Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Het algemene doel van dit video-artikel is het isoleren van hoogwaardige mitochondriën uit kleine hoeveelheden skeletspierweefsel van muizen voor gebruik in microplate-gebaseerde tric-assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in biomedisch onderzoek, zoals het beschrijven van hoe bepaalde geneesmiddelen en eiwitten de mitochondriale zuurstofconsumptie in skeletspieren moduleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er hoogwaardige mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit kleinere hoeveelheden skeletspierweefsel van muizen dan voorheen is gerapporteerd.

Voer de euthanasie van de muis uit in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Plaats de muis vervolgens op zijn zij en gebruik een fijne schaar om een incisie in de huid te maken, over de laterale epicondylus van het femur.

Pel de huid in de richting van de muis en verwijder vervolgens het vetkussen dat boven het aanhechtingspunt van de quadriceps is gelegen. Snijd daarna de quadricepspees door die aan de patella is bevestigd. Knip voorzichtig de aponeurose tussen het bot en de quadriceps door, terwijl u de arteria femoralis vermijdt.

Snijd vervolgens de pees door bij het aanhechtingspunt op het femur om de quadricepsspier vrij te maken en plaats de quadricepsspier in gekoelde PBS. Verwijder met een schaar al zichtbaar vetweefsel boven de quadriceps. Zodra deze schoon is, draai je de quadriceps om zodat het deel van de spier dat over het femur lag naar boven is gericht.

Open de quadricepsspier met een pincet in een waaiervormige beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spierdelen uit elke lob en plaats deze in een bekerglas met vijf milliliter gekoelde mitochondria-isolatiebuffer.

Snijd vervolgens met fijne scharen de huid boven de achillespees door en pel de huid in de richting van de muis. Snijd de blootgelegde achillespees door en pel de spier richting het lichaam van de muis. Snijd de pees bij de laterale en mediale condylen van het femur om de gastrocnemius vrij te maken en plaats de gastrocnemius, samen met de aanhechtende pezen, in een schaaltje met gekoelde PBS.

Draai de musculus gastrocnemius om en pel de musculus soleus af. Plaats de musculus soleus in het bekerglas met vijf milliliters gekoelde mitochondriaal isolatiebuffer.

Een volgende onderzoeker opende de m. gastrocnemius en verwijderde de drie zichtbare rode spiergedeelten. Er zijn twee laterale gedeelten en één mediale oppervlakkige rode strip. Zodra deze zijn geïsoleerd, wordt het rode spierweefsel overgebracht naar de beker met vijf milliliter gekoelde mitochondriën.

Isolatiebuffer één. Verwijder nog eens 75 tot 100 milligram rode spier van het andere achterpootje van de muis. Herhaal hiertoe het zojuist getoonde proces.

Plaats de gedissecteerde spier van het tweede pootje in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met de protease- en fosfataseremmercocktail en de cellysebuffer die zijn voorbereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Vries het tweede monster onmiddellijk kortstondig in vloeibare stikstof voor gebruik bij western blotting. Plaats een vooraf verwarmd vlak plastic oppervlak op ijs in een grote emmer.

Giet vervolgens een druppel mitochondriaal isolatiebuffer één op het plastic oppervlak en gebruik een pincet om alle doorsneden rode spier in een druppel isolatiebuffer te plaatsen. Hak het spierweefsel gedurende twee minuten fijn met enkelzijdige scheermesjes; vervang elke 40 seconden het mesje door een nieuw scherp exemplaar. Breng het fijngehakte weefsel over naar een nieuw bekerglas met vijf milliliter verse mitochondriaal isolatiebuffer.

Isolatiebuffer één. Neem vervolgens de oplossing en filter deze door een cellzeef van 100 micron, die op een conische buis van 50 milliliter is geplaatst. Dep het weefsel droog met een delicate task wiper en breng het daarna over in vijf milliliter van een 0,05%tryin-oplossing.

Gebruik een pincet om eventueel resterend weefsel van de weefseldoek te verwijderen en voeg dit toe aan de trypsine. Incubeer het spierweefsel in de trypsine-oplossing op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer het monster vervolgens 3 minuten lang bij 200 ×g bij vier graden Celsius.

Giet na centrifugatie het trypsinesupernatant in een afvalbak en resuspendeer de pellet met drie milliliter ijskoud mitochondria isolation buffer one. Breng het weefsel vervolgens over naar een glazen homogenisatiebuis van 45 milliliter. Spoel de conische buis van 15 milliliter met nog eens 1,5 milliliter mitochondria isolation buffer one om alle resterende monsters te verzamelen en voeg dit toe aan de glazen homogenisatiebuis.

Plaats vervolgens de glazen homogenisatiebuis in een bekerglas of plastic container die voor de helft met ijs is gevuld, zodat de glazen homogenisator minimaal beweegt in het bekerglas. Homogeniseer het monster met een polytetrafluoroethyleen stamper die is bevestigd aan een gemotoriseerd weefselhomogenisator.

Homogeniseer met 10 keer bij 80 RPM. Houd de onderkant van elke passage ongeveer twee seconden vast. Breng het weefselhomogenaat vervolgens over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.

Spoel de glazen homogeniseerbuis uit met 6,5 milliliter mitochondria-isolatiebuffer één. Giet de buffer in de 15 milliliter conische buis die de rest van het weefsel bevat. Homogeniseer. Centrifugeer de monsteroplossing 10 minuten bij 700 ×g bij vier graden Celsius, giet vervolgens voorzichtig het supernatant in een centrifugeerbuis van hoogwaardig glas en werp het pellet weg.

Centrifuge vervolgens de supernatant bij 8.000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Om de mitochondriën te pelleteren, verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet door langzaam 500 µL mitochondriën-isolatiebuffer twee toe te voegen; knip het uiteinde van een pipetpunt af en homogeniseer de pellet voorzichtig in de buffer met mengende en roerende bewegingen. Voeg vervolgens nogmaals 4,5 mL mitochondriën-isolatiebuffer toe.

Voeg buffer twee toe aan het mengsel. Nadat de pellet volledig is gesuspendeerd, wordt het homogenaat 10 minuten gecentrifugeerd bij 8,000 ×g bij vier graden Celsius om de mitochondriën opnieuw te pelleteren. Verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig maar volledig door mitochondriaal isolatiebuffer twee toe te voegen in stappen van 25 µL. Gebruik een pipetpunt waarvan de punt is afgeknipt om de pellet na elke toevoeging van 25 µL buffer voorzichtig te roeren en te mengen.

Zet deze mitochondriale stock na voltooiing op ijs. Maak twee afzonderlijke 1:20 verdunningen van de mitochondriale stock in ultrapuur water. Voeg 0,1% Triton 100 x toe aan één monster en Sonicate gedurende 10 seconden op een lage stand.

Laat de andere verdunning op ijs en plaats het gesoniceerde monster terug op ijs. Voer na sonificatie een citraatsynthase-assay uit met zowel de niet-gesoniceerde als de gesoniceerde mitochondriale verdunning met behulp van een fotometrische assay via standaardtechnieken; bepaal het percentage intacte mitochondriale membranen met de vergelijkingen die in het bijbehorende tekstprotocol worden verstrekt. Het sonificeren van de mitochondriën resulteert in een statistisch significante toename van de citraatsynthase-activiteit.

De citraatsynthase-activiteit in niet-gesoniceerde mitochondriale monsters vergeleken met gesoniceerde monsters laat zien dat 92,5% van de mitochondriën intact was na de isolatie. De expressie van GA DH en COX vier is duidelijk zichtbaar in het totale weefsellysaat en in de geïsoleerde mitochondriën is expressie van Cox vier waargenomen. Hoewel er slechts vage banden van GA DH zichtbaar zijn, wijzen deze bevindingen op een goede mitochondriale isolatie met weinig contaminatie door niet-mitochondriale componenten tijdens de isolatieprocedure.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig met de mitochondriale stock om te gaan; vortex deze nooit en meng deze na deze procedure niet krachtig. Andere methoden, zoals het meten van de productie van reactieve zuurstofsoorten, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of een interventie de productie van reactieve zuurstofsoorten in geïsoleerde mitochondriën beïnvloedt.