Name: Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Leer microplaat-respirometrie met geïsoleerde mitochondriën uit muisskeletspier voor hoogdoorvoermetingen van zuurstofverbruik. Deze methode biedt efficiënte analyse van mitochondriale functie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Fralin Life Science Research Institute en The Metabolic Phenotyping Core aan Virginia Tech ondersteunden dit werk.

NB: Dit protocol begint na één is geïsoleerd mitochondriën van rood skeletspieren. Mitochondriën werden geïsoleerd zoals eerder beschreven van ~ 75 - 100 mg rode skeletspier 13. Tussen 5 - 10 ug / ul van mitochondriaal eiwit van deze hoeveelheid weefsel wordt bereikt door resuspenderen de laatste mitochondriale pellet in ≤50 ui isolatiebuffer van mitochondria (IBM) 2 (zie Frisard et al 13). 1. Setup <ol><li> Bereid werkvoorraad oplossing (Tabel 1) en mitochondriale test oplossing (MAS) mengsels (tabel 2) voor de volgende assays. Opmerking: De meeste van de voorbereiding van de testen kan tevoren als de meeste bestanden oplossingen en MAS kunnen worden opgeslagen. </li><li> Hydrateren een respirometrische Testcassette in 1 ml ijkoplossing de nacht vóór het experiment in een niet-CO2 incubator bij 37 ° C. </li><li> De dag van het experiment, take uit bevroren voorraden (substraten en mitochondriale modulators, MAS mix, MAS w / o BSA, tabel 1) en dooi in 37 ° C bad of incubator. </li><li> Bereid alle substraatoplossingen (Tabel 3) en injecties (Tabel 4-5) en pas pH wens (pH 7,4). Nadat de pH, slaan op ijs. </li><li> Programmeer de multiwell-zuurstofverbruik meetmachine de juiste mix, wacht en meet parameters (zie tabel 6) en labelachtergrond groep en / conditie putjes door eerst de analysesoftware, gevolgd door de &quot;Standard&quot; mode. <ol><li> Voer in de &quot;Guest&quot; forum en klik op de &quot;Assay Wizard&quot;. Eenmaal in de &quot;Test Wizard&quot;, klik op &quot;Protocol&quot; te mix te veranderen, wacht, en meet parameters. Label de achtergrond putten onder de &quot;Back. Correctie &quot;tab en zorg ervoor om&quot; Do achtergrond correctie &quot;. </li><li> Etiket conditions door eerst te klikken op de tab &quot;Groups &amp; Labels&quot;, gevolgd door de &quot;Groep Info&quot; tab. Nadat deze parameters zijn ingevoerd, klikt u op &quot;End&quot;, gevolgd door &quot;Template Opslaan&quot;. </li></ol></li></ol> 2. Assay Run <ol><li> Laad de injectieoplossingen in een test run cartridge en start de kalibratie door eerst de analysesoftware, gevolgd door invoeren van de &quot;Standard&quot; mode. Voer in de &quot;Guest&quot; forum. Open de sjabloon opgeslagen in stap 1.5 onder de &quot;XF&quot; drive, onder het tabblad &quot;Sjablonen&quot;. Eenmaal geopend, klikt u op &quot;Start&quot; om de kalibratie te beginnen. Opmerking: De test run cartridge moet in de machine met de getande hoek naar de linkerbenedenhoek worden ingevoerd. Dit duurt ongeveer 30 minuten. Zorg om oplossingen te injecteren in de juiste poorten. Injecties in tabel 4-5 zijn opgenomen in de volgorde van het laden. </li><li> Zacht, maar grondig de mitochond mixria voorraad door roeren van de oplossing met 200 ul pipetpunt, gevolgd door voorzichtig wrijven de voorraad met een 200 ul pipetpunt dat de opening verbreed door snijden ~ 3 mm van het uiteinde van de tip met een schaar heeft gehad. </li><li> Voer een bicinchoninezuur (BCA) assay voor de eiwitconcentratie van het mitochondriale voorraad te bepalen. </li><li> De voorraadconcentratie verkregen uit stap 2.3, resuspendeer 10 ug mitochondriale eiwit / 200 ul van de succinaat / rotenon substraatmengsel (Tabel 3). Resuspendeer 14 ug mitochondriale eiwit / 200 ul van het resterende substraat mengsels (Dit moet voor elk substraat mix) (Tabel 3). Plaats alle mitochondriale eiwit / substraat mengsels op ijs. Opmerking: De optimale hoeveelheid mitochondriaal eiwit per putje voor elke test werd bepaald zoals eerder beschreven 9. Er werd vastgesteld dat de pyruvaat / malaat, palmitoyl carnitine / malaat, glutamaat / malaat eend elektronenstroom assays maakt gebruik van 3,5 ug van mitochondriale eiwit, terwijl de succinaat / rotenone test maakt gebruik van 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje. Daarom moet de onderzoeker moet voldoende mitochondriale eiwitten te resuspenderen 4 repliceert in deze stap, omdat ofwel 2,5 ug of 3,5 ug per 50 ul per putje wordt geplaatst (zie stap 2,6). </li><li> Meng de mitochondriën / substraatoplossingen voorzichtig, maar grondig door roeren van de oplossing met een 200 ul pipet tip, gevolgd door voorzichtig tritureren de voorraad met een 200 ul pipet tip die tot 3 mm van het einde heeft afgesneden. </li><li> Plaats een celkweek plaat op ijs in drievoud belasting 50 gl / putje van elk van de mitochondria / substraat mixen. De ontwikkelaars van de microplaat respirometrische test raden het verlaten van een minimum van twee lege (geen mitochondriën) putten, bij voorkeur aan beide zijden op de celkweek plaat. </li><li> Draai de celkweek plaat bij 2000 g gedurende 20 min bij 4 ° C. Terwijl de plaat is spinning, warmen de substraat oplossingen in een 37 ° C waterbad. </li><li> Nadat de ronde is voltooid, zorgvuldig laden 450 pi van elke substraatoplossing bovenop zijn respectieve putjes (dwz, laadt de pyruvaat / malaat substraat aan de putjes die mitochondria aanvankelijk geresuspendeerd in deze substraatoplossing hebben). Zorg ervoor dat de plaat te laden bij kamertemperatuur. Opmerking: De lege putjes geladen met 500 pl substraat. Blanco putjes die voor de elektronenstroom bepaling worden geladen met de elektronenstroom substraat (Pyruvaat / malaat + FCCP), terwijl de gekoppelde assayblanco putjes kunnen worden beladen met de koppeling assay substraat. Opmerking: Als het uitvoeren van de gekoppelde en elektronenstroom assays op dezelfde plaat, moet de onderzoeker achtergrond putten toewijzen aan de respectieve testen na de test run is voltooid met de &quot;XF Reader&quot; platform via de tab &quot;Instrument&quot;. Eenmaal binnen de instelling &quot;Instrument&quot;, klik op de &quot;Administratie&quot;tab, gevolgd door &quot;Achtergrond Correction&quot;. Hit &quot;End Instrument Setup&quot; als voltooid. Dit is omdat de combinatie van ascorbaat / TMPD O 2, waardoor een aparte achtergrondcorrectie nodig is voor elk type assay kan consumeren. </li><li> Na 450 pl substraat toegevoegd aan elk putje, bekijk de laag van mitochondriën in de put te zorgen voor de mitochondriën gelijkmatig gedispergeerd in een monolaag (20x vergroting [zie Rogers 9 Figuur 4]). Wells die niet op een gelijkmatig verdeelde monolaag moeten worden verwijderd post hoc. </li><li> Na het inchecken voor mitochondriële therapietrouw, steek de microplaat in de respirometrische test instrument en start de test gerund door te klikken op &quot;OK&quot;. Opmerking: De kalibratie van stap 2.1 moet volledig zijn voordat de run begint. Zodra de onderzoeker klikt op &quot;OK&quot;, zal de machine het nut plaat die werd gebruikt voor de kalibratie uit te werpen. <ol> &lt;li&gt; Verwijder het nut bord en leg de celcultuur plaat die de mitochondriën op de lade bevat. De blauwe inkeping op de celkweek plaat moet in de linkerbenedenhoek van de lade worden geplaatst. Klik op &quot;verder&quot; om de test run te starten. </li></ol></li><li> Na de run is voltooid, verwijdert u de celcultuur plaat en de cartridge door op de &quot;Eject&quot; op het scherm. <ol><li> Zodra de plaat wordt uitgeworpen, te verwijderen en gooi de celkweek plaat en de cartridge en klik op &quot;Doorgaan&quot; op het scherm. De run wordt automatisch opgeslagen als een .xls-bestand in het bestand &quot;Data&quot;. </li></ol></li><li> Open dit bestand en de weergave van &quot;O2&quot; om &quot;OCR&quot; te wijzigen door op de pijl omlaag onder de &quot;Y1:&quot; marker. <ol><li> Volgende verandering &quot;Middle Point&quot; naar &quot;Point-to-Point Tarieven&quot; onder de &quot;Rate gegevens weergegeven als:&quot; optie. Klik op &quot;OK&quot; om deze wijzigingen toe te passen. </li></ol&gt; </li><li> Klik op het tabblad &quot;Nou Group Mode&quot; op linksonder in het scherm om de groep putten van vergelijkbare omstandigheden samen. Tot slot, klik op de &quot;steekproefgemiddelde / Standard Error&quot; tab naar het midden van het scherm naar links. Als alternatief kunnen deze opdrachten worden ingesteld voordat de test begint in de instelling &quot;Assay Wizard&quot;. Opmerking: Elke voorwaarde zal een gemiddelde ± standaarddeviatie weergegeven voor elk tarief en elke conditie hebben. Er zijn rate metingen per conditie (State 2 [Koppeling] / State3u [Electron Flow] ademhaling gevolgd door vier injecties). Gebruik het gemiddelde van de State 2 snelheid van de tweede meting, bepalen de Staat 4o op het minimum punt na oligomycin injectie de maximale punt van State 3 en staat 3u na respectievelijk ADP en FCCP injectie, en gebruik het minimum voor Antimycin A geïnduceerde ademhaling van de koppeling Testen. Gebruik de maximale voor pyruvaat / malaat geïnduceerde Staat 3u ademhaling, gebruik maken van de minimalevoor rotenone geïnduceerde ademhaling, gebruik dan de maximale voor succinaat geïnduceerde State 3u ademhaling, en gebruik het minimum voor Antimycin A geïnduceerde ademhaling van de Electron Flow test. Alle experimenten werden 3 keer uitgevoerd en de getoonde data zijn de resultaten van een representatieve tracing. </li></ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Wang, H., Hiatt, W. R., Barstow, T. J., Brass, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+muscle+mitochondrial+DNA+content%2C+mitochondrial+enzyme+activity+and+oxidative+capacity+in+man%3A+alterations+with+disease%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Applied+Physiology+and+Occupational+Physiology%22%5BJournal%5D)">Relationships between muscle mitochondrial DNA content, mitochondrial enzyme activity and oxidative capacity in man: alterations with disease.</a> European Journal of Applied Physiology and Occupational Physiology. 80, 22-27 (1999).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Research Reviews. 18C, 1-15 (2014).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Endocrinology and Metabolism. 307, E1117-E1124 (2014).</li>
<li>Disease Control and Prevention Services. National diabetes statistics report: estimates of diabetes and its burden in the United States. , US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2014).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nature Protocols. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS One. 6, e21746(2011).</li>
<li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 292, C125-C136 (2007).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif.). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+levels+of+lipopolysaccharide+modulate+mitochondrial+oxygen+consumption+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Low levels of lipopolysaccharide modulate mitochondrial oxygen consumption in skeletal muscle.</a> Metabolism. 64, 416-427 (2015).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Enzymology+and+Related+Subjects+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Advances in Enzymology and Related Subjects of Biochemistry. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Mitochondrial pathways and respiratory control. Gnaiger, E. , OROBOROS MiPNet Publications. Innsbruck. (2007).</li>
</ol>

George W. Rogers is een werknemer van Seahorse Bioscience dat het instrument waarvoor deze assays werden ontwikkeld produceert.

De informatie in dit artikel methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische testen met behulp van mitochondriën geïsoleerd 75-100 mg muis skeletspieren. Deze assays kunnen worden uitgevoerd met een hoge nauwkeurigheid zoals blijkt uit de nauwe standaardafwijking tussen drievoudige putjes. Belangrijk is dat deze respirometrische assays toelaten lokaliseren waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de ETC, TCA cyclus, β-oxidatie route substraat transporters, etc. Het is gebruikelijk diermodel. Het is belangrijk de rationale voor het gebruik van verschillende brandstoffen en inhibitoren gebruikt in dit protocol te markeren. Het pyruvaat / malaat en glutamaat / malaat respirometrische assays mogelijk maken de beoordeling van Complex I gemedieerde ademhaling, evenals de beoordeling van de respectieve transporteurs, en in het geval van glutamaat, de deaminase 15. Als alternatief kan de combinatie vansuccinaat / rotenone laat de beoordeling van mitochondriale respiratoire flux door Complex II van de ETC sinds rotenone remt complex I en succinaat biedt elektronen Complex II via de vermindering van flavineadeninedinucleotide (FADH 2) 15. Deze testen geven substraat specifieke informatie over koppelingsefficiëntie en maximaal ademhaling. De elektronenstroom test is uniek doordat de combinatie van substraten en remmers maakt de beoordeling van meerdere complexen in mitochondriale respiratoire flux 9. De aanvankelijke substraat mix van pyruvaat / malaat + FCCP maakt de evaluatie van de maximale ademhaling aangedreven door Complex I, terwijl de injectie van rotenon gevolgd door succinaat maakt de beoordeling maximale ademhaling aangedreven door Complex II. De injectie van Antimycin A, een remmer van complex III, gevolgd door de injectie van ascorbaat / TMPD kan de voor de evaluatie van de ademhaling veroorzaakt door Complex IV aangezien de Ascorbaat / TMPD eenelektron donor van cytochroom C / Complex IV. Hoewel geen informaties over koppelrendement wordt verkregen, is de werkwijze geschikt voor zeer kleine monsters te beletten dat het uitvoeren van meerdere substraten onafhankelijk. Tenslotte, het gebruik van palmitoyl carnitine / malaat maakt de beoordeling van de coördinatie tussen β-oxidatie en de ETC omdat de reducerende equivalente geproduceerd door de oxidatie van palmitinezuur (β-oxidatie) meegenomen in de ETC via de electron flavoproteïne 15 overdragen. Opgemerkt wordt dat de koppeling en elektronenstroom assays ook kunnen worden gebruikt in combinatie met veranderingen in de mitochondriale functie te identificeren vanwege enkele interventie (behandeling met geneesmiddelen, genetische manipulatie). De hoge nauwkeurigheid bereikt bij deze testen is voornamelijk het gevolg van grondig mengen van mitochondria, of het vóór eiwitbepaling, of met het substraat oplossingen. Langs deze lijnen, zodra de mitochondria is resuspendend in het substraat solutions, is het essentieel om deze oplossing grondig vóór het laden van de celkweek plaat zoals beschreven in stap 2.2 met een verbrede opening pipetpunt mengen. Als de mitochondriën meng leidt tot grote variatie binnen de assay. Bovendien, met een smalle opening pipetpunt wordt afschuifkrachten creëren tijdens het mengen van de mitochondriën en verhoogt het potentieel om de mitochondriale membranen en afgifte van cytochroom C. De hechting trap (2,7) is een kritische stap in het protocol beschadigen. Verzuim om de beladen celkweekplaat lang / snel genoeg draaien zal resulteren in een onvolledige naleving van de mitochondriën naar de bron, hetgeen leidt toegenomen variabiliteit tussen putten en metingen. Is geoptimaliseerd de beschreven protocol op te nemen: het laden van een optimale hoeveelheid van mitochondriaal eiwit per putje, met behulp van de juiste concentraties / bereidingswijzen om de balans en de ondergrond oplossingen te maken, het veranderen van de test run om mitochondriale staat pla zorgenteaus en passende vermenging van de mitochondriale voorraad en mitochondriale / substraat mixen. Voorafgaand aan deze optimalisatie inspanningen, de auteurs aangetroffen valkuilen in de test run. De volgende bespreekt methoden / wijzigingen die nuttig zijn bij het optimaliseren van dit protocol waren het oplossen van problemen. Met betrekking tot een optimale belading, zal het laden te weinig mitochondria niet ontlokken een robuuste reactie, tijdens het laden te veel mitochondriën zal de zuurstof uitlaat binnen de microkamer en leiden tot onnauwkeurige metingen. Rogers et al 9 geeft voorbeelden van het bepalen van de optimale belading hoeveelheden mitochondriën per goed voor microplaat respirometrische assays. Vaker, is te veel mitochondriën per geladen en, zoals blijkt uit de staat 2 tarieven meer dan 100-200 pmol / min / goed en de toestand 3 tarieven&gt; 1500 pmol / min / goed. Als over lading optreedt, voert een experiment met verschillende concentraties van mitochondriale eiwit (bijvoorbeeld tussen 1 -. 10 ug) tot OCRs lokken binnen de dynamische range van het zuurstofverbruik meetmachine. De voorbereiding en het gebruik van de juiste concentraties van substraten en de voorraden is van het allergrootste belang. Gebruik altijd de zure vorm van substraten / injecties en de pH met kalium hydroxide of HCl; natrium buffers / oplossingen worden niet aanbevolen. Daarnaast resuspenderen substraten / voorraden in DMSO of 100% ethanol zal resulteren in de meting storing of fout. Zorg ervoor dat u 95% ethanol te gebruiken indien aangegeven. Het is gebruikelijk palmitoyl carnitine neerslaan van de 95% ethanol na het ontdooien van de bevroren voorraad, waardoor grote variabiliteit. Zorg ervoor dat u op te warmen de palmitoyl carnitine voorraad en vortex goed voor gebruik. Bovendien kan een zeer variabele pyruvaat / malaat testresultaat vanwege het pyruvaat stock wezen&gt; 2 weken oud. Zorg ervoor dat bevroren monsters van pyruvaat om de 2 weken remake. De test run werd gewijzigd om 2-min metingen om mitochondriale staat plateaus zorgen. Als observatie van uitputting van ADP gewenst is, kan de onderzoekerverlenging van de meettijd onder het tabblad &quot;Protocol&quot; in het &quot;Test Wizard&quot; forum. Tot slot, grote variabiliteit treedt op wanneer de mitochondriale voorraad en mitochondriën plus substraatoplossingen niet volledig vóór het laden gehomogeniseerd. Als variabiliteit tussen de putten is hoog na de test run, moet u de substraat oplossing volledig te mengen voorafgaand aan het volgende experiment. Vortex nooit de mitochondriën / substraat oplossingen, in plaats van roer, puree, en voorzichtig vermaal met een verbrede opening pipetpunt. Er zijn enkele beperkingen van deze techniek die het vermelden waard zijn. Ten eerste, het aantal putten op de celkweekplaat voor deze testen is relatief laag (bijv., 24 wells en minstens 2 aangewezen blanco wells). Indien het gewenst is om alle 5 van deze testen uit te voeren op een plaat, de onderzoeker slechts in staat om de antwoorden van één muis te onderzoeken tegelijk. Er moet echter worden opgemerkt dat 96 ook instrumenten beschikbaar voor higher throughput. Ten tweede zijn er inherente sterke en zwakke punten beoordelen mitochondriale dysfunctie in geïsoleerde mitochondriën in vergelijking met intacte cellen 1. Enkele zwakke omvatten met minder fysiologische relevantie vergelijking met intacte cellen en induceren voorwerpen uit het isolatieproces. Tenslotte, het succes van deze werkwijze is afhankelijk van de kwaliteit van het mitochondriale isolatieproces. Hoewel sommige van deze testen zijn ofwel ontwikkeld in verschillende systemen of gevalideerd in andere dierlijke modellen, de hierin gepresenteerde methoden zijn eerste alle bovengenoemde bepalingen synthetiseren voor optimaal gebruik in een multi-well zuurstofverbruik meetmachine met de muis skeletspier. Belangrijk al 5 deze assays kunnen worden uitgevoerd met de hoeveelheid mitochondriën geïsoleerd uit ~ 75 - 100 mg muis skeletspieren, waardoor hoge doorvoer met minimale materiaal. Van groot belang is het vermogen van multi-wellzuurstofverbruik technologieën assays met minimale hoeveelheden mitochondria, gecombineerd met een geoptimaliseerde isolatie werkwijze uit te voeren, kan de onderzoeker een veelheid van andere experimenten met de rest van skeletspierweefsel (bv., western blots uitgevoerd, RT-PCR, enzymatische assays, etc.), die vaak een strijd met dit diermodel. Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden stap-voor-stap instructies voor het uitvoeren van een verzameling van microplaat respirometrische assays met minimale hoeveelheden muis skeletspieren. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden vereisen minimale hoeveelheden weefsel en mitochondria. Eenmaal knie, zal de hierin beschreven technieken kunnen onderzoekers een mogelijk mechanisme van een verbinding of genproduct op mitochondriale zuurstofverbruik bepalen een veelgebruikte diermodel.

De belangrijkste fysiologische rol van skeletspieren mitochondriën is om ATP te produceren tegen oxidatieve fosforylering 1. Belangrijker nog, skeletspieren mitochondriën een specifieke rol spelen in de inspanningscapaciteit 2, veroudering 3, degeneratieve ziekte 4 en type II diabetes 5. Als een vergrijzende samenleving, en type II diabetes zijn de 7e belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten 6, is de behoefte aan methoden die de mitochondriale functie te evalueren steeds vaker in het biomedisch onderzoek 7,8 geworden. Met name de meting van het zuurstofverbruik heeft uitzonderlijk nut bij de beoordeling van de mitochondriale functie, omdat het vertegenwoordigt de gecoördineerde functie tussen mitochondriale en nucleaire genomen om functionele componenten van oxidatieve fosforylering 9 te drukken. Verschillende technologieën bestaan ​​die het mogelijk maken de meting van het zuurstofverbruik in intacte cellen en isolerend mitochondriën 7-10. Verder zijn assays ontwikkeld voor meerdere celtypes en weefsels, en in een aantal soorten die het mogelijk maken de meting van mitochondriale pathways en respiratoire control 9,11,12. Er is echter momenteel een leegte in de literatuur met betrekking tot de samenstelling van al deze assays gebruikt mitochondriën geïsoleerd uit muizen skeletspieren voor gebruik in microplaat zuurstofverbruik technologieën. Belangrijker nog, het gebruik van microplaat respirometrische assays groeit onder mitochondriale biologen en zorgt voor een high throughput metingen met behulp van minimale hoeveelheden van geïsoleerde mitochondria 9. Daarom is een verzameling microplaat respirometrische assays ontwikkeld waarmee aanwijzen waar afwijkingen en / of aanpassingen kunnen voorkomen in de elektronentransportketen (ETC). Daarnaast werden twee extra microplaat respirometrische assays ontwikkeld dat de beoordeling van de coördinatie betwee staatn de tricarbonzuur (TCA) cyclus en ETC en tussen ß-oxidatie en de ETC. Belangrijk is dat de gepresenteerde methoden zorgen voor een duidelijke en beknopte manier om mechanistische veranderingen in de mitochondriale functie in een veel gebruikte diermodel meten.

```html
<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasicum, minimum 99,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride hexahydraat, ACS-reagens, 99,0-102,0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>HEPES minimaal 99,5% titratie</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Essentially Fatty&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyruwzuur, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Bewaar bij 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Bernsteenzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>L(-) Appelzuur, BioXtra, &ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>L-Glutaminzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-fenyleendiamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>99%, poeder [TMPD]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycine A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Carbonylcyanide 4-(trifluormethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Bewaar bij 2 - 8 &deg;C</td></tr><tr><td>fenylhydrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge;98% (TLC), poeder [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycine A van streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-difosfaat monokaliumzout dihydraat [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Bewaar bij RT</td></tr><tr><td>Pierce&trade; BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>
```

met behulp isolated mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor high throughput microplate respiratory metingen

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Mitochondria van skeletspieren spelen een specifieke rol in veel ziektepathologieën. Daarom is de meting van zuurstofverbruik als indicator van mitochondriale functie in dit weefsel steeds vaker gebruikelijk geworden. Hoewel er veel technologieën en tests bestaan die mitochondriale ademhalingsroutes meten in verschillende cellen, weefsels en soorten, is er momenteel een hiaat in de literatuur met betrekking tot de compilatie van deze tests met behulp van geïsoleerde mitochondria uit muisskeletspier voor gebruik in microplaat-gebaseerde technologieën. Belangrijk is dat het gebruik van microplaat-gebaseerde respirometrische tests groeit onder mitochondriale biologen omdat het met minimale hoeveelheden geïsoleerde mitochondria hoge doorvoermetingen mogelijk maakt. Daarom werd een verzameling microplaat-gebaseerde respirometrische tests ontwikkeld die mechanistische veranderingen/aanpassingen in zuurstofverbruik kunnen beoordelen in een veelgebruikt diermodel. De hier gepresenteerde methoden geven stap-voor-stap instructies om deze tests uit te voeren met een optimale hoeveelheid mitochondriaal eiwit en reagentia, en met hoge precisie zoals blijkt uit de minimale variantie over het dynamische bereik van elke test.

Figuur 1 zuurstofverbruik (OCR) voor de pyruvaat / malaat, succinaat / rotenone, palmitoyl carnitine / malaat, en glutamaat / malaat assays (Coupling Assays). Deze assay traces worden als Zuurstofverbruik Rate OCR, tegen de tijd zijn achtergrond correceted en worden weergegeven als point-to-point tarieven. Elk paneel vertegenwoordigt zuurstofverbruik in verschillende mitochondriale toestanden zoals beschreven door Chance en Williams 14. Het eerste paneel vertegenwoordigt basale zuurstofverbruik of State 2. De tweede paneel, na injectie van ADP, vertegenwoordigt maximale gekoppeld ademhaling, of State 3. Het derde paneel, na injectie van oligomycin A (een remmer van Complex V), vertegenwoordigt de ademhaling als gevolg proton lek, of State 4o. Het vierde paneel, na injectie van FCCP vertegenwoordigt maximale ontkoppeld ademhaling of State 3u. Tenslotte, het vijfde paneel, na injectie van Antimycin A vertegenwoordigt de remming van oxidatieve respiratie. Met name, all mitochondriale staten hebben minimale standaarddeviatie. Dit komt door grondig mengen van mitochondriale voorraad en mitochondria / substraat mixen en het bereiken van een monolaag van mitochondria na de hechting centrifugeren (stap 2,6). Anderzijds, loading ongelijke mitochondriën in elk putje en niet bereiken van een monolaag van mitochondriën in de put van de microplaat leidt tot grotere standaardafwijking in elke staat zoals weergegeven in figuur 2. De traces in figuur 1 scherm plateaus voor elke mitochondriale staat en voor elke ondergrond. Het plateau bereikt na twee meetcycli suggereert mitochondriale goede kwaliteit en de mitochondriën gehecht blijven aan de bron gedurende de gehele duur van de test. Bovendien kan het bereiken van een plateau maximale tarieven wenselijker omdat dit stelt de onderzoeker de gemiddelde OCR nemen deze mitochondriale toestanden, waardoor vertekening die kunnen optreden verminderendoor het willekeurig selecteren van een punt. De hoeveelheid mitochondriën per putje werd bepaald door optimalisatie studies. De optimale hoeveelheid mitochondriën per putje zou resulteren in State 2 weer tussen 100-200 pmol / min / well en state 3 prijzen &lt;1,500 pmol / min / well, aangezien deze waarden liggen binnen de zuurstof sensor dynamisch bereik van de multiwell-zuurstof verbruik meetmachine. Laden met teveel mitochondriaal eiwit per putje kan tot OCRs buiten het dynamische bereik van het instrument (Figuur 3A). Figuur 3 toont loading 3,5 ug mitochondriaal eiwit per putje (blauw tracing) vergeleken met laden 2,5 ug mitochondriaal eiwit per putje (red tracing) voor de succinaat / rotenone assay. Laden met teveel mitochondriaal eiwit per putje kan ook leiden tot uitputting van zuurstof in de microkamer van de put, waardoor accurate meting van OCR voorkomen voor elke volgende meting 9 (figuur 3B &lt;/ strong&gt;). Point-to-point OCR de momentane snelheid van verandering van de OCR. Als vlak, de OCR is stabiel / stabiel, maar als het verminderen, dan kan er een biologische of technische kwestie. De scherpe daling van OCR in State 3 en staat 3u ademhaling (figuur 3A) wordt veroorzaakt door uitputting van mitochondria de zuurstoftoevoer voor het einde van de meting (figuur 3B). Figuur 4 geeft OCR versus tijd voor de elektronenstroom assay. De tracering wordt gecorrigeerd en weergegeven zoals beschreven voor Figuur 1. Het eerste paneel in deze test vertegenwoordigt Staat 3u beademing op pyruvaat / malaat via Complex I. De tweede paneel, na injectie van rotenon, vertegenwoordigt remming van Complex I gemedieerde ademhaling. Het derde paneel, na injectie van succinaat, vertegenwoordigt substraat gestimuleerd Staat 3u met elektronen het invoeren van de ETC op Complex II (Complex II gemedieerde ademhaling). Het vierde paneel, na injectie van Antimycin A, vertegenwoordigt de remming van complexe III en dus totaal ademhaling. Tenslotte, het vijfde paneel, na injectie van ascorbaat / TMPD vertegenwoordigt Complex IV gemedieerde ademhaling. Net als het doordrukken in figuur 1, alle mitochondriale staten minimale standaardafwijking, en elk tarief of bijna heeft een plateau bereikt. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig1.jpg" /> Figuur 1. Koppeling assays. (A) 10 mM pyruvaat / 5 mM malaat, (B) 10 mM succinaat / 2 uM rotenon, (C) 40 uM palmitoyl carnitine / 1 mM malaat, en (D) 10 mM glutamaat / 10 mM malaat gekoppeld mitochondriale ademhaling test tracings zoals bepaald door multi-well meting van het zuurstofverbruik. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug voor alle testen behalve succinaat / rotenon, waarvan 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje gebruikt. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; PYR = Pyruvate; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; PAL-C = palmitoyl carnitine; GLUT = glutamaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig1large.png" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig2.jpg" /> Figuur 2. zeer variabel Pyruvate / Malate Assay. Zeer variabele 10 mM pyruvaat / 5 mM malaat test veroorzaakt door onvolledig mengen mitochondriën van de mitochondriale voorraad in de ondergrond / MAS mix, hetgeen leidt tot een variabele mitochondriale proeiwit lading in elk putje. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; PYR = Pyruvate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig3.jpg" /> Figuur 3. Overbelasting mitochondriaal eiwit voor de Succinate / Rotenon Assay. (A) Zuurstofverbruik tarieven buiten het dynamisch bereik van de multi-well zuurstofverbruik meetmachine veroorzaakt door het laden van 3,5 ug van mitochondriale eiwit per putje (blauw tracing) in vergelijking met het laden van 2,5 ug van mitochondriale eiwit per putje (rood tracing). (B ) Oxygen spanning naderen nul volgende ADP en FCCP injecties veroorzaakt door het laden van overmatige mitochondriaal eiwit (3,5 pg) per putje (blauw tracing) in vergelijking met het laden van een optimale hoeveelheid (2,5 pg) van mitochondriale eiwit per putje (rood tracing). Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen per mitochondriale eiwit bedrag. OCR = Zuurstof verbruik; ADP = adenosinedifosfaat; Oligo = oligomycin A; FCCP = Carbonyl cyanide 4 - (trifluormethoxy) fenylhydrazon; Anti-A = A Antimycin; SUCC = Succinate; ROT = Rotenon; O 2 = zuurstof; mm Hg = millimeter kwik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/53216/53216fig4.jpg" /> Figuur 4. elektronenstroom Assay. 5 mM pyruvaat / 1 mM malaat + 4 uM FCCP, electron flage mitochondriale ademhaling test tracing zoals bepaald door multi-well meting van het zuurstofverbruik. De waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Mitochondriale eiwit per putje geladen was 3,5 ug. Gegevens vertegenwoordigt n = 3 gepaarde biologische herhalingen. OCR = Zuurstof verbruik; Anti-A = A Antimycin; ASC = Ascorbate; TMPD = N, N, N &#39;, N&#39; -tetramethyl--p-fenyleendiamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53216/53216fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="0"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Stock Concentratie </td><td> MW </td><td> Final Volume </td><td> Mass Toegevoegd </td><td> Opmerkingen / Omschrijving </td></tr><tr><td></td><td> (M) </td><td> (g / mol) </td><td> (ml) </strong&gt; </td><td> (g of ml) </td><td></td></tr><tr><td> EGTA, pH 7,2 </td><td> 0.1 </td><td> 380,35 </td><td> 100 ml 1 M Tris Base </td><td> 3,801 g </td><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 238,3 </td><td> 250 ml Dih 2 O </td><td> 59. 57 g </td><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> MgCl2, hexahydraat </td><td> 1 </td><td> 203,31 </td><td> 250 ml Dih 2 O </td><td> 50,82 g </td><td> Bewaren bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Pyruvaat pH 7,4 </td><td> 0.1 </td><td> 88,06 (Komt zo 14.11 M oplossing) </td><td> 40 ml Dih 2 O </td><td> 0,283 ml pyrodruivenzuur </td><td> Voeg 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C, vers maken tweewekelijks </td></tr><tr><td> Succinaat pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 118,09 </td><td> 100 ml Dih 2 O </td><td> 9,4 g succinic zuur </td><td> Maak 1 ml porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Malaat, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> 100 ml 95% ethanol </td><td> 6,7 g appelzuur </td><td> Voeg 200 ul porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> TMPD </td><td> 0.01 </td><td> 164,25 </td><td> 10 ml </td><td> 0,0164 g </td><td> Voeg 300 ul aliquots en bewaar bij -20 ° C; Meng met een equimolaire hoeveelheid ascorbaat tot TMPD houden verminderde </td></tr><tr><td> Palmitoyl L-carnitine chloride </td><td> 0.01 </td><td> 436,07 </td><td> 1,14 ml van 95% ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Voeg 40 ul porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 0,006 </td><td> 791,06 </td><td> 0,987 ml van 95% ethanol </td><td> 0,005 g </td><td> Voeg 20 ul porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr&gt; <tr><td> FCCP </td><td> 0.01 </td><td> 254,17 </td><td> 3,9 ml 95% ethanol </td><td> 0,01 g </td><td> Voeg 40 ul porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 0.001 </td><td> 394,4 </td><td> 10 ml 95% ethanol </td><td> 0,0039 g </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 0,005 </td><td> 548,63 </td><td> 9,12 ml van 95% ethanol </td><td> 0,025 g </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> K + ADP </td><td> 0.5 </td><td> 501,32 </td><td> 3,9 ml Dih 2 O </td><td> 1,0 g </td><td> Bewaren bij -20 ° C </td></tr><tr><td> Appelzuur, pH 7,4 </td><td> 0.5 </td><td> 134,09 </td><td> 40 ml </td><td> 2,68 g </td><td> Voeg 200 ul porties en bewaar bij -20 ° C </td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabel 1. Stock Solutions <table border="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Reagens </td><td> Stock Concentratie </td><td> Mass Toegevoegd </td><td rowspan="2"> Final Molarity / Procent </td></tr><tr><td> (M) </td><td> (g of ml) </td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> - </td><td> 11,98 g </td><td> 70 mM </td></tr><tr><td> Mannitol </td><td> - </td><td> 20,04 g </td><td> 220 mm </td></tr><tr><td> Kalium monobasisch </td><td> - </td><td> 0,34 g </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> MgCl2, hexahydraat </td><td> 1 </td><td> 2,5 ml </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 1 </td><td> 1,0 ml </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0.1 </td><td> 5,0 ml </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Wezen Fatty Acid Free-BSA </td><td> - </td><td> 1,0 g </td><td> 0,20% </td></tr></tbody></table> . Tabel 2. MAS Mix pH 7,4, 500 ml: 25 ml Aliquot en bewaar bij -20 ° C * Opmerking: Uitsluiten BSA voor MAS mix gebruikt voor de test injecties. <table border="0"><tbody><tr><td> Substraat Medium </td><td> Eindconcentratie </td><td> Hoeveelheid voorraad (pl) </td><td> Bedrag van MAS * (ml) </td></tr><tr><td rowspan="2"> Pyruvaat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 5 mM </td><td> Pyruvaat: 1000 </td><td rowspan="2"> 9 </td></tr><tr><td> Malaat: 100 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Succicinate / Rotenon </td><td rowspan="2"> 10 mM / 2 pM </td><td> Succinate: 200 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Rotenone 20 </td></tr><tr><td rowspan="3"> * Pyruvaat / Malate + FCCP </td><td rowspan="3"> 5 mM / 1 mM / 4 pM </td><td> Pyruvaat: 500 </td><td rowspan="3"> 10 </td></tr><tr><td> FCCP: 4 </td></tr><tr><td> Malaat: 20 </td></tr><tr><td> Palmitoyl L-carnitine / Malate </td><td> 40 uM / 1 mM </td><td> Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td rowspan="2"> Glutamaat / Malate </td><td rowspan="2"> 10 mM / 10 mM </td><td> Glutamaat: 400 </td><td rowspan="2"> 10 </td></tr><tr><td> Malaat: 200 </td></tr></tbody></table> Tabel 3. Substraat Solutions pH 7,4: Voeg vers de dag van het experiment. * Elektronenstroom testoplossing. <table border="0"><tbody><tr><td> Injectie Medium </td><td> Concentratie </td><td> Hoeveelheid voorraad (pl) </td> &lt;td&gt; Bedrag van MAS (ml) </td><td> Hoeveelheid ingespoten in Cartridge </td><td> Eindconcentratie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> (Na injectie in de plaat) </td></tr><tr><td> ADP </td><td> 50 mM </td><td> 300 gl </td><td> 3 </td><td> 50 gl </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Oligomycin A </td><td> 20 pM </td><td> 10 gl </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> FCCP </td><td> 40 uM </td><td> 12 ul </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 ul </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr></tbody></table> Tstaat 4. Injecties voor Gekoppeld Testen pH 7,4. Maak fris de dag van het experiment. * Koppeling testen omvatten (maar zijn niet beperkt tot) pyruvaat / malaat, succinaat / rotenon, palmitoyl carnitine / malaat en glutamaat / malaat. <table border="0"><tbody><tr><td> Injectie Medium </td><td> Concentratie </td><td> Hoeveelheid voorraad (g of UL) </td><td> Bedrag van MAS (ml) </td><td> Hoeveelheid ingespoten in Cartridge </td><td> Uiteindelijke concentratie (Na geïnjecteerd in de plaat) </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> 20 pM </td><td> 60 ul </td><td> 3 </td><td> 50 gl </td><td> 2,0 uM </td></tr><tr><td> Succinate </td><td> 50 mM </td><td> 300 gl </td><td> 3 </td><td> 55 ul </td><td> 5,0 mm </td></tr><tr><td> Antimycin A </td><td> 40 uM </td><td> 24 μ; l </td><td> 3 </td><td> 60 ul </td><td> 4,0 uM </td></tr><tr><td> TMPD / Ascorabte </td><td> 1 mM, 100 mM </td><td> TMPD: 300 gl </td><td> 3 </td><td> 65 ul </td><td> 100 pM, 10 mM </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Ascorbate: 0,059 g </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 5. Injecties voor elektronenstroom Assay pH 7,4. Voeg vers de dag van het experiment <table border="0"><tbody><tr><td> Bevel </td><td> Tijd (min) </td><td> # Cycli </td></tr><tr><td> Kalibreren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 10 min (om de plaat op te warmen van therapietrouw stap) </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1 minuut </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Mijasure </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecteren A </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1 minuut </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecteren B </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1 minuut </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecteren C </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1 minuut </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 2 min </td></tr><tr><td> Injecteren D </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 1 minuut </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td> Maatregel </td><td> 2 min </td></tr></tbody></table> Tabel 6. Instrument Run Protocol.

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om technologie voor de meting van zuurstofconsumptie in microplaten te gebruiken om de functie van de elektronentransportketen, de TCA-cyclus, het bèta-oxidatiepad en substraattransporteurs te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de substraat- en injectieoplossingen voor de assay voor te bereiden. De tweede stap is het toevoegen van de injectieoplossingen aan een eerder gehydrateerde tric assay-cartridge om het apparaat voor de meting van zuurstofconsumptie te kalibreren.Bereid vervolgens de mitochondriale substraatoplossingen voor en breng deze oplossingen aan in de celkweekplaat. Centrifugeer de celkweekplaat om de mitochondriale hechting aan de put van de plaat mogelijk te maken voordat de plaat in het respirometrische assay-instrument wordt geplaatst. De resultaten van het instrument tonen de zuurstofconsumptiesnelheden op basis van de mitochondriale respiratie voor elk respirometrisch assay.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de Clark-elektrode, is dat technologieën op basis van microplaten een efficiëntere en hogere doorvoer mogelijk maken voor het meten van het zuurstofverbruik met kleinere hoeveelheden mitochondria; over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege alle bewegende delen die betrokken zijn bij het bereiden van de oplossingen voor de assay. Hydrateer de avond voor het experiment de tric-assaycartridge in 1 mL kalibratieoplossing in een incubator zonder CO2 bij 37 °C. Haal de volgende dag alle bevroren stokjes eruit en ontdooi deze in een bad of incubator bij 37 °C. Bereid alle substraatoplossingen en injectie-oplossingen en bewaar deze op ijs. De volgende stap is het programmeren van het apparaat voor de meting van het zuurstofverbruik in multi-wellplaten met de juiste menggewicht- en meetparameters.Start de analyse-software en selecteer de standaardmodus. Ga naar het seahorse guest forum en klik op de assay wizard. Zodra u in de assay wizard bent, klikt u op protocol om het menggewicht en de meetparameters te wijzigen.Label de achtergrondputjes onder het tabblad 'back correction' en zorg dat deze worden gemarkeerd. Voer de achtergrondcorrectie uit. Label de condities door eerst op het tabblad 'groups and labels' te klikken, gevolgd door het tabblad 'group info'.Nadat deze parameters zijn ingevoerd, klikt u op 'end' en vervolgens op 'save template'. Om deze procedure te starten, vult u de injectieoplossingen in een assay-runcartridge. Let erop dat de oplossingen in de juiste poorten worden geïnjecteerd.Plaats de assay-cartridge in de machine met de inkeping in de linkerbenedenhoek. Start de kalibratie door eerst de analysesoftware te openen en vervolgens de standaardmodus te selecteren. Log in op het seahorse gastforum.Open het opgeslagen sjabloon op de XF Drive onder het tabblad sjablonen. Zodra dit is geopend, klikt u op start om de kalibratie te beginnen, wat ongeveer 30 minuten duurt. De mitochondriën voor deze procedure werden geïsoleerd uit rode skeletspier; meng de mitochondriaal substraatvoorraad voorzichtig maar grondig door de oplossing zachtjes te roeren met een 200 µL pipetpunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde is afgesneden.Nadat de proteïneconcentratie van de mitochondriale voorraad is bepaald, wordt 10 µg mitochondriale proteïne resuspendeerd per 200 µL van de succinaat-bekende substraatmengsels. Meng de mitochondriale substraatoplossing voorzichtig maar grondig door de oplossing zachtjes te roeren met een 200 µL pipetpunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde op dezelfde manier is afgeknipt. Resuspendeer 14 µg mitochondriale proteïne per 200 µL van elk van de overige substraatmengsels en plaats alle mitochondriale proteïne-substraatmengsels op ijs.Plaats een 24-well celkweekplaat op ijs en vul in triplikaat 50 µL per well van elk van de mitochondriaal substraatmengsels. De ontwikkelaars van de microplaat-gebaseerde tric-assay raden aan om minimaal twee blanco wells zonder mitochondria achter te laten, bij voorkeur aan weerszijden van de celkweekplaat. Centrifugeer de celkweekplaat bij 2000 G gedurende 20 minuten bij 4 °C om de mitochondria aan de wells te laten hechten terwijl de plaat draait.Warm de substraatoplossingen op in een waterbad van 37 °C. Nadat het centrifugeren is voltooid, brengt u voorzichtig 450 µL van elke substraatoplossing aan in de respectievelijke wells. Zorg ervoor dat de plaat bij kamertemperatuur wordt geladen.Vul de blanco wells met 500 microliters blanco substraat. Wells die bestemd zijn voor de elektronenstroomassay moeten worden gevuld met het elektronenstroomsubstraat, terwijl de blanco wells voor de gekoppelde assay kunnen worden gevuld met elk gewenst koppelingsassay-substraat. Nadat 450 microliters substraat aan elke well is toegevoegd, dient de laag mitochondria in de well bij een 20 x vergroting te worden bekeken om te controleren of de mitochondria gelijkmatig zijn verdeeld in een enkele monolaag.Zoals in dit voorbeeld wordt getoond, kunnen beeldputjes die geen gelijkmatig verdeeld monolaag lijken te hebben, na de oc-stap worden verwijderd. Neem na het bevestigen van de mitochondriale adhesie de celkweekplaat naar het Respir metric assay-instrument. Klik op ok.De machine zal de hulpplaat die eerder voor kalibratie is gebruikt, uitstoten. Verwijder de hulpplaat en plaats de celkweekplaat met de mitochondriën op het plateau. De blauwe inkeping op de celkweekplaat moet in de linkerbenedenhoek van het plateau worden geplaatst.Klik op doorgaan om de assay-run te starten, wat ongeveer 40 minuten duurt. Nadat de run is voltooid, druk op uitwerpen op het scherm om de celkweekplaat uit te werpen. Zodra de plaat is uitgeworpen, verwijdert en gooit u de celkweekplaat en de cartridge weg.Klik op 'doorgaan' op het scherm. De run wordt automatisch opgeslagen als een XLS-bestand in het gegevensbestand. Open dit bestand en wijzig de weergave van O2 naar OCR door op de pijl naar beneden onder de Y1-markering te klikken.Wijzig vervolgens het middelpunt naar 'point to point rates' onder de optie voor de weergave van snelheidgegevens. Klik op OK. Om deze wijzigingen toe te passen, klikt u op het tabblad 'well group mode' linksonder in het scherm om wells met vergelijkbare condities samen te voegen.Klik ten slotte op het tabblad sample mean standard error in het midden van het scherm aan de linkerkant. Deze commando's kunnen ook vóór de assay worden ingesteld. Deze traceringen representeren de zuurstofconsumptiesnelheden of OCR versus tijd voor vier koppelingsassays.Het eerste paneel stelt staat twee voor, respiratie of respiratie in afwezigheid van een DP. Het tweede paneel na injectie van een DP stelt de maximale gekoppelde respiratie voor, ook wel staat drie respiratie genoemd. Het derde paneel na injectie van oligomycine stelt de respiratie voor als gevolg van protonlekkage, ook wel staat vier oh respiratie genoemd.Het vierde paneel na injectie van FCCP representeert de maximale ontkoppelde respiratie, ook wel State three U respiratie genoemd. Het vijfde paneel na injectie van antimycine A representeert de inhibitie van de oxidatieve respiratie. Alle mitochondriale toestanden vertonen een minimale standaarddeviatie vanwege de grondige menging van de mitochondriale stock en de substraatmengsels voor mitochondriën, en het verkrijgen van een enkele monolayer van mitochondriën na de adherentiespin.Daarentegen leidt het laden van ongelijke hoeveelheden mitochondria in elke put en het niet bereiken van een enkele monolaag mitochondria tot een verhoogde standaarddeviatie in elke toestand, zoals aangegeven door de blauwe curve, die OCR-waarden boven 1, 500 ole per minuut laat zien, evenals afnemende respiratiesnelheden gedurende de meetperiode, geïllustreerd door de daling in de point-to-point snelheidswaarden. Let op dat de rode curve consistente point-to-point snelheden vertoont en dat de maximale OCR-waarden onder 1, 500 ole per minuut liggen. Overbelading van mitochondriaal eiwit kan ook leiden tot uitputting van zuurstof binnen de microkamer van de put, waardoor een nauwkeurige meting van de OCR voor elke opeenvolgende meting wordt belemmerd, zoals aangegeven door de blauwe curve, die O2-waarden laat zien die tijdens de meetperiode naar nul naderen, evenals significant verlaagde beginwaarden van O2 na elke opeenvolgende meting.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om geduld te hebben bij het mengen van de mitochondria en de substraatoplossingen. Zodra deze methoden onder de knie zijn, kunnen aanvullende experimenten worden opgezet om extra vragen te beantwoorden, zoals: hoe beïnvloeden medicijnbehandelingen gericht op een specifieke substraattransporter het mitochondriale zuurstofverbruik?

using-isolated-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Bio-energetische en metabolomische studies op mitochondriën hebben hun veelzijdige rol bij veel ziekten aan het licht gebracht, maar de isolatiemethoden voor deze organellen variëren. De hier beschreven methode is in staat om hoogwaardige mitochondriën uit meerdere weefselbronnen te zuiveren. De kwaliteit wordt bepaald door ademhalingscontroleratio's en andere meetwaarden die worden beoordeeld met respirometrie met hoge resolutie.

Robuuste mitochondriale isolatie van knaagdierweefsel 

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

In deze studie beschrijven we een eenvoudige methode om Evans Blue Dye (EBD) analyse uit te voeren op zebravislarven. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel voor de karakterisering van de integriteit van skeletspieren en de afbakening van zebravismodellen van spierdystrofie, en is een waardevolle methode voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische behandelingen.

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

Leer microplaat-respirometrie met geïsoleerde mitochondriën uit muisskeletspier voor hoogdoorvoermetingen van zuurstofverbruik. Deze methode biedt efficiënte analyse van mitochondriale functie.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen (Video) | JoVE Journal

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Meer video's verkennen