master mix van de commerciële ladder kit in een PCR-buis. </li><li> Voeg 5 ul DNA bereid uit 1.1.1.7 of 1.1.2.5 in de PCR-buis en meng goed door en neer te pipetteren minstens 5 keer. </li><li> Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en houden op 15 ° C. </li><li> Bereid een 2% agarosegel in TBE (Tris / boraat / EDTA). </li><li> Meng 20 ul PCR reactie met 4 pi 6x ladingskleurstof en laden op een 2% agarosegel. </li><li> Vlekken op de agarosegel met 0,5 ug / ml ethidiumbromide oplossing en detecteren PCR producten met een gel verbeelding systeem. Opmerking: de monsters die 5 PCR producten verkregen van het formaat 100, 200, 300, 400 en 600 bp wordt verder VDJ amplicons gegenereerd. LET OP: Ethidiumbromide is een potente mutagene stof. Behandel met uiterste voorzichtigheid door het dragen van beschermende versnellingen, dwz handschoenen en verwerken in specifieke containers per richtlijnen instelling. </li></ol> 1,3) VDJ PCR 1.3.1) Amplify Gerecombineerde IgH- VDJ Segment van Framework Regio 1 (IgVHFR1) <ol><li> Mix 45 pi master mix van de buis labeled als &quot;Mix 2&quot; van commerciële somatische IGH Hypermutatie test voor Gel Detection kit, 0,25 pi Taq DNA polymerase, en 5 pl monster-DNA bereid uit 1.1.1.7 of 1.1.2.5 in een PCR buis. </li><li> Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C gedurende 7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en houden op 15 ° C. </li><li> Los het gehele PCR-product in een 2% agarosegel met elektroforese. </li><li> Vlekken op de agarosegel met 0,5 ug / ml ethidiumbromide oplossing en detecteren PCR producten met een gel beeldvormingssysteem. Een monoklonaal amplicon wordt verwacht met de orde van grootte van 310-380 bp. </li><li> Accijnzen de gel gedeelte met de monoklonale amplicon tussen 310-380 bp. </li><li> Zuiver DNA uit uitgesneden onder toepassing van een standaard Gel Extraction Kit volgens het protocol van de fabrikant. Opmerking: voor monsters die FR1 fragmenten kunnen worden verkregen, hoeft overvloedig te IgVHFR2 en IgVHFR3. </li></ol> 1.3.2) Amplify Gerecombineerde IgH- VDJ Segment van Framework Regio 2 (IgVHFR2) <ol><li> Mix 45 pi master mix van de buis gelabeld als &quot;Tube B&quot; van een commercieel IGH Gene klonaliteit test voor Gel Detection kit, 0,25 ul Taq DNA polymerase, en 5 ul monster-DNA bereid uit 1.1.1.7 en 1.1.2.5 in een PCR-buis . </li><li> Gebruik de volgende situaties het DNA te amplificeren: 95 ° C gedurende 7 min; gevolgd door 35 cycli van 45 sec bij 95 ° C, 45 sec bij 60 ° C en 90 sec bij 72 ° C; vervolgens 72 ° C gedurende 10 min en de reactie bij 15 ° C. </li><li> Los het gehele PCR-product in een 2% agarosegel met elektroforese. </li><li> Visualiseren PCR product (en) van 0,5 ug / ml ethidiumbromide kleuring. Een monoklonaal amplicon kan worden waargenomen binnen het groottebereik van 250-295 bp. </li><li> Accijnzen de gel gedeelte met de monoklonale amplicon tussen 250-295 bp. </li><li> Zuiver DNA uit uitgesneden gel met een standaard Gel Extraction Kit volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 1.4) Optimaliseren VDJ PCR <ol><li> Gebruik de volgende gewijzigde PCR- omstandigheden voor het amplificeren IgVHFR1 en IgVHFR2 gebruik suboptimale DNA: 95 ° C gedurende 7 min, 40 cycli van 95 ° C gedurende 60 sec, 60 ° C gedurende 60 sec en 72 ° C gedurende 90 sec, laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 min. </li></ol> 2. VDJ Amplicon Bibliotheek Voorbereiding en Sequencing 2.1) Bibliotheek Voorbereiding 2.1.1) End-reparatie <ol><li> Transfer VDJ PCR-product van 1,3 in een PCR-buis en voeg resuspensiebuffer uit DNA Monstervoorbereiding Kit om het volume tot 60 pi te brengen. </li><li> Voeg 40 ul van End Repair Mix uit DNA Monstervoorbereiding Kit en meng. </li><li> Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 30 min in een voorverwarmde thermocycler (30 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C. </li><li> Meng 136 ul magnetische bolletjes en 24 ul PCR grade water eerst in een 1,5 ml buis, vervolgens over de volledige End-reparatie reactie van 2.1.1.3 in de 1,5 ml buis en meng goed met de kralen oplossing. </li><li> Plaats de buisjes op een magnetische standaard gedurende 2 min aan de afscheiding van de beads uit de oplossing toe. Zuig de supernatant en was de kralen met 80% vers bereide EtOH tweemaal terwijl de buis op de magnetische standaard. </li><li> Zuig het ethanoloplossing volledig en laat de korrels aan de lucht drogen gedurende 15 min bij kamertemperatuur gedurende 15 min. </li><li> Neem de buis uit de magnetische stand en resuspendeer kralen in 17,5 ul resuspensiebuffer. </li><li> Plaats de buisjes weer op de magnetische standaard voor 2 min afzonderlijke kralen uit de resuspensiebuffer. Verwijder de hersuspensiebuffer (End-reparatie product wordt gesuspendeerd in de hersuspensiebuffer nu) in een schone PCR-buis. </li></ol> 2.1.2) A-tailing <ol><li> Voeg 12,5 ul A-tailing mix in de PCR-buis met End-reparatie product en meng. </li&gt; <li> Incubeer de PCR-buis bij 37 ° C gedurende 30 min in een voorverwarmde thermocycler (37 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C. </li></ol> 2.1.3) Adaptor Ligatie <ol><li> Voeg 2,5 ul resuspensiebuffer, 2,5 ul ligatiemengsel, en 2,5 pl DNA-adapter Index in de A-tailing reactie. </li><li> Incubeer de reactie bij 30 ° C gedurende 30 minl in een voorverwarmde thermocycler (30 ° C) met een voorverwarmde deksel bij 100 ° C. </li><li> Voeg 5 ul Stop ligatiebuffer in elke reactie en meng. </li><li> Meng 42,5 ul goed gemengde magnetische korrels om de reactie volgende stappen 2.1.1.5 tot 2.1.1.8 te reinigen. Voeg 50 ul resuspensiebuffer de adaptor-geligeerde product te elueren. </li><li> Reinig de adaptor-geligeerde product een tweede maal met 50 pi goed gemengde AMPure XP kralen, en elueer het product in 25 gl resuspensiebuffer in een schone PCR buis. </li></ol> 2.1.4) Amplify DNA-fragmenten <ol><li> Voeg 5 ul PCR Primer Cocktail en 25 pi PCR Master Mix aan de PCR-buis met adapter geligeerde product en meng. </li><li> Voer amplificatie in een voorgeprogrammeerde thermocycler onder de volgende omstandigheden: 98 ° C gedurende 30 seconden; 10 cycli van 98 ° C gedurende 10 sec, 60 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 30 seconden; vervolgens 72 ° C gedurende 5 min en houden op 10 ° C. </li><li> Ruim het reactiemengsel met 50 pi goed gemengde magnetische korrels, en elueer het eindproduct 30 gl resuspensiebuffer. </li></ol> 2.1.5) Bibliotheek Validation <ol><li> Kwantificeren van het eindproduct met behulp van een fluorometer protocol van de fabrikant. Bibliotheek uiteindelijke concentratie 2,5 tot 20 ng / ul. </li><li> Beoordeel de kwaliteit van het eindproduct met behulp van een analytisch instrument High Sensitivity DNA-chip volgens het protocol van de fabrikant. Verwacht een enkele band met de verwachte grootte voor beide IGVHFR1, IGVHFR2 of IGVHFR3. UERWACHTE grootte van de bibliotheek product is gelijk aan de grootte van de oorspronkelijke VDJ amplicon plus de grootte van de adapters (~ 125 bp). </li></ol> 2.2) VDJ-PCR Bibliotheek Pooling en Sequencing <ol><li> Bereken de molariteit van elke bibliotheek fractie met de volgende formule: nM = [(ng / 1000) / 660 bp *] x 10 9 ng waarbij de concentratie van het VDJ-PCR bibliotheek gemeten in stap 2.1.5.1 bp en is de piek grootte van de VDJ-PCR bibliotheek gemeten in stap 2.1.5.2. </li><li> Verdunnen de bibliotheek om 2 Nm (10 pi totaal) met DNase-vrij water. </li><li> Combineer de 10 ul van de verdunde 2 nM bibliotheken samen in een 1,5 ml buis. </li><li> Voeg een gelijk volume PhiX spike-controle in de 1,5 ml buis. </li><li> Laad het zwembad van 07:00 concentratie op een doorstroomcel. </li><li> Sequentie van de bibliotheken met behulp van een gepaarde-end 150 cyclus sequencer volgens het protocol van de fabrikant. </li></ol> 3. Data Analysis Opmerking: Een summAry van de bioinformatica scripts gebruikt in deze sectie kan worden gevonden als een aanvullende code bestand. 3.1) Alignment en QC <ol><li> Kaart gepaarde-end sequencing leest tegen een mens IGH V, D en J regio databank gedownload van de IMGT website 11 met behulp van een aangepaste nucleotide BLAST-algoritme op basis van &#39;blastn&#39; verkrijgbaar bij NCBI met gap geopend boete van 2, gap extension penalty van 1, woord lengte van 7, en e-drempelwaarde van 10 -4. Gooi de lees-pair niet in kaart zowel een IGH V en J regio. </li><li> Tel de resterende lezen-paren die IGH V en J mappings moeten de frequenties van bijpassende VJ combinaties in alle gelezen paren verkregen uit de sequencing run op het monster te verkrijgen. Graaf een read-pair wanneer wordt toegewezen aan zowel een IGH V en J-gen en voeg het allel in de overeenkomstige telling voor de specifieke combinatie VJ. </li><li> Rang de tellingen voor elk gecombineerd VDJ regio verkregen uit 3.1.2 van de hogeest tot het laagste. Het gebied VDJ heeft de hoogste leest telling wordt gedefinieerd als belangrijke omlegging combinatie. </li><li> Gooi uitgelijnde sequenties die minder dan 35% van het domein grote omlegging die in 3.1.3 dekken. </li></ol> 3.2) SHM Profiel Identification <ol><li> Tel alle SHM patronen over de leest van stap 3.1.3. Definieer elke SHM patroon als een subkloon. </li><li> Tel het aantal subklonen die overeenkomen met verschillende unieke SHM patronen, en het aantal gelezen die zijn toegewezen aan individuele subklonen. </li></ol> 3.3) grafische weergave van resultaten <ol><li> Voer de fylogenetische analyse van de subklonen met behulp van de bijbehorende SHM patronen met behulp van een wijk toetreden methode van R-pakket &quot;aap&quot; volgens het protocol van de fabrikant. Bereken een afstand matrix van de afzonderlijke verschillende uitlijningen de subkloon fylogenie verankerd aan de sequentie van de kiemlijn V opnieuwJ combinatie in kwestie voor elke gekoppelde sample set. </li><li> Gebruik de nucleotidesequentie van elke subkloon als teken vector en berekent de geschatte tekenreeks afstand tussen alle subklonen in grote VJ omlegging voor zowel diagnose en bijbehorende recidief monsters met een Levenshtein afstandsmaat wanneer mathematisch de afstand tussen twee uitlijning wordt gegeven door d x, y (i, j) waarbij d x, y (i, j) = 1 indien i ≠ j en 0 anders, en som functie over de lengte van de tekenreeks overeenkomen met sequenties i en j nucleotide. </li><li> Grafisch weer de resulterende matrix van subkloon afstanden en de bijbehorende subkloon tellingen in de volgende twee manieren: <ol><li> Gebruik R pakket &quot;MASS&quot; volgens het protocol van de fabrikant multidimensionale schaling toegepast op de subkloon afstandsmatrix en genereert een tweedimensionale coördinaten beginsel map, die vervolgens wordt uitgezet langs de logaritmevan subclonal geldt als de straal van de cirkel. </li><li> Bouwen een ongerichte grafiek op basis van de Levenshtein afstand, waarbij de hoekpunten corresponderen met elke afzonderlijke subkloon die voortvloeien uit de grote VJ omlegging. Opmerking: Als de afstand tussen twee verschillende klonen is gelijk aan dan bestaat er een grens tussen deze twee hoekpunten. Als de afstand groter is dan één, is er geen rand te verbinden. </li><li> Plot de grafiek van 3.3.3.2 met de tkplot functie in de &quot;iGraph&quot; R-pakket met de Kamada Kawai indeling volgens het protocol van de fabrikant. De straal van de hoekpunten is evenredig met de derde macht wortel van het aantal klonen in kaart gebracht worden gehouden en de arcering gebruikt een rode en blauwe bereik het aantal klonen dat ofwel tot de diagnose (blauw) of recidief (rood) monsters duiden . </li></ol></li></ol> 3.4) Heterogeniteit (Entropy) Meting <ol><li> Onderzoekt de aantallen en subkloon tellingen van deindividuele patronen van somatische hypermutatie zich in grote VJ omlegging per gekoppelde set monsters. </li><li> Bereken de empirische entropie en overgebleven empirische entropie gecorrigeerd voor het aantal afzonderlijke klonen in elk monster met behulp van de standaard histogram gebaseerde entropie schatting. </li></ol>

<ol><li>Nowell, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clonal+evolution+of+tumor+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The clonal evolution of tumor cell populations.</a> Science. 194 (4260), 23-28 (1976).</li>
<li>Greaves, M., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in cancer.</a> Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-510 (2012).</li>
<li>Jiao, W., Vembu, S., Deshwar, A. G., Stein, L., Morris, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+clonal+evolution+of+tumors+from+single+nucleotide+somatic+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Inferring clonal evolution of tumors from single nucleotide somatic mutations.</a> BMC bioinformatics. 15, 35(2014).</li>
<li>Schatz, D. G., Ji, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombination+centres+and+the+orchestration+of+V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+immunology%22%5BJournal%5D)">Recombination centres and the orchestration of V(D)J recombination.</a> Nature reviews immunology. 11 (4), 251-263 (2011).</li>
<li>Jacob, J., Kelsoe, G., Rajewsky, K., Weiss, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraclonal+generation+of+antibody+mutants+in+germinal+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intraclonal generation of antibody mutants in germinal centres.</a> Nature. 354 (6352), 389-392 (1991).</li>
<li>Coiffier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOP+chemotherapy+plus+rituximab+compared+with+CHOP+alone+in+elderly+patients+with+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">CHOP chemotherapy plus rituximab compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse large-B-cell lymphoma.</a> N Engl J Med. 346 (4), 235-242 (2002).</li>
<li>Larouche, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoma+recurrence+5+years+or+later+following+diffuse+large+B-cell+lymphoma%3A+clinical+characteristics+and+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphoma recurrence 5 years or later following diffuse large B-cell lymphoma: clinical characteristics and outcome.</a> J Clin Oncol. 28 (12), 2094-2100 (2010).</li>
<li>Friedberg, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relapsed%2Frefractory+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Relapsed/refractory diffuse large B-cell lymphoma.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2011, 498-505 (2011).</li>
<li>Gisselbrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salvage+regimens+with+autologous+transplantation+for+relapsed+large+B-cell+lymphoma+in+the+rituximab+era%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Salvage regimens with autologous transplantation for relapsed large B-cell lymphoma in the rituximab era.</a> J Clin Oncol. 28 (27), 4184-4190 (2010).</li>
<li>Lefranc, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT%2C+the+International+ImMunoGeneTics+Information+System+for+Immunoinformatics+%3A+methods+for+querying+IMGT+databases%2C+tools%2C+and+web+resources+in+the+context+of+immunoinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biotechnology%22%5BJournal%5D)">IMGT, the International ImMunoGeneTics Information System for Immunoinformatics : methods for querying IMGT databases, tools, and web resources in the context of immunoinformatics.</a> Molecular biotechnology. 40 (1), 101-111 (2008).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+reveals+clonal+evolution+patterns+and+mutation+events+associated+with+relapse+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing reveals clonal evolution patterns and mutation events associated with relapse in B-cell lymphomas.</a> Genome biology. 15 (8), 432(2014).</li>
<li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+terminally+differentiated+mature+B+lymphocytes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.</a> Cell. 133 (2), 250-264 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Door de bijna onbeperkt aantal herhalingen van de sequentie-informatie gecodeerd door VDJ herrangschikking en SHM de IGH locus van menselijke B-cellen, onderzocht de gehele IGH repertoire van high-throughput deep-sequencing bleek een efficiënte en volledige wijze te bakenen klonale worden en sub-klonale B-cel populaties. Bovendien kan deze strategie worden gebruikt om de klonale evolutiepad van B-cel tumorontwikkeling, vermindering en terugval studie door vergelijking van de klonale en sub-klonale architecturen van pati...

Kanker is een klonale ziekte. Sinds dertig jaar geleden Peter C. Nowell voorgesteld kanker klonale evolutie model 1, hebben vele studies geprobeerd klonale populaties ontleden in tumormonsters reconstrueren klonale expansie en evolutie patronen die de tumorigenese proces 2 ten grondslag liggen. Onlangs heeft het hele genoom sequencing onderzoekers nodig om een diepe blik op de klonale heterogeniteit en de evolutie 3,4 nemen. Echter, vanwege het gebrek aan handelbaar markers in vele celtypen is het moeilijk om de precieze klonale architectuur en evolutionaire weg afleiden. Gelukkig is er een natuurlijke klonaliteit marker in rijpe B-cellen van die vele lymfoïde maligniteiten, met inbegrip van DLBCL, afkomstig. In antwoord op antigen stimulatie, kan elke B-cel een productieve IgH VDJ sequentie samen door bij een VH (variabel), D (diversiteit), en J H (verbinden) segment uit een grote pool van deze segmenten. Tijdens deze process kunnen kleine gedeelten van de oorspronkelijke sequentie verwijderd en aanvullende niet-matrijs nucleotiden worden toegevoegd aan een unieke VDJ herrangschikking te creëren. Deze specifieke VDJ omlegging kan worden overgenomen in alle nakomelingen van deze B-cellen, dus etiketteren individuele mature B-cel en zijn nakomelingen 5. Bovendien SHM gebeurt op gerecombineerde VDJ-sequenties in de daaropvolgende kiemcentra (GC) reactie aanvullende mutaties voor de uitbreiding van het antilichaam pool en de versterking van antilichaamaffiniteit 6. Daarom is door het vergelijken en contrasterende VDJ en SHM patronen van lymfoom monsters die deze processen hebben ondergaan, intra-tumor heterogeniteit kon worden afgebakend en klonale evolutie pad van de ziekte kan worden afgeleid. Voorheen kon VDJ herrangschikking en SHM geïdentificeerd met PCR amplificeren van het gerecombineerde gebieden, het kloneren van de PCR producten en vervolgens Sanger sequentiebepaling sequentie informatie te verkrijgen. Deze aanpak is lage doorvoer en lage opbrengst binnenhalen slechts een klein deel van de gehele gerecombineerde VDJ repertoire en belemmeren de karakterisering van de algemene representatie van de klonale populatie binnen een bepaald monster. Een aangepaste aanpak werd gecreëerd door het genereren van NGS geïndexeerd sequencing bibliotheken van VDJ PCR-producten en het uitvoeren van PE 2x150 bp sequencing om meer dan een half miljoen gerecombineerde VDJ sequenties per monster te verkrijgen. Daarnaast werd een aangepaste pipeline ontwikkeld voor kwaliteitscontrole (QC) uitvoeren, uitlijnen, filter VDJ sequentiebepaling leest herschikkingen en SHMS van elke lees- identificeren en uitvoeren fylogenetische analyse van de klonale architectuur van elk monster. Daarnaast is een nieuwe benadering ingesteld om verder te karakteriseren de klonale evolutie patronen voor monsters in verschillende ziektestadia. We hebben deze techniek DLBCL patiënt monsters toegepast. DLBCL is een agressieve vorm van non-Hodgkin lymfoom frequent terugval in maximaal één thIRD van de patiënt 7. DLBCL recidieven normaal optreden vroeg, binnen 2 tot 3 jaar van de initiële diagnose, hoewel sommige doen zich na 5 jaar 8. Prognose voor recidiverende patiënten is slecht, met slechts 10% bereiken van 3 jaar progressievrije overleving als gevolg van beperkte behandelingsmogelijkheden. Dit is de basis voor de dringende behoefte aan nieuwe benaderingen van DLBCL terugval 9,10 behandelen. Echter, moleculaire mechanismen geassocieerd met DLBCL terugval zijn nog grotendeels onbekend. Vooral de rol van klonale heterogeniteit bij diagnose en klonale veranderingen tijdens DLBCL terugval ontwikkeling momenteel gekarakteriseerde, waardoor het moeilijk om een ​​accurate en bruikbare biomarker terugval voorspellen definiëren. Om deze vragen te beantwoorden, passen we onze VDJ-sequencing aanpak op meerdere paren van overeenkomstige primaire diagnose-recidief DLBCL monster paren. Twee verschillende klonale evolutionaire scenario van terugval voortgekomen uit de vergelijking van de klonale architecturen tussen diagnose en recidief samples die meerdere moleculaire mechanismen betrokken zouden kunnen zijn bij DLBCL terugval.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-170</td><td>200 proof, voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td>10 mM Tris&middot;Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA</td></tr><tr><td>Xyleen</td><td>VWR</td><td>EM-XX0055-6</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Proteinase K&nbsp;</td><td>Life Technonogies</td><td>25530-015</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>Deoxynucleotidetrifosfaat (dNTP) oplossingsmix</td><td>Promega</td><td>U1515</td><td>10 mM elk nucleotide</td></tr><tr><td>10x PCR Buffer&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11699105001</td><td>Zonder MgCl2</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold DNA-polymerase met Gold Buffer en MgCl2</td><td>Life Technonogies</td><td>4311806</td><td>50 &micro;l bij 5 U/&micro;l</td></tr><tr><td>Specimen Control Size Ladder</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>2-096-0020</td><td>33 reacties</td></tr><tr><td>IGH Somatische hypermutatie-assay v2.0 - Gel-detectie</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>5-101-0030</td><td>33 reacties, Mix 2 voor IGVHFR1-detectie</td></tr><tr><td>IGH Gen Clonaliteit Assay - Gel-detectie</td><td>Invivoscribe Technologies&nbsp;</td><td>1-101-0020</td><td>33 reacties, Buisla B voor IGVHFR2-detectie</td></tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA-polymerase</td><td>Promega</td><td>M8291</td><td>20 &micro;l bij 5 U/&micro;l</td></tr><tr><td>10X Tris-boraat-EDTA (TBE) buffer</td><td>Corning (cellgro)</td><td>46-011-CM</td><td>6x1 L</td></tr><tr><td>50x TAE BUFFER&nbsp;&nbsp;</td><td>VWR</td><td>101414-298</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>25 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10597011</td><td>1 &micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>100 bp DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>15628-019</td><td>1 &micro;g/&micro;l</td></tr><tr><td>UltraPure agarose</td><td>Life Technologies</td><td>16500-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>40% Acrylamide/Bis-oplossing</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>50 kolommen</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>Resuspensiebuffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>End repair mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>A-tailing mix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Ligatiemix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>DNA-adapterindex (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Stopligatiebuffer (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR-primercocktail (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>PCR-mastermix (Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Kit v2)</td><td>Illumina</td><td>FC-121-2001</td><td></td></tr><tr><td>Magneetstandaard</td><td>Life Technologies</td><td>4457858</td><td></td></tr><tr><td>Gelbeeldsysteem</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>170-8370</td><td></td></tr></tbody></table>

vdj-seq: deep sequencing analyse van rearranged immunoglobuline zware keten gen klonale evolution patronen van b cel lymfoom reveal

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analysis of Rearranged Immunoglobulin Heavy Chain Gene to Reveal Clonal Evolution Patterns of B Cell Lymphoma

Begrip tumor klonaliteit is van cruciaal belang voor het begrijpen van de betrokken zijn bij het ontstaan ​​van tumoren en de progressie van de ziekte mechanismen. Verder inzicht in de klonale samenstelling veranderingen die binnen een tumor in reactie op bepaalde micro-omgeving of behandelingen kunnen leiden tot het ontwerp van betere en meer doeltreffende methoden om tumorcellen te roeien. Echter, het bijhouden tumor klonale subpopulatie uitdagend vanwege het gebrek aan onderscheiden markeringen. Om dit probleem aan te pakken, werd een VDJ-seq protocol gemaakt om de klonale evolutie patronen van diffuus grootcellig B-cellymfoom (DLBCL) terugval op te sporen door gebruik VDJ recombinatie en somatische hypermutatie (SHM), twee unieke kenmerken van B-cel lymfomen. In dit protocol werden de next-generation sequencing (NGS) bibliotheken met indexering potentieel opgebouwd uit versterkte herschikte immunoglobuline zware keten (IgH) VDJ regio van paren van primaire diagnose en recidief DLBCL samples. Op werden gemiddeld meer dan een half miljoen VDJ sequenties per monster verkregen na sequencing, die zowel VDJ omlegging en SHM informatie bevatten. Daarnaast werden aangepast bioinformatica pijpleidingen ontwikkeld om sequentie-informatie voor het karakteriseren van IgH-VDJ repertoire in deze monsters volledig te benutten. Bovendien is de pijpleiding maakt de reconstructie en vergelijking van de klonale architectuur van individuele tumoren, waarbij het onderzoek van de klonale heterogeniteit binnen de diagnose tumoren en aftrek van klonale evolutiepatronen tussen diagnose en recidief tumor paren mogelijk maakt. Bij de toepassing van deze analyse een aantal diagnose-terugval paren, we ontdekt belangrijkste bewijs dat meerdere onderscheidende tumor evolutionaire patronen kan leiden tot DLBCL terugval. Bovendien kan deze aanpak worden uitgebreid naar andere klinische aspecten, zoals identificatie minimale ziekte, monitoring terugval voortgang en respons op de behandeling, en het onderzoek van het immuunsysteem repertoirees in non-lymfoom contexten.

De algemene procedure van VDJ sequencing (VDJ-seq), waaronder DNA-extractie, gerecombineerde VDJ regio amplificatie en zuivering, sequentiebepaling bibliotheekconstructie, leest verwerking en fylogenetische analyse is weergegeven in figuur 1. Routinematig 5-200 ug DNA kan worden opgehaald uit stijf bevroren weefselcoupes of 0,5-20 ug DNA uit formaline gefixeerde in paraffine ingebedde weefselcoupes. Afhankelijk van de kwaliteit, omlegging patroon en SHM mate van individuele monsters, kan een verscheiden...

Dit protocol beschrijft een benadering om de gecombineerde immunoglobuline zware ketting VDJ-regio's van lymfomen te onderzoeken door middel van diep-sequencing en het ophalen van VDJ-herschikking en somatische hypermutatiestatus om de clonale architectuur van individuele tumoren te bepalen. Het vergelijken van clonale architectuur tussen gepaarde diagnose- en terugvalsteekproeven onthult de modi van lymfoomterugval-evolutie.

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal

Understanding tumor clonality is critical to understanding the mechanisms involved in tumorigenesis and disease progression. In addition, understanding ...

Het algemene doel van deze procedure is om de clonale samenstelling van lymfoommonsters te karakteriseren voor de identificatie van patronen in de clonale evolutie bij lymfoomrecidieven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van lymfomen, zoals de wijze waarop recidiverende tumoren voortkomen uit de oorspronkelijke tumoren. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het de nieuwste high-throughput sequencing-technologie aanpast om een uitgebreidere kaart van de gemeenschappelijkheden bij lymfomen mogelijk te maken.In dit protocol wordt DNA geëxtraheerd uit dunne coupes van zowel in OCT ingebed bevroren weefsel als uit in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed normaal of maligne weefsel, om DNA te extraheren uit in OCT ingebed bevroren weefsel. Verteer eerst 10 tot 30 dunne coupes in vier milliliter nucleïnezuur-lysisbuffer met protease K en 0,625% SDS gedurende één nacht in een waterbad van 37 °C. Voeg de volgende dag één milliliter verzadigde vijf molar natriumchloride toe aan het verteringsmengsel, schud krachtig gedurende 15 seconden en centrifugeer 15 minuten lang bij 1.100 ×g.Breng het supernatant bij kamertemperatuur ove

vdj-seq-deep-sequencing-analysis-rearranged-immunoglobulin-heavy

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).

Gecombineerd Immunofluorescentie en DNA FISH op 3D-bewaarde interfase kernen aan veranderingen in 3D Nuclear Organisatie Studie

Synthese van humane monoklonale antilichamen is de eerste stap in studies die gericht zijn op het ontrafelen van de pathofysiologische mechanismen van auto-antilichaam-gemedieerde immuunresponsen. We hebben een protocol ontwikkeld om recombinante humane immunoglobuline G (IgG) monoklonale antilichamen te genereren van uit bloed gesorteerd B-cellen, inclusief B-cel isolatie, antilichaam klonen en in vitro synthese.

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Hier beschrijven we een gecombineerde flow cytometrische celsortering en een laag ingevoerde, volgende generatie bibliotheekconstructieprotocol dat is ontworpen om hoogwaardige, volledige exome data van de Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cellen van klassiek Hodgkin lymfoom (CHL) te produceren.

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

Hierin presenteren wij een protocol dat details de technische aspecten en essentiële eisen om robuuste IG gene sequentieanalyse bij patiënten met chronische lymfatische leukemie (CLL), gebaseerd op de opgedane ervaring van het initiatief van het Europeseonderzoek op CLL (ERIC).

Immunoglobuline Gene sequentieanalyse In chronische lymfatische leukemie: Van patiënt materiaal reeks interpretatie

We beschrijven hier protocollen voor de analyse en visualisatie van de structuur en de Grondwet van hele antilichaam repertoires. Het gaat hierbij om de overname van grote sequenties van antilichaam RNA met behulp van de volgende generatie sequencing.

Identificatie van muis en menselijk antilichaam Repertoires door Next-Generation Sequencing

De BSelex-methode om individuele antigeen-specifieke antilichamen van humane perifere bloed mononucleaire cellen te identificeren en te herstellen combineert Flowcytometrie met eencellige PCR en klonen.

Eencellige screening methode voor de selectie en terugwinning van antilichamen met de gewenste specifieke kenmerken van verrijkte menselijke geheugen B-celpopulaties

Hier wordt een test gepresenteerd om somatische hypermutatie binnen de immunoglobuline zware keten gen locus te kwantificeren met behulp van germinale centrum B cellen van muis Peyer's patches.

Analyse van somatische hypermutatie in de JH4-intron van Germinal Center B-cellen van Mouse Peyer's Patches

Het huidige protocol beschrijft een methode voor DNA-isolatie van bloedmonsters en darmbiopten, generatie van TCRβ- en IGH PCR-bibliotheken voor de volgende generatie sequencing, prestaties van een NGS-run en basisgegevensanalyse.

T- en B-celreceptor immuunrepertoireanalyse met behulp van next-generation sequencing

Deze video toont een effectieve techniek voor het differentiëren en het ontleden van de verschillende semi-transparante structuren van het menselijk glasachtig lichaam in post mortem ogen.

Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse

Een methode wordt beschreven voor de menselijke retinoblastoom tumoren verspreiden in muizen. Tumorcellen worden rechtstreeks geïnjecteerd in de ogen van het immuunsysteem van deficiënte muizen. Secundaire tumoren zijn met succes gebruik van beide cellen direct geoogst van menselijke tumoren en beschaafde tumorspheres.

Oprichting en Voortplanting van Human Retinoblastoom Tumoren in het immuunsysteem van deficiënte muizen

Leer VDJ-Seq voor diepgaande analyse van klonale evolutie in B-cellymfoom met behulp van high-throughput sequencing. Deze methode onthult patronen van tumorheterogeniteit en behandelingsresistentie.

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal (Video) | JoVE Journal

VDJ-Seq: Deep Sequencing Analyse van Rearranged immunoglobuline zware keten gen Klonale Evolution Patronen van B cel lymfoom Reveal

Meer video's verkennen