Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Het algemene doel van het volgende experiment is om technologie voor de meting van zuurstofconsumptie in microplaten te gebruiken om de functie van de elektronentransportketen, de TCA-cyclus, het bèta-oxidatiepad en substraattransporteurs te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de substraat- en injectieoplossingen voor de assay voor te bereiden. De tweede stap is het toevoegen van de injectieoplossingen aan een eerder gehydrateerde tric assay-cartridge om het apparaat voor de meting van zuurstofconsumptie te kalibreren.

Bereid vervolgens de mitochondriale substraatoplossingen voor en breng deze oplossingen aan in de celkweekplaat. Centrifugeer de celkweekplaat om de mitochondriale hechting aan de put van de plaat mogelijk te maken voordat de plaat in het respirometrische assay-instrument wordt geplaatst. De resultaten van het instrument tonen de zuurstofconsumptiesnelheden op basis van de mitochondriale respiratie voor elk respirometrisch assay.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de Clark-elektrode, is dat technologieën op basis van microplaten een efficiëntere en hogere doorvoer mogelijk maken voor het meten van het zuurstofverbruik met kleinere hoeveelheden mitochondria; over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege alle bewegende delen die betrokken zijn bij het bereiden van de oplossingen voor de assay. Hydrateer de avond voor het experiment de tric-assaycartridge in 1 mL kalibratieoplossing in een incubator zonder CO2 bij 37 °C. Haal de volgende dag alle bevroren stokjes eruit en ontdooi deze in een bad of incubator bij 37 °C. Bereid alle substraatoplossingen en injectie-oplossingen en bewaar deze op ijs. De volgende stap is het programmeren van het apparaat voor de meting van het zuurstofverbruik in multi-wellplaten met de juiste menggewicht- en meetparameters.

Start de analyse-software en selecteer de standaardmodus. Ga naar het seahorse guest forum en klik op de assay wizard. Zodra u in de assay wizard bent, klikt u op protocol om het menggewicht en de meetparameters te wijzigen.

Label de achtergrondputjes onder het tabblad 'back correction' en zorg dat deze worden gemarkeerd. Voer de achtergrondcorrectie uit. Label de condities door eerst op het tabblad 'groups and labels' te klikken, gevolgd door het tabblad 'group info'.

Nadat deze parameters zijn ingevoerd, klikt u op 'end' en vervolgens op 'save template'. Om deze procedure te starten, vult u de injectieoplossingen in een assay-runcartridge. Let erop dat de oplossingen in de juiste poorten worden geïnjecteerd.

Plaats de assay-cartridge in de machine met de inkeping in de linkerbenedenhoek. Start de kalibratie door eerst de analysesoftware te openen en vervolgens de standaardmodus te selecteren. Log in op het seahorse gastforum.

Open het opgeslagen sjabloon op de XF Drive onder het tabblad sjablonen. Zodra dit is geopend, klikt u op start om de kalibratie te beginnen, wat ongeveer 30 minuten duurt. De mitochondriën voor deze procedure werden geïsoleerd uit rode skeletspier; meng de mitochondriaal substraatvoorraad voorzichtig maar grondig door de oplossing zachtjes te roeren met een 200 µL pipetpunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde is afgesneden.

Nadat de proteïneconcentratie van de mitochondriale voorraad is bepaald, wordt 10 µg mitochondriale proteïne resuspendeerd per 200 µL van de succinaat-bekende substraatmengsels. Meng de mitochondriale substraatoplossing voorzichtig maar grondig door de oplossing zachtjes te roeren met een 200 µL pipetpunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde op dezelfde manier is afgeknipt. Resuspendeer 14 µg mitochondriale proteïne per 200 µL van elk van de overige substraatmengsels en plaats alle mitochondriale proteïne-substraatmengsels op ijs.

Plaats een 24-well celkweekplaat op ijs en vul in triplikaat 50 µL per well van elk van de mitochondriaal substraatmengsels. De ontwikkelaars van de microplaat-gebaseerde tric-assay raden aan om minimaal twee blanco wells zonder mitochondria achter te laten, bij voorkeur aan weerszijden van de celkweekplaat. Centrifugeer de celkweekplaat bij 2000 G gedurende 20 minuten bij 4 °C om de mitochondria aan de wells te laten hechten terwijl de plaat draait.

Warm de substraatoplossingen op in een waterbad van 37 °C. Nadat het centrifugeren is voltooid, brengt u voorzichtig 450 µL van elke substraatoplossing aan in de respectievelijke wells. Zorg ervoor dat de plaat bij kamertemperatuur wordt geladen.

Vul de blanco wells met 500 microliters blanco substraat. Wells die bestemd zijn voor de elektronenstroomassay moeten worden gevuld met het elektronenstroomsubstraat, terwijl de blanco wells voor de gekoppelde assay kunnen worden gevuld met elk gewenst koppelingsassay-substraat. Nadat 450 microliters substraat aan elke well is toegevoegd, dient de laag mitochondria in de well bij een 20 x vergroting te worden bekeken om te controleren of de mitochondria gelijkmatig zijn verdeeld in een enkele monolaag.

Zoals in dit voorbeeld wordt getoond, kunnen beeldputjes die geen gelijkmatig verdeeld monolaag lijken te hebben, na de oc-stap worden verwijderd. Neem na het bevestigen van de mitochondriale adhesie de celkweekplaat naar het Respir metric assay-instrument. Klik op ok.

De machine zal de hulpplaat die eerder voor kalibratie is gebruikt, uitstoten. Verwijder de hulpplaat en plaats de celkweekplaat met de mitochondriën op het plateau. De blauwe inkeping op de celkweekplaat moet in de linkerbenedenhoek van het plateau worden geplaatst.

Klik op doorgaan om de assay-run te starten, wat ongeveer 40 minuten duurt. Nadat de run is voltooid, druk op uitwerpen op het scherm om de celkweekplaat uit te werpen. Zodra de plaat is uitgeworpen, verwijdert en gooit u de celkweekplaat en de cartridge weg.

Klik op 'doorgaan' op het scherm. De run wordt automatisch opgeslagen als een XLS-bestand in het gegevensbestand. Open dit bestand en wijzig de weergave van O2 naar OCR door op de pijl naar beneden onder de Y1-markering te klikken.

Wijzig vervolgens het middelpunt naar 'point to point rates' onder de optie voor de weergave van snelheidgegevens. Klik op OK. Om deze wijzigingen toe te passen, klikt u op het tabblad 'well group mode' linksonder in het scherm om wells met vergelijkbare condities samen te voegen.

Klik ten slotte op het tabblad sample mean standard error in het midden van het scherm aan de linkerkant. Deze commando's kunnen ook vóór de assay worden ingesteld. Deze traceringen representeren de zuurstofconsumptiesnelheden of OCR versus tijd voor vier koppelingsassays.

Het eerste paneel stelt staat twee voor, respiratie of respiratie in afwezigheid van een DP. Het tweede paneel na injectie van een DP stelt de maximale gekoppelde respiratie voor, ook wel staat drie respiratie genoemd. Het derde paneel na injectie van oligomycine stelt de respiratie voor als gevolg van protonlekkage, ook wel staat vier oh respiratie genoemd.

Het vierde paneel na injectie van FCCP representeert de maximale ontkoppelde respiratie, ook wel State three U respiratie genoemd. Het vijfde paneel na injectie van antimycine A representeert de inhibitie van de oxidatieve respiratie. Alle mitochondriale toestanden vertonen een minimale standaarddeviatie vanwege de grondige menging van de mitochondriale stock en de substraatmengsels voor mitochondriën, en het verkrijgen van een enkele monolayer van mitochondriën na de adherentiespin.

Daarentegen leidt het laden van ongelijke hoeveelheden mitochondria in elke put en het niet bereiken van een enkele monolaag mitochondria tot een verhoogde standaarddeviatie in elke toestand, zoals aangegeven door de blauwe curve, die OCR-waarden boven 1, 500 ole per minuut laat zien, evenals afnemende respiratiesnelheden gedurende de meetperiode, geïllustreerd door de daling in de point-to-point snelheidswaarden. Let op dat de rode curve consistente point-to-point snelheden vertoont en dat de maximale OCR-waarden onder 1, 500 ole per minuut liggen. Overbelading van mitochondriaal eiwit kan ook leiden tot uitputting van zuurstof binnen de microkamer van de put, waardoor een nauwkeurige meting van de OCR voor elke opeenvolgende meting wordt belemmerd, zoals aangegeven door de blauwe curve, die O2-waarden laat zien die tijdens de meetperiode naar nul naderen, evenals significant verlaagde beginwaarden van O2 na elke opeenvolgende meting.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geduld te hebben bij het mengen van de mitochondria en de substraatoplossingen. Zodra deze methoden onder de knie zijn, kunnen aanvullende experimenten worden opgezet om extra vragen te beantwoorden, zoals: hoe beïnvloeden medicijnbehandelingen gericht op een specifieke substraattransporter het mitochondriale zuurstofverbruik?