Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory
13 november 2015
Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.
Het algemene doel van dit videoartikel is om hoogwaardige mitochondriën te isoleren uit kleine hoeveelheden muisskeletspier voor gebruik in microplaat-gebaseerde tric-assays. Deze methode zou kunnen helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in biomedisch onderzoek, zoals het beschrijven hoe bepaalde geneesmiddelen en eiwitten skeletspier, mitochondriaal zuurstofverbruik moduleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat hoogwaardige mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier dan eerder is gerapporteerd.
Voer euthanasie van de muis uit in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Plaats vervolgens de muis op zijn zij en gebruik schaar met een fijne punt om een incisie in de huid te maken. Over de laterale epicondyle van het femur.
Schil de huid naar de muis toe en verwijder vervolgens de vetlaag die zich boven het quadricepsoorsprongspunt bevindt. Knip vervolgens de quadricepspeeskapel door die aan de knieschijf is bevestigd. Snijd langzaam de aponeurose tussen het bot en de quadriceps door terwijl u de femorale slagader vermijdt.
Snij vervolgens de peeskapel op het oorsprongspunt op het femur door om de quadricepsspier te bevrijden en plaats de quadricepsspier in gekoeld PBS. Verwijder eventueel zichtbaar vetweefsel boven de quadriceps met een schaar. Zodra het schoon is, draai de quadriceps om zodat het deel van de spier dat boven het femur lag, naar boven gericht is.
Open de quadricepsspier met een pincet in een waaiervormige beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spiergedeelten uit elke lob en plaats ze in een beker met vijf milliliter gekoeld mitochondriën. Isolatiebuffer.
Snijd vervolgens de huid die boven de achillespeeskapel ligt met schaar met een fijne punt en schil de huid naar de muis toe. Snijd de blootgestelde achillespeeskapel door en schil de spier naar de romp van de muis toe. Snijd de peeskapel bij de laterale en mediale condylen van het femur door om de gastrocnemius te bevrijden en plaats de gastrocnemius met zijn pezen in een schaal gevuld met gekoeld PBS.
Draai de gastrocnemius om en schil de soleusspier af. Plaats de soleusspier in de beker met vijf milliliter gekoeld mitochondriën. Isolatiebuffer.
Vervolgens opende men de gastroc en verwijderde de drie zichtbare rode spiergedeelten. Er zullen twee laterale gedeelten en één mediaal oppervlakkig rood strook zijn. Eenmaal geïsoleerd, brengt men de rode spier over naar de beker met vijf milliliter gekoeld mitochondriën.
Isolatiebuffer een. Verwijder nog eens 75 tot 100 milligram rode spier van het andere been van de muis. Herhaal het proces dat zojuist is getoond.
Plaats de gedissecteerde spier van het tweede been in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met het protease- en fosfataseremmercocktail en cellysebuffer die is bereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Bevries onmiddellijk het tweede monster in vloeibare stikstof voor gebruik in western blotting. Plaats een vooraf genezen vlakke plastic oppervlak op ijs in een grote emmer.
Plaats vervolgens een druppel mitochondriënisolatiebuffer één op het plastic oppervlak en gebruik pincet om alle gesneden rode spier in een druppel isolatie te plaatsen.Buffer. Hak het spierweefsel gedurende twee minuten met eenmesjesmes, verwissel om de veertig seconden naar een nieuw scherp mesje. Breng het gehakte weefsel over in een nieuwe beker met vijf milliliter vers mitochondriën.
Isolatiebuffer één. Neem vervolgens de oplossing en laat deze uitlekken door een 100 micron celzeef, geplaatst op een 50 milliliter kegelbuis. Dep het weefsel af met een delicaat zakdoekje en breng het vervolgens over in vijf milliliter 0,05% trypsinoplossing.
Gebruik pincet om eventueel resterend weefsel van het zakdoekje te verwijderen en voeg dit toe aan het trypsine. Incubeer het spierweefsel in de trypsinoplossing op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer vervolgens het monster gedurende drie minuten bij 200 keer G op vier graden Celsius.
Na centrifugatie giet je de trypsine-oplossing in een afvalcontainer en suspendeer je de pellet met drie milliliter ijskoud mitochondriënisolatiebuffer één. Breng vervolgens het weefsel over in een glazen homogenisatiebuis van 45 milliliter. Spoel de 15 milliliter kegelbuis uit met nog eens 1,5 milliliter mitochondriënisolatiebuffer één om eventueel resterend monster te verzamelen en voeg dit toe aan de glazen homogenisatiebuis.
Plaats vervolgens de glazen homogenisatiebuis in een beker of plastic container die half gevuld is met ijs. Zodat de glazen homogenisator minimaal in de beker beweegt. Homogeniseer het monster met een polytetrafluorethyleen stamper die aan een motoraangedreven weefsel is bevestigd.
Homogenisator met 10 bij 80 RPM. Houd de bodem van elke doorgang ongeveer twee seconden vast. Breng vervolgens het weefselhomogenaat over in een nieuwe 15 milliliter kegelbuis.
En spoel de glazen homogenisatiebuis af met 6,5 milliliter mitochondriënisolatiebuffer één. Giet de buffer in de 15 milliliter kegelbuis met de rest van het weefsel.Homogenaat. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 700 keer G op vier graden Celsius en giet vervolgens het supernaat voorzichtig in een centrifugeerbuis van hoogwaardig glas en gooi het pellet weg.
Centrifugeer vervolgens de snat gedurende 10 minuten bij 8.000 keer G op vier graden Celsius. Om de mitochondriën te pelleteren, verwijder je de snat en suspendeer je het pellet opnieuw door langzaam 500 microliter mitochondriënisolatiebuffer twee toe te voegen, snijd het uiteinde van een pipettentip af en homogeniseer voorzichtig het pellet in de buffer met meng- en roerbewegingen. Voeg vervolgens nog eens 4,5 milliliter mitochondriënisolatie toe.
Buffer twee aan het mengsel Na het volledig suspenderen van het pellet, centrifugeer je het homogenaat gedurende 10 minuten bij 8.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit videoartikel presenteert een methode voor het isoleren van kwalitatief hoogwaardige mitochondriën uit kleine hoeveelheden skeletspierweefsel van muizen, geschikt voor respirometrievarianten op basis van microplaten. De techniek vergroot het inzicht in de mitochondriale functie en de modulatie daarvan door diverse stoffen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Biochemie
Achtergrond
- Mitochondriën spelen een cruciale rol in het energiemetabolisme.
- Inzicht in de mitochondriale functie is essentieel voor biomedisch onderzoek.
- Eerdere methoden vereisten grotere weefselmonsters voor de isolatie van mitochondriën.
- Deze studie beoogt de efficiëntie van de mitochondriale isolatie te verbeteren.
Doel van de studie
- Om mitochondriën van hoge kwaliteit te isoleren uit kleine hoeveelheden skeletspierweefsel.
- Om onderzoek naar het mitochondriële zuurstofverbruik te faciliteren.
- Om een betrouwbare methode te bieden voor het bestuderen van de effecten van geneesmiddelen en eiwitten op mitochondriën.
Gebruikte methoden
- Euthanasie van de muizen uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.
- Incisie gemaakt in de huid boven het femur voor toegang tot het weefsel.
- Isolatie van mitochondriën uit skeletspiermonsters.
- Microplaat-gebaseerde respirometrische assays uitgevoerd om de mitochondriële functie te beoordelen.
Belangrijkste Resultaten
- Mitochondriën van hoge kwaliteit werden succesvol geïsoleerd uit kleinere weefselmonsters.
- De geïsoleerde mitochondriën vertoonden een hoge respiratoire koppeling.
- De methode bleek effectief voor assays op basis van microplaten.
- De resultaten ondersteunen verder onderzoek naar mitochondriale modulatie.
Conclusies
- Deze methode maakt een efficiënte isolatie van mitochondriën uit beperkte hoeveelheden weefsel mogelijk.
- Het opent nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van de mitochondriale functie in diverse contexten.
- Toekomstige studies kunnen deze techniek benutten voor de analyse van interacties tussen geneesmiddelen en eiwitten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Het isoleren van functionele mitochondriën uit beperkte hoeveelheden skeletspier maakt validatie van targets in een vroeg stadium mogelijk binnen onderzoek naar metabole ziekten. Deze aanpak ondersteunt mechanistische risicoreductie door kwantitatieve respirometrische resultaten te leveren uit fysiologisch relevant weefsel. Het vergroot het voorspellende vertrouwen in preklinische programma's die zich richten op paden van obesitas, veroudering en diabetes type II.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om mitochondriële functie te onderzoeken als therapeutisch doelwit bij metabole aandoeningen.
- Operationele waarde: Vermindert de benodigde hoeveelheid weefsel, waardoor de haalbaarheid van preklinische screening van doelwitten wordt vergroot.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door beoordeling van de mitochondriële integriteit en koppelings-efficiëntie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert intacte mitochondriale preparaten die geschikt zijn voor high-throughput microplate-respirometrie.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare metingen van het O2-verbruik met respiratory control ratios >6.
- Wetenschappelijke waarde: Maakt kwantitatieve beoordeling van de effecten van geneesmiddelen of eiwitten op de mitochondriale functie mogelijk.
Translationeel en preklinisch onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Maakt gebruik van ziekterelevante skeletspieren om mitochondriale dysfunctie bij obesitas en diabetes te modelleren.
- Operationele waarde: Biedt een schaalbare isolatieworkflow die compatibel is met multi-well plate formaten.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert translationele continuïteit van target hit tot preklinische validatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het continuüm van ontdekking, van het testen van doelwit-hypothesen tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor metabole indicaties.
- Discovery Biology: Ondersteunt mechanistische analyse van mitochondriale routes in skeletspieren.
- Screening: Maakt assay-klare mitochondriale monsters mogelijk voor compound-screening in microplate-formaten.
- Analytics: Levert kwantitatieve respirometrische resultaten, waaronder O2 flux en respiratory control ratios.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt mitochondriale functie met preklinische modellen van metabole ziekten.
- Hergebruik op Bedrijfsniveau: Vestigt een herbruikbaar isolatieplatform voor de beoordeling van mitochondriën in skeletspieren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het vertrouwen in de validatie van het target door beoordeling van de mitochondriale integriteit en functie.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en vermindert de variabiliteit bij mitochondriale respirometrie.
- Strategische waarde: Maakt eerdere go/no-go-beslissingen mogelijk door mitochondriale risico's bij lead-kandidaten te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen die het mitochondriale metabolisme beïnvloeden.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in mitochondriële isolatie en respirometrische assaytechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot homogenisatieapparatuur, centrifuges en microplate-readers.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor weefselverwerking en bufferbereiding tussen teams.
- Aanpassing aan andere weefsels kan optimalisatie van de parameters voor versnipperen en homogenisatie vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in opbrengst op basis van weefselkwaliteit en de vaardigheid van de technicus.
