Name: Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je hoogwaardige mitochondriën isoleert uit kleine hoeveelheden muis skeletspier voor microplaat-respirometrie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mitochondriale functie en modulatie door geneesmiddelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het Fralin Life Science Research Institute en The Metabolic Phenotyping Core aan Virginia Tech hebben dit werk ondersteund.

Dierstudies werden uitgevoerd onder een protocol goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Virginia Polytechnic Institute en de State University. 1. Setup (Tijd: ~ 45 min) <ol><li> Ontdooi bevroren opslag van 0,25% trypsine, Isolation buffer voor Mitochondria (IBM) 1 en IBM2 in een 37 ° C waterbad. </li><li> Spoel glaswerk en ontleden instrumenten in 70% ethanol gevolgd door zuiver water. </li><li> Bereid 0,05% trypsine-oplossing van 0,25% trypsine voorraad door te verdunnen 1 deel trypsine in 4 delen IBM1. </li><li> Meng protease en fosfatase-inhibitor cocktail met cell lysis buffer (1: 100 verhouding) in een 1,5 ml microcentrifuge buis met schroefdop. </li><li> Aliquot 5 ml (5 ml / muis) van 0,05% trypsine in een 15 ml plastic buis. </li><li> Stel motor aangedreven weefselhomogenisator tot 80 RPM. </li></ol> 2. Isolatie van skeletspieren Mitochondriën (Tijd: ~ 90 min) <ol><li> Euthanaseren een muis door CO 2 </sub&gt; inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. </li><li> Verwijder rode spieren van de quadriceps en gastrocnemius, waarbij de soleus (~ 75-100 mg totaal) zoals beschreven in de volgende stappen omvat: <ol><li> Schil de huid in de richting van de muis. </li><li> Verwijder het vet pad over de quadriceps beginpunt. Snijd de quadriceps pees die aan de patella met fijne getipt schaar is bevestigd. Opmerking: De quadriceps wordt geïdentificeerd door zijn anatomische positie op het voorste gedeelte van de proximale femur. </li><li> Langzaam knip de aponeurose tussen het bot en de quadriceps, terwijl het vermijden van de dijbeenslagader, aan de quadriceps van het bot te bevrijden. Snijd de pees met fijne getipt schaar op de oorsprong punt op het dijbeen van de quadriceps te bevrijden en plaats de quadriceps spier in gekoeld PBS. </li><li> Verwijder zichtbaar vetweefsel over de quadriceps met een schaar. Draai de quadriceps om zodat het gedeelte van de spier die werd bovenop de femur wordt geconfronteerd up. Open de quadriceps met een tang in een ventilatie-beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spier gedeelten uit elke kwab met fijne getipt schaar en plaats in een bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1. Opmerking: quadricepsspier weergegeven met twee lobben met een strook rode spieren gelegen nabij de zijrand van elke lob. </li><li> Snijd de huid bovenop de achillespees met fijne getipt schaar en schil de huid in de richting van de muis. Snijd de blootgestelde achillespees en schil de spier naar het lichaam van de muis. </li><li> Snijd de pees aan de laterale en mediale condylus van het femur met fijne getipt schaar om de gastrocnemius te bevrijden en plaats de gastrocnemius gehecht aan de pezen in gekoelde PBS. </li><li> Flip de gastrocnemius over en trek het soleus spier en plaats in het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1. Ventilator open de gastrocnemius. Verwijder de drie visuele rode spier porties (twee laterale en een mediale oppervlakkige rode stroken) met fijne getipt schaars en overbrengen naar het bekerglas met 5 ml gekoelde IBM1. </li></ol></li><li> Verwijder een ander ~ 75-100 mg rode spierweefsel het andere been van de muis (zoals beschreven in stap 2.2) en plaats in een 1,5 ml microcentrifuge buis met protease inhibitor cocktail en fosfatase en cellysis buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat, 0,5% natrium deoxycholaat, 1% polyoxyethyleen (9) nonylphenylether, vertakte. onmiddellijk flash-bevriezen tweede monster in vloeibare stikstof om later bij Western blotting (zie stap 6,1). </li><li> Plaats een pre-gekoelde, platte kunststof oppervlak op het ijs in een grote bak. Giet een druppel IBM1 op het kunststofoppervlak en gebruik pincet om alle rode doorgesneden spier (stap 2.2.4 en 2.2.7) in IBM1 druppel plaatsen. Hak het spierweefsel gedurende 2 min met 3 enkele rand scheermesjes door het veranderen van scheermessen iedere 40 sec. </li><li> Breng het gehakt weefsel in nieuw bekerglas met 5 ml vers IBM1 houden door het plastic oppervlak van the bekerglas en schrapen de spier in het bekerglas met een scheermesje. Neem deze oplossing en laat het door een 100 um cel zeef geplaatst op een 50 ml conische buis. </li><li> Dep het weefsel met een moeilijke taak wisser en breng deze in 5 ml van 0,05% trypsine-oplossing. Gebruik een pincet om het weefsel van de taak wisser te verwijderen. </li><li> Incubeer het spierweefsel op ijs gedurende 30 min in 0,05% trypsine-oplossing. </li><li> Draai de 15 ml conische buis met trypsine / spier mengsel bij 200 xg gedurende 3 min bij 4 ° C. </li><li> Giet de trypsine supernatant in een afvalcontainer en resuspendeer de pellet met 3 ml ijskoude IBM1. Breng het weefsel een 45 ml glazen homogenisator buis. Spoel de 15 ml conische buis met nog eens 1,5 ml IBM1 om alle resterende monster te verzamelen en voeg deze toe aan de glashomogenisator buis. </li><li> Plaats het glas homogenisator buis in een beker of een plastic container gevuld helft met ijs, zodat het glas homogenisator beweegt minimaal binnen de beker. </li><li&gt; Homogeniseer de weefsels / IMB1 mengsel met PTFE stamper gehecht aan een motor aangedreven weefselhomogenisator met 10 doorgangen op 80 rpm. Houd de onderkant van elke pas voor ~ 2 sec. </li><li> Breng de weefselhomogenaat om een ​​nieuwe 15 ml conische buis en spoel het glas homogenisator buis met 6,5 ml IBM1. Giet het IBM1 in de 15 ml conische buis met weefselhomogenaat. </li><li> Draai de 15 ml conische buis bij 700 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet de bovenstaande vloeistof in een glas met hoge sterkte centrifugebuis en de pellet gooi. </li><li> Draai de supernatant van de bovenstaande stap bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de IBM1 supernatant en resuspendeer de pellet door langzaam toevoegen van 500 pi van IBM2. Knip het uiteinde van een pipet en voorzichtig homogeniseren de pellet in IBM2 mengen en roeren van bewegingen. Voeg nog 4,5 ml IBM2 aan het mengsel nadat de pellet volledig is gesuspendeerd. Opmerking: Vermijd overmatige wrijven terwijl het breken van grotere pellet stukken als thij kan de membranen beschadigen. </li><li> Draai de IBM2 / weefsel homogenaat bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Opmerking: Deze stap kan worden herhaald in een schone hoge sterkte centrifugebuis voor meer nauwkeurige eiwit kwantificatie van geïsoleerde mitochondria in stap 4 sinds resterende BSA kunnen bijdragen aan de totale eiwitgehalte. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof en voorzichtig, maar volledig resuspendeer de pellet door het toevoegen van twee 25 ul stappen van IBM2 met een pipet tip met zijn punt afgesneden. Roer en meng de pellet na elke toevoeging van 25 pl IBM2. Plaats deze mitochondriale voorraad op ijs. </li></ol> 3. homogenisering van Whole Tissue Lysate (Tijd: ~ 45 min, kan worden uitgevoerd tijdens Stap 7) <ol><li> Verwijder het spierweefsel dat de vloeibare stikstof werd gebracht bij stap 2,3 en incuberen bij kamertemperatuur geroerd tot het volledig ontdooid. </li><li> Hak het weefsel voor ~ 30 sec op ijs met fijne getipt schaar. </li><li> Voeg twee 100 ul bolletjes Zirconium Oxide Beads aan de 1,5 ml microcentrifugebuis met schroefdop uit stap 3.2 dat het gehakt weefsel bevat. Homogeniseer het weefsel in een parelmolen weefselhomogenisator met 2-3 5 min cycli bij een snelheid instelling van 4-6 (medium instelling). </li><li> Draai het mengsel van stap 3,3 bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet tip 1000 gl na de spin en overbrengen in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Gooi de pellet en plaats de bovenstaande op het ijs. </li></ol> 4. Eiwit bepaling (Time: ~ 30 min) <ol><li> Bepaal de eiwitconcentratie van het gehele weefsel lysaat (stap 3,4) en mitochondriale voorraad (stap 2,17) met de BCA Protein Assay Kit volgens specificaties van de fabrikant. </li></ol> 5. Mitochondriën Membraan Integriteit; Citraatsynthase (CS) activiteit (Tijd: ~ 15 min) <ol><li> Maak twee afzonderlijke 1: 20 verdunningen van de mitochondriale voorraad in zuiver water. Toevoegen0,1% van de Triton 100-X een monster en ultrasone trillingen het op een lage stand (765 Watt, amplitude van 2). Laat de andere verdunning op het ijs. Terug het monster ijs na sonicatie. </li><li> Voer een citraat synthase test met zowel de niet-gesoniceerd en gesonificeerd mitochondriale verdunningen met behulp van een spectrofotometrische assay zoals eerder beschreven 11,12. </li><li> Bepaal het percentage intact mitochondria membranen met behulp van de volgende vergelijkingen: (Non-gesoniceerde CS activiteit ÷ gesoniceerde CS activiteit) * 100 </li></ol> 100- N (procent bereikt van boven) 6. Mitochondriën Isolatie Kwaliteit; Western Blotting (Tijd: Volgens protocol Lab) <ol><li> Voer Western blotting op het gehele weefsel lysaat en geïsoleerde mitochondria zoals eerder 12 beschreven. Opmerking: Gebruik primaire antilichamen voor GAPDH (1: 1000 verdunning in 5% BSA / TBS-T) en COXIV (1: 1000 verdunning in 5% vetvrijemelk / TBS-T), gevolgd door anti-geit, en konijn secundaire antilichamen, respectievelijk (1: 10.000). </li></ol> 7. Respirometrische Assay Run (Tijd: ~ 90 min) <ol><li> Voeren gewenste respirometrische assays met microplaat O 2 verbruik meettechniek zoals eerder beschreven (zie begeleidend artikel en Rogers et al 8). </li><li> Bepaal de respiratoire controle ratio (RCR) door het delen van State 3 van State 4o (RCR) of State 3u te delen door de Staat 4o. Gebruik ofwel het midden (gemiddelde) punt, of de hoogste (staat 3) en de laagste tarieven (Staat 4o) van de point-to-point sporen bij het bepalen van RCR. </li></ol>

<ol><li>Brand, M., Nicholls, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435, 297-312 (2011).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+in+sickness+and+in+health%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148, 1145-1159 (2012).</li>
<li>Lauri, A., Pompilio, G., Capogrossi, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome+in+aging+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome in aging and senescence.</a> Ageing Res. Rev. 18, 1-15 (2014).</li>
<li>Dube, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+lipid+overload+on+skeletal+muscle+insulin+resistance%2C+metabolic+flexibility%2C+and+mitochondrial+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Effects of acute lipid overload on skeletal muscle insulin resistance, metabolic flexibility, and mitochondrial performance.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 12, 1117-1124 (2014).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Lopez-Perez, M. J., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+biogenetically+competent+mitochondria+from+mammalian+tissues+and+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of biogenetically competent mitochondria from mammalian tissues and cultured cells.</a> Methods (San Diego, Calif). 26, 292-297 (2002).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat. Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PloS one. 6, e21746(2011).</li>
<li>Guarino, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+determining+oxygen+consumption+rates+of+static+cultures+from+microplate+measurements+of+pericellular+dissolved+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Method for determining oxygen consumption rates of static cultures from microplate measurements of pericellular dissolved oxygen concentration.</a> Biotechnol. and Bioeng. 86, 775-787 (2004).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat. Protoc. 1, 2563-2572 (2007).</li>
<li>Hulver, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+stearoyl-CoA+desaturase-1+expression+in+skeletal+muscle+contributes+to+abnormal+fatty+acid+partitioning+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans.</a> Cell Metab. 2, 251-261 (2005).</li>
<li>Frisard, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+modulates+skeletal+muscle+substrate+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 modulates skeletal muscle substrate metabolism.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 298, e988-e998 (2010).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subjects+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subjects of Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Gross, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+functional+mitochondria+from+rat+kidney+and+skeletal+muscle+without+manual+homogenization%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization.</a> Anal. Biochem. 418, 213-223 (2011).</li>
<li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol.%3A+Respir.%2C+Envir.+and+Ex.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> J. Appl. Physiol.: Respir., Envir. and Ex. Physiol. 48, 23-28 (1980).</li>
<li>Asmann, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+mitochondrial+functions%2C+mitochondrial+DNA+copy+numbers%2C+and+gene+transcript+profiles+in+type+2+diabetic+and+nondiabetic+subjects+at+equal+levels+of+low+or+high+insulin+and+euglycemia%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle mitochondrial functions, mitochondrial DNA copy numbers, and gene transcript profiles in type 2 diabetic and nondiabetic subjects at equal levels of low or high insulin and euglycemia.</a> Diabetes. 55, 3309-3319 (2006).</li>
<li>Lanza, I. R., Nair, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assessment+of+isolated+mitochondria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Functional assessment of isolated mitochondria in vitro.</a> Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).</li>
</ol>

George Rogers is een medewerker van Seahorse Bioscience dat het instrument produceert waarvoor dit protocol is aangepast.

De hierin gepresenteerde werkwijzen een gedetailleerde beschrijving van een mitochondriaal isolatieprocedure van geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren. Deze isolatie procedure is in staat om hoge functioneren, puur mitochondria (~ 450 ug) opleveren, zoals blijkt uit O 2 consumptie prijzen, RCR waarden, maximale citraat synthase activiteit en eiwit expressie van immunoblotting. Belangrijk is, kan de mitochondriën geïsoleerd uit deze procedure gebruikt voor meerdere assays respirometirc me...

De primaire functie van mitochondriën is het produceren van ATP door middel van oxidatieve fosforylering. Mitochondriën hebben echter veel andere belangrijke cellulaire functies, waaronder maar niet beperkt tot: de productie en ontgifting van reactieve zuurstofsoorten, de regulering van cytoplasmatisch en mitochondriaal calcium, orgaantransport, ionische homeostase en betrokkenheid bij apoptose1,2. Daarom is het niet verwonderlijk dat disfunctionele mitochondriën een rol spelen in veel ziektepathologieën, zoals veroudering, neurodegeneratieve ziekten, hart- en vaatziekten, kanker, obesitas en diabetes3,4. Belangrijk is dat specifiek de mitochondriën in skeletspieren betrokken zijn bij veel van deze pathologieën3-5.
Assays voor mitochondriale ademhaling met behulp van geïsoleerde mitochondriën maken de beoordeling van de elektronentransportketen en de functie van oxidatieve fosforylering mogelijk, en de bepaling van het(de) werkingsmechanisme(n) van geneesmiddelen en eiwitten die het metabolisme moduleren. Er bestaan procedures voor het isoleren van mitochondriën voor meerdere weefsel- en celtypen voor een verscheidenheid aan soorten6,7. Deze procedures vereisen echter vaak grote hoeveelheden weefsel/cellen voor een hoge kwaliteit van de opbrengst van mitochondriën, wat noodzakelijk is voor klassieke respirometrische assays.
Respirometrische assays op basis van microplates maken hoge doorvoermetingen mogelijk met minimale hoeveelheden geïsoleerde mitochondriën, vaak slechts enkele µg per putje8. Daarom presenteren we een aanpassing van eerder gepubliceerde methoden7 om hoge kwaliteit mitochondriën te isoleren uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier voor gebruik in respirometrische assays op basis van microplates. Daarnaast worden methoden geboden om de kwaliteit van de mitochondriale isolatievoorbereiding en de integriteit van de mitochondriale membranen vast te stellen. Aangezien mitochondriën in skeletspieren betrokken zijn bij veel pathologische aandoeningen, wordt het meten van O2 consumptie in mechanistisch gedreven studies steeds gebruikelijker in biomedisch onderzoek9,10.

<table><tbody><tr><td>Essentially Fatty</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Acid Free- BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris/HCl</td><td>Promega</td><td>H5123</td><td>N/A</td></tr><tr><td>KCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6511</td><td>N/A</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>N/A</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63559</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium Chloride White Crystals or Crystalline Powder &ge;99.0 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3581</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750&nbsp;</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Polyoxyethylene (12) nonylphenyl ether, branched</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238651</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Single Edge Razor Blades</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Falcon- 100 uM Nylon Cell Strainers</td><td>Fisher Scientific</td><td>352360</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Halt Protease &amp; Phosphatse Inhibitor Cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>1861284</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes with screw cap</td><td>Thermo Scientific</td><td>3474</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zirconium Oxide beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>C9012112</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH antibody (1D4)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-59540</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Anti- COXIV antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>4844s</td><td>Any mitochondrial inner membrane protein will suffice</td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Donkey, Anti Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>711-035-152</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase conjugated affinipure Goat, Anti Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearh</td><td>115-001-003</td><td>N/A</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pyruvic Acid, 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>107360</td><td>Store at 4 &deg;C,pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>Succinic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9512</td><td>Store at room temperature, pH to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L(-) Malic Acid, BioXtra, &ge;95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6413</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td>Store at room temperature, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Palmitoyl L-carnitine chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1645</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Oligomycin A, &ge; 95% (HPLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75351</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2920</td><td>Store at 2-8 &deg;C</td></tr><tr><td>phenylhydrazone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&ge;98% (TLC), powder [FCCP]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A from streptomyces sp.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8674</td><td>Store at -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-diphosphate monopotassium salt dehydrate [ADP]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5285</td><td>Store at -20 &deg;C, to 7.4 with KOH prior to use in respirometric assay</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8875</td><td>Store at room temperature</td></tr></tbody></table>

isolatie van mitochondriën uit minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor metingen high throughput microplate respiratory

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctionele skeletspieren mitochondria een rol spelen in gewijzigde stofwisseling waargenomen met veroudering, obesitas en type II diabetes. Mitochondriale respirometrische testen van geïsoleerde mitochondriële preparaten oog op het beoordelen van mitochondriale functie, evenals de bepaling van het mechanisme (s) van de werking van geneesmiddelen en eiwitten die het metabolisme moduleren. Huidige isolatie procedures vereisen vaak grote hoeveelheden weefsel van hoge kwaliteit mitochondriën nodig respirometrische assays opleveren. De hierin gepresenteerde werkwijzen beschrijven hoe kwaliteit gezuiverde mitochondria (~ 450 g) worden geïsoleerd uit geringe hoeveelheden (~ 75-100 mg) van muizen skeletspieren voor gebruik in high throughput metingen luchtwegen. We hebben vastgesteld dat onze isolatiemethode levert 92,5 ± 2,0% intact mitochondria door meting citraat synthase activiteit spectrofotometrisch. Bovendien Western blotanalyse in geïsoleerde mitochondria resulteerde in de zwakke expressie van het cytosolic eiwit, GAPDH, en de robuuste expressie van het mitochondriale eiwit, COXIV. Het ontbreken van een prominente band GAPDH in geïsoleerde mitochondriën indicatief is weinig verontreinigingen uit niet-mitochondriale bronnen tijdens de isolatieprocedure. Belangrijker nog, het meten van O 2 verbruik met micro-plaat gebaseerde technologie en het bepalen van de respiratoire controle ratio (RCR) voor gekoppelde respirometrische assays toont sterk gekoppeld (RCR;&gt; 6 voor alle assays) en functionele mitochondriën. Concluderend, de toevoeging van een afzonderlijk hakken stap en aanzienlijke vermindering motor aangedreven homogenisering snelheid van een eerder beschreven werkwijze heeft het de isolatie van hoge kwaliteit en gezuiverde mitochondria uit kleinere hoeveelheden muis skeletspier die resulteert in sterk gekoppelde mitochondria die ademen met een hoge functie tijdens microplaat respirometirc assays.

Citraat synthase activiteit dient als maat voor de membraanintegriteit aangezien citrate synthase is gelegen in het binnenste mitochondriale membraan, en dus moeten niet in suspensies van mitochondria met intacte membranen. Figuur 1 geeft citraat synthase activiteit in niet-gesonificeerde mitochondriale monsters tegenover gesoniceerd monsters van dezelfde isolatie. Sonicatie de mitochondria resulteert in een statistisch significante toename van citraat synthase activiteit (P &lt;0,01). Belangrijk is 92,...

Hier presenteren we een aanpassing van een eerder gerapporteerde methode die de isolatie van hoogwaardige en gezuiverde mitochondriën mogelijk maakt uit kleinere hoeveelheden muisskeletspier. Deze procedure resulteert in sterk gekoppelde mitochondriën die ademen met hoge functionaliteit tijdens microplate-gebaseerde respirometrische analyses.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Het algemene doel van dit video-artikel is het isoleren van hoogwaardige mitochondriën uit kleine hoeveelheden skeletspierweefsel van muizen voor gebruik in microplate-gebaseerde tric-assays. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in biomedisch onderzoek, zoals het beschrijven van hoe bepaalde geneesmiddelen en eiwitten de mitochondriale zuurstofconsumptie in skeletspieren moduleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er hoogwaardige mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit kleinere hoeveelheden skeletspierweefsel van muizen dan voorheen is gerapporteerd.Voer de euthanasie van de muis uit in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Plaats de muis vervolgens op zijn zij en gebruik een fijne schaar om een incisie in de huid te maken, over de laterale epicondylus van het femur.Pel de huid in de richting van de muis en verwijder vervolgens het vetkussen dat boven het aanhechtingspunt van de quadriceps is gelegen. Snijd daarna de quadricepspees door die aan de patella is bevestigd. Knip voorzichtig de aponeurose tussen het bot en de quadriceps door, terwijl u de arteria femoralis vermijdt.Snijd vervolgens de pees door bij het aanhechtingspunt op het femur om de quadricepsspier vrij te maken en plaats de quadricepsspier in gekoelde PBS. Verwijder met een schaar al zichtbaar vetweefsel boven de quadriceps. Zodra deze schoon is, draai je de quadriceps om zodat het deel van de spier dat over het femur lag naar boven is gericht.Open de quadricepsspier met een pincet in een waaiervormige beweging. Verwijder de twee zichtbare rode spierdelen uit elke lob en plaats deze in een bekerglas met vijf milliliter gekoelde mitochondria-isolatiebuffer.Snijd vervolgens met fijne scharen de huid boven de achillespees door en pel de huid in de richting van de muis. Snijd de blootgelegde achillespees door en pel de spier richting het lichaam van de muis. Snijd de pees bij de laterale en mediale condylen van het femur om de gastrocnemius vrij te maken en plaats de gastrocnemius, samen met de aanhechtende pezen, in een schaaltje met gekoelde PBS.Draai de musculus gastrocnemius om en pel de musculus soleus af. Plaats de musculus soleus in het bekerglas met vijf milliliters gekoelde mitochondriaal isolatiebuffer.Een volgende onderzoeker opende de m. gastrocnemius en verwijderde de drie zichtbare rode spiergedeelten. Er zijn twee laterale gedeelten en één mediale oppervlakkige rode strip. Zodra deze zijn geïsoleerd, wordt het rode spierweefsel overgebracht naar de beker met vijf milliliter gekoelde mitochondriën.Isolatiebuffer één. Verwijder nog eens 75 tot 100 milligram rode spier van het andere achterpootje van de muis. Herhaal hiertoe het zojuist getoonde proces.Plaats de gedissecteerde spier van het tweede pootje in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter met de protease- en fosfataseremmercocktail en de cellysebuffer die zijn voorbereid zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Vries het tweede monster onmiddellijk kortstondig in vloeibare stikstof voor gebruik bij western blotting. Plaats een vooraf verwarmd vlak plastic oppervlak op ijs in een grote emmer.Giet vervolgens een druppel mitochondriaal isolatiebuffer één op het plastic oppervlak en gebruik een pincet om alle doorsneden rode spier in een druppel isolatiebuffer te plaatsen. Hak het spierweefsel gedurende twee minuten fijn met enkelzijdige scheermesjes; vervang elke 40 seconden het mesje door een nieuw scherp exemplaar. Breng het fijngehakte weefsel over naar een nieuw bekerglas met vijf milliliter verse mitochondriaal isolatiebuffer.Isolatiebuffer één. Neem vervolgens de oplossing en filter deze door een cellzeef van 100 micron, die op een conische buis van 50 milliliter is geplaatst. Dep het weefsel droog met een delicate task wiper en breng het daarna over in vijf milliliter van een 0,05%tryin-oplossing.Gebruik een pincet om eventueel resterend weefsel van de weefseldoek te verwijderen en voeg dit toe aan de trypsine. Incubeer het spierweefsel in de trypsine-oplossing op ijs gedurende 30 minuten. Centrifugeer het monster vervolgens 3 minuten lang bij 200 ×g bij vier graden Celsius.Giet na centrifugatie het trypsinesupernatant in een afvalbak en resuspendeer de pellet met drie milliliter ijskoud mitochondria isolation buffer one. Breng het weefsel vervolgens over naar een glazen homogenisatiebuis van 45 milliliter. Spoel de conische buis van 15 milliliter met nog eens 1,5 milliliter mitochondria isolation buffer one om alle resterende monsters te verzamelen en voeg dit toe aan de glazen homogenisatiebuis.Plaats vervolgens de glazen homogenisatiebuis in een bekerglas of plastic container die voor de helft met ijs is gevuld, zodat de glazen homogenisator minimaal beweegt in het bekerglas. Homogeniseer het monster met een polytetrafluoroethyleen stamper die is bevestigd aan een gemotoriseerd weefselhomogenisator.Homogeniseer met 10 keer bij 80 RPM. Houd de onderkant van elke passage ongeveer twee seconden vast. Breng het weefselhomogenaat vervolgens over naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.Spoel de glazen homogeniseerbuis uit met 6,5 milliliter mitochondria-isolatiebuffer één. Giet de buffer in de 15 milliliter conische buis die de rest van het weefsel bevat. Homogeniseer. Centrifugeer de monsteroplossing 10 minuten bij 700 ×g bij vier graden Celsius, giet vervolgens voorzichtig het supernatant in een centrifugeerbuis van hoogwaardig glas en werp het pellet weg.Centrifuge vervolgens de supernatant bij 8.000 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Om de mitochondriën te pelleteren, verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet door langzaam 500 µL mitochondriën-isolatiebuffer twee toe te voegen; knip het uiteinde van een pipetpunt af en homogeniseer de pellet voorzichtig in de buffer met mengende en roerende bewegingen. Voeg vervolgens nogmaals 4,5 mL mitochondriën-isolatiebuffer toe.Voeg buffer twee toe aan het mengsel. Nadat de pellet volledig is gesuspendeerd, wordt het homogenaat 10 minuten gecentrifugeerd bij 8,000 ×g bij vier graden Celsius om de mitochondriën opnieuw te pelleteren. Verwijder de supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig maar volledig door mitochondriaal isolatiebuffer twee toe te voegen in stappen van 25 µL. Gebruik een pipetpunt waarvan de punt is afgeknipt om de pellet na elke toevoeging van 25 µL buffer voorzichtig te roeren en te mengen.Zet deze mitochondriale stock na voltooiing op ijs. Maak twee afzonderlijke 1:20 verdunningen van de mitochondriale stock in ultrapuur water. Voeg 0,1% Triton 100 x toe aan één monster en Sonicate gedurende 10 seconden op een lage stand.Laat de andere verdunning op ijs en plaats het gesoniceerde monster terug op ijs. Voer na sonificatie een citraatsynthase-assay uit met zowel de niet-gesoniceerde als de gesoniceerde mitochondriale verdunning met behulp van een fotometrische assay via standaardtechnieken; bepaal het percentage intacte mitochondriale membranen met de vergelijkingen die in het bijbehorende tekstprotocol worden verstrekt. Het sonificeren van de mitochondriën resulteert in een statistisch significante toename van de citraatsynthase-activiteit.De citraatsynthase-activiteit in niet-gesoniceerde mitochondriale monsters vergeleken met gesoniceerde monsters laat zien dat 92,5% van de mitochondriën intact was na de isolatie. De expressie van GA DH en COX vier is duidelijk zichtbaar in het totale weefsellysaat en in de geïsoleerde mitochondriën is expressie van Cox vier waargenomen. Hoewel er slechts vage banden van GA DH zichtbaar zijn, wijzen deze bevindingen op een goede mitochondriale isolatie met weinig contaminatie door niet-mitochondriale componenten tijdens de isolatieprocedure.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig met de mitochondriale stock om te gaan; vortex deze nooit en meng deze na deze procedure niet krachtig. Andere methoden, zoals het meten van de productie van reactieve zuurstofsoorten, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of een interventie de productie van reactieve zuurstofsoorten in geïsoleerde mitochondriën beïnvloedt.

isolation-mitochondria-from-minimal-quantities-mouse-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft een procedure om de ademhaling van mitochondriën geïsoleerd van skeletspieren studie. Deze methode werd aangepast van...

Mitochondriale Isolatie van skeletspieren

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

De gepresenteerde methoden bieden stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van een verzameling respirometrische assays op basis van microplates met behulp van geïsoleerde mitochondriën uit minimale hoeveelheden muisskeletspier. Deze assays kunnen mechanistische veranderingen/aanpassingen in het mitochondriale zuurstofverbruik meten in een veelgebruikt diermodel.

Met behulp Isolated Mitochondriën van geringe hoeveelheden van de muis skeletspieren voor High throughput Microplate Respiratory Metingen

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Mitochondriën zijn belangrijke metabole organellen die een hoog niveau van fenotypische plasticiteit in de skeletspieren vertonen. De import van eiwitten uit het cytosol is een kritieke route voor organelbiogenese, essentieel voor de uitbreiding van het reticulum en het behoud van de mitochondriale functie.  Daarom dient eiwitimport als een barometer van cellulaire gezondheid.

Meting van eiwitimportcapaciteit van skeletspier mitochondriën

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor mitochondriale isolatie van de skeletspieren van muizen en de daaropvolgende analyse van ademhaling door oxygen consumption rate (OCR) met behulp van op microplaten gebaseerde respirometrische assays. Deze pijplijn kan worden toegepast om de effecten van meerdere omgevings- of genetische interventies op het mitochondriale metabolisme te bestuderen.

Isolatie van mitochondriën uit de skeletspieren van muizen voor respirometrische assays

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Methode voor de enzymatische dissociatie, oppervlakte-etikettering en de zuivering door flowcytometrie van fibro / adipogenic en myogene voorlopercellen uit muizen skeletspieren.

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Leer hoe je hoogwaardige mitochondriën isoleert uit kleine hoeveelheden muis skeletspier voor microplaat-respirometrie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar mitochondriale functie en modulatie door geneesmiddelen.

Isolatie van Mitochondriën uit Minimale hoeveelheden muis skeletspieren voor Metingen High Throughput Microplate Respiratory

Meer video's verkennen