Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen
30 oktober 2015
De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.
Het algemene doel van het volgende experiment is om microplaatgebaseerde zuurstofverbruikstechnologie te gebruiken om de functie van de elektronentransportketen, TCA-cyclus beta-oxidatieroute en substraattransporteurs te beoordelen. Dit wordt bereikt door eerst de substraat- en injectieoplossingen voor de test voor te bereiden. De tweede stap is om de injectieoplossingen toe te voegen aan een eerder gehydrateerde tric-testcartridge om de zuurstofverbruiksmachine te kalibreren.
Bereid vervolgens de mitochondriale substraatoplossingen voor en laad deze oplossingen in de celcultuurplaat. Draai de celcultuurplaat om mitochondriale hechting aan de plaatput mogelijk te maken voordat de plaat in de Respira metrische test wordt geladen. Er worden instrumentresultaten verkregen die zuurstofverbruikscijfers laten zien op basis van mitochondriale ademhaling voor elke respiro metrische test.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals de Clark Electrode, is dat microplaatgebaseerde technologieën een efficiëntere en hogere doorvoer van zuurstofverbruik mogelijk maken met kleinere hoeveelheden mitochondria, over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege alle bewegende delen die betrokken zijn bij het voorbereiden van de oplossingen voor de test. Op de avond voor het experiment, hydrateer de tric-testcartridge in één milliliter kalibratieoplossing in een niet-CO2-incubator bij 37 graden Celsius. De volgende dag, haal alle bevroren stengels eruit en ontdooi ze in een 37 graden Celsius bad of incubator. Bereid alle substraatoplossingen en injectieoplossingen voor en bewaar ze op ijs. De volgende stap is om de multi-well zuurstofverbruiksmeetmachine te programmeren naar de juiste mixgewicht en meetparameters.
Ga naar de analysesoftware en selecteer de standaardmodus. Ga naar het gastforum van de zeepaard en klik op de testwizard. Zodra u in de testwizard bent, klikt u op protocol om de mixgewicht en meetparameters te wijzigen.
Label de achtergrondputten onder het tabblad achtergrondcorrectie en zorg ervoor dat deze worden gemarkeerd. Voer achtergrondcorrectie uit. Label de voorwaarden door eerst op de groepen en labels tab te klikken, gevolgd door de groepsinformatie tab.
Nadat deze parameters zijn ingevoerd, klikt u op einde gevolgd door sjabloon opslaan. Om deze procedure te starten, laadt u de injectieoplossingen in een testruncartridge. Zorg ervoor dat de oplossingen in de juiste poorten worden geïnjecteerd.
Laad de testruncartridge in de machine met een gekartelde hoek naar de linkeronderkant. Start de kalibratie door eerst de analysesoftware te openen, gevolgd door het invoeren van de standaardmodus. Ga naar het gastforum van de zeepaard.
Open de opgeslagen sjabloon onder de XF Drive onder het tabblad sjablonen. Zodra deze geopend is, klikt u op start om de kalibratie te starten, die ongeveer 30 minuten duurt. De mitochondria voor deze procedure werden geïsoleerd uit rood skeletspierweefsel, mengde voorzichtig maar grondig de mitochondria substraatvoorraadoplossing door voorzichtig te roeren, en itereerde de oplossing met een 200 microliter pipettepunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde was afgesneden.
Na het bepalen van de eiwitconcentratie van de mitochondriale voorraad, hervat u 10 microgram mitochondriaal eiwit per 200 microliter van de succinaat rot bekende substraatmix. Meng de mitochondria substraatoplossing voorzichtig maar grondig door voorzichtig te roeren, en itereer de oplossing met een 200 microliter pipettepunt waarvan ongeveer drie millimeter van het uiteinde was afgesneden op dezelfde manier. Reeses Band, 14 microgram mitochondriaal eiwit per 200 microliter van elk van de overige substraatmixen. Plaats alle mitochondriale eiwit substraatmixen op ijs.
Plaats een 24-well celcultuurplaat op ijs en laad in drievoudig 50 microliter per put van elk van de mitochondria substraatmixen. De ontwikkelaars van de microplaat gebaseerde tric-test bevelen aan om minimaal twee lege putten achter te laten zonder mitochondria, bij voorkeur aan beide kanten van de celcultuurplaat. Draai de celcultuurplaat bij 2000 G gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om de mitochondria aan de putten te hechten terwijl de plaat draait.
Verwarm de substraatoplossingen in een 37 graden Celsius waterbad. Nadat het draaien voltooid is, laadt u voorzichtig 450 microliter van elke substraatoplossing bovenop de respectieve putten. Zorg ervoor dat de plaat bij kamertemperatuur wordt geladen.
Laad lege putten met 500 microliter substraat blanco. Putten die zijn aangewezen voor de elektronenstroomtest, moeten worden geladen met de elektronenstroom substraat, terwijl de gekoppelde test blanco putten kunnen worden geladen met een willekeurige koppeltest substraat. Nadat 450 microliter substraat aan elk is toegevoegd, bekijkt u de laag mitochondria in de put bij 20 x vergroting om ervoor te zorgen dat de mitochondria gelijkmatig in een enkele monolaag zijn verspreid.
Zoals in dit voorbeeld wordt getoond, kunnen putten met beelden die geen gelijkmatig verdeelde monolaag lijken te hebben, worden verwijderd na post-oc. Na het bevestigen van mitochondriale hechting, neemt u de celcultuurplaat naar het Respir metrische testinstrument. Klik op OK.
De machine zal de hulpplaat die eerder voor kalibratie is gebruikt, uitwerpen. Verwijder de hulpplaat en plaats de celcultuurplaat die de mitochondria bevat op de lade. De blauwe inkeping op de celcultuurplaat moet in de linkeronderhoek van de lade worden geplaatst.
Klik op doorgaan om de testrun te starten, die ongeveer 40 minuten duurt. Nadat de run voltooid is, drukt u op uitwerpen op het scherm om de celcultuurplaat uit te werpen. Zodra de plaat is uitgeworpen, verwijdert en gooit u de celcultuurplaat en cartridge weg.
Klik op doorgaan op het scherm. De run wordt automatisch opgeslagen als een XLS-bestand in het databestand. Open dit bestand en verander de weergave van O2 naar OCR door op de neerwaartse pijl onder de Y een marker te drukken.
Verander vervolgens het middenpunt naar punt-tot-punt tarieven onder de tariefgegevens weergegeven als optie. Klik op OK. Om deze wijzigingen toe te passen, klikt u op het tabblad welgroepmodus linksonder op het scherm om wellen met ver
Overzicht
Dit artikel presenteert methoden voor het uitvoeren van microplaat-gebaseerde respirometrische analyses met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit muisskeletspier. Deze analyses meten veranderingen in mitochondriële zuurstofconsumptie en geven inzicht in metabole aanpassingen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Metabole fysiologie
Achtergrond
- Microplaat-gebaseerde technologieën verbeteren de efficiëntie van zuurstofconsumptiemetingen.
- Geïsoleerde mitochondriën uit skeletspier dienen als model voor het bestuderen van mitochondriële functie.
- Het begrijpen van mitochondriële ademhaling is cruciaal voor inzichten in metabole ziekten.
- Traditionele methoden zoals de Clark Elektrode zijn minder efficiënt voor hoogdoorvoeranalyse.
Doel van het onderzoek
- Om de functie van de elektronentransportketen en TCA-cyclus te beoordelen.
- Om mitochondriële aanpassingen te evalueren in reactie op verschillende substraten.
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor onderzoekers die nieuw zijn met deze methode.
Gebruikte methoden
- Bereiding van substraat- en injectieoplossingen voor de assay.
- Calibratie van de zuurstofconsumptiemachine met behulp van een gehydrateerde assaycartridge.
- Isolatie en voorbereiding van mitochondriën uit muisskeletspier.
- Uitvoeren van respirometrische assays om zuurstofconsumptiesnelheden te meten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle meting van mitochondriële ademhalingssnelheden met behulp van microplaattechnologie.
- Demonstratie van hogere doorvoercapaciteiten vergeleken met traditionele methoden.
- Identificatie van optimale omstandigheden voor mitochondriale adhesie en substraatlading.
Conclusies
- Microplaat-gebaseerde respirometrische assays zijn effectief voor het bestuderen van mitochondriële functie.
- Deze methode staat een efficiënt gebruik van beperkte mitochondriële monsters toe.
- Gedetailleerde protocollen kunnen onderzoekers helpen bij het implementeren van deze assays in hun studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput assessment of mitochondrial function using minimal skeletal muscle tissue, supporting early-stage target validation in metabolic disease research. By providing quantitative oxygen consumption data from isolated mitochondria, it enhances predictive confidence in pathway modulation studies. The approach addresses a key gap in scalable mitochondrial phenotyping for preclinical de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables mechanistic interrogation of electron transport chain, TCA cycle, and fatty acid oxidation pathways in a disease-relevant model.
- Operational Value: Requires only microgram quantities of mitochondrial protein, conserving precious preclinical samples.
- Scientific Value: Supports target hypothesis testing by linking substrate transporter modulation to respiratory output.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantitative OCR measurements across multiple respiratory states for compound screening.
- Operational Value: Microplate format allows parallel testing of conditions, improving assay throughput and reagent efficiency.
- Scientific Value: Standardized mitochondrial adherence and substrate loading reduce well-to-well variability, enhancing data reliability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant skeletal muscle mitochondrial data to inform translational biomarker strategies.
- Operational Value: Enables longitudinal assessment of metabolic adaptations in preclinical models.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by isolating mitochondrial contributions to whole-tissue phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling mitochondrial phenotyping after target identification and before efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of metabolic targets in skeletal muscle.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible OCR readouts for hit confirmation and structure-activity relationship analysis.
- Analytics: Provides state-resolved respiration metrics (basal, coupled, leak, uncoupled) to compare metabolic phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro mitochondrial function to preclinical continuity via disease-relevant tissue model.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized mitochondrial assay platform applicable across multiple metabolic targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by linking modulation to measurable respiratory changes.
- Operational Value: Reduces sample consumption through low-input, high-precision measurements.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early metabolic liability data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Expertise in mitochondrial isolation and respirometry is required for reliable results.
- Access to a microplate-compatible oxygen consumption analyzer and associated cartridges is necessary.
- Standardization of mitochondrial protein quantification and substrate preparation across teams ensures reproducibility.
- Adaptation to other tissues may require optimization of isolation and adherence protocols.
- Technical precision in mixing and monolayer formation is critical to minimize variability in OCR measurements.
