In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering
3 november 2015
Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van verschillende pulsatiele stromingspathologieën op endotheelcellen te observeren. In vitro. Dit wordt bereikt door glasplaten eerst chemisch te behandelen en te bedekken met eiwitten om celhechting tijdens blootstelling aan stroming te garanderen.
Als tweede stap wordt de pulsatiliteitsindex van de stroming bepaald, wat vergelijking mogelijk maakt van in vitro stroming met waarden beschreven in de literatuur. Vervolgens worden de cellen geplaatste platen aangesloten op het stromingssysteem om de celrespons op stromingspathologieën te meten. De resultaten tonen veranderingen in morfologie en eiwitexpressie op basis van stromingsprofielen met behulp van optische microscopie en immunofluorescente kleuring.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven de peristaltische of pulsatiele pomp is de mogelijkheid om de pulsatiliteit van de stroming aan te passen om een zieke of gezonde reactie na te bootsen. Dit kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van arteriële ziekten te beantwoorden. Om te beginnen plaatst u nieuwe glasplaten van 75 millimeter bij 50 millimeter bij één millimeter in een schone glasplaat kleuringsschaal.
Voeg vervolgens voldoende 20% zwavelzuur oplossing toe om de glasplaten volledig onder te dompelen en incubeer ze in de zuur oplossing overnacht de volgende dag. Was de platen drie keer door ze vijf minuten in vers gedeïoniseerd water onder te dompelen. Na het spoelen onderdompelt u de platen gedurende 30 minuten in aceton en vervolgens overnacht in een oplossing van 6% drie amino propyl trixi seline in aceton.
Spoel de platen vervolgens drie keer gedurende vijf minuten in zuiver aceton, ververs het aceton na elke wasbeurt. Was de platen vervolgens drie keer in gedeïoniseerd water gedurende vijf minuten, ververs het gedeïoniseerd water na elke wasbeurt. Dompel de platen vervolgens in 1,5% glutaaraldehyde en laat ze 60 minuten ondergedompeld.
Na cross-linking was de platen twee keer in gedeïoniseerd water, ververs het gedeïoniseerd water na elke wasbeurt, plaats de platen vervolgens 30 minuten in 70% ethanol om ze te steriliseren. Verwijder de ethanol en laat eventueel achtergebleven residu uit de platen verdampen. Zodra ze droog zijn, rehydrateer de platen door ze kort in steriele gedeïoniseerd water te plaatsen.
Verwijder vervolgens de houder van de plaat en plaats deze in een vierkante petrischaal van 100 millimeter bij 100 millimeter. In de laminaire stromingskamer bedekt u de functionele plaat met één milliliter van een fibronectine-oplossing van 25 microgram per milliliter, waarbij het ongeveer gebied wordt bedekt dat zal worden blootgesteld aan de celkweekkamer. Bedek vervolgens de schaal en incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende één tot twee uur. Na incubatie, zuigt u de resterende oplossing af en zaait u 600.000 endotheelcellen in één milliliter DMEM met 10% FBS op de gecoate kant van de plaat.
Bedek de kamer en incubeer vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 120 minuten. Bedek vervolgens de cellen met extra medium en blijf ze incuberen tot ze 70 tot 80% confluent zijn. Verbind het stromingscircuit zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol en zoals hier getoond, zorg ervoor dat de dempingskamer en de ultrasone stromingsmeter in de juiste stromingsrichting zijn gerangschikt.
Vul vervolgens het stromingscircuit en reservoir met gedeïoniseerd water. Zorg ervoor dat de reservoiruitloopbuis ondergedompeld is in het reservoirvolume. Bepaal vervolgens de stromingsgolfvorm met behulp van een stromingsmeter.
Open de luchtafvoerklep op de dempingskamer om het vloeistof-luchtvolumeverhouding te wijzigen. Sluit de luchtafvoerklep op verschillende vloeistofvlakken en bereken de pulsatiliteitsindex. Om de index te berekenen, evalueert u de stromingsgolfvorm als de piek de VM max vertegenwoordigt.
De trog vertegenwoordigt de v min en de V mean is het gemiddelde van het signaalrecord. De pulsindexwaarden in een notitieboekje. Markeer het resulterende vloeistofvlak en de pulsatiliteitsindex op de dempingskamer met een viltstift voor toekomstig gebruik.
Bepaal de gewenste pulsatiliteitsindexniveaus uit pathologieliteratuur die in het bijbehorende tekstprotocol worden vermeld terwijl u de stroomkamer opwarmt. DMEM aangevuld met 1% FBS in een 37 graden Celsius waterbad. Haal een van de cel gecoate platen uit het medium zodra ze 70 tot 80% confluent zijn en plaats een afdichting op de kant waar de cellen zijn geplaatst.
Lign vervolgens het vacuümkanaal van de stroomkamer op de gaten in de afdichting. Bevestig vervolgens vacuümslangen op de vacuümpoorten en zorg ervoor dat er geen media naar het vacuüm lekt. Plaats een polycarbonaat plaat onder de glasplaat en klem de stroomkamerconstructie met één veerklem aan elke korte zijde en twee veerklemmen langs de lange zijden van de stroomkamer.
Verbind vervolgens de stroomkamer, inlaat en uitlaat met het stromingscircuit. Plaats het stromingssysteem in een incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide en vul het circuit met het voorverwarmde medium door het reservoir met het medium te vullen en het met lage pulsatiliteit in te pompen. Houd deze stroming gedurende vier uur aan om de cellen voor te conditioneren.
Vervolgens past u het vloeistofvolume in de dempingskamer aan op het vooraf gemarkeerde pulsatiliteitsindexniveau en cultiveert u de cellen gedurende de gewenste duur. De hier getoonde endotheelcellen werden gekweekt zonder stroming, met een constante stroming en met een pulsatiele stroming.
Veranderingen in morfologie kunnen worden gezien van de typische endotheelcelmorfologie naar een meer spilvormige morfologie na 24 uur blootstelling aan hoge pulsatiele stroming. Terwijl zowel statische als constante stroming weinig of geen verschil in morfologie vertonen. Gladde spiercellen worden ook beïnvloed door co-cultuur met endo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro om te helpen bij het bepalen van de celrespons in ziektepathologieën. Het experiment richt zich op het observeren van de effecten van verschillende pulsatiele stroompathologieën op endotheelcellen.
Belangrijkste onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Vasculare biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van de respons van endotheelcellen is cruciaal voor het bestuderen van vasculaire ziekten.
- Pulsiel stromen kan fysiologische omstandigheden in vitro nabootsen.
- Eerdere studies hebben aangetoond dat stromingsomstandigheden de celmorfologie en functie beïnvloeden.
- Dit onderzoek heeft tot doel deze omstandigheden te repliceren voor betere experimentele nauwkeurigheid.
Doel van het onderzoek
- Om de effecten van pulsatiele stroompathologieën op endotheelcellen te observeren.
- Om een betrouwbaar in vitro model voor vasculair onderzoek te vestigen.
- Om veranderingen in celmorfologie en eiwitexpressie als gevolg van stromingsprofielen te meten.
Gebruikte methoden
- Chemische behandeling van glasplaten voor celbevestiging.
- Bekleden van platen met eiwit om de groei van endotheelcellen te vergemakkelijken.
- Bepalen van de pulsatiliteitsindex van de stroom voor vergelijking met literatuur.
- Verbinden van cell-gezette platen met een stroomsysteem om reacties te meten.
Belangrijkste resultaten
- Veranderingen in de morfologie van endotheelcellen werden waargenomen onder verschillende stroomcondities.
- Eiwitexpressieniveaus varieerden op basis van de toegepaste stromingsprofielen.
- Optische microscopie en immunofluorescente kleuring werden gebruikt om resultaten te analyseren.
- De studie biedt inzichten in hoe stromingspathologieën het endotheelgedrag beïnvloeden.
Conclusies
- Dit in vitro model repliceert effectief fysiologische en pathologische bloedstroom.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van endotheelcelresponsen bij vasculaire ziekten.
- De methodologie kan worden toegepast op verder onderzoek in vasculaire biologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This in vitro flow model enables mechanistic de-risking of vascular targets by simulating physiological and pathological hemodynamics. It supports target validation through controlled modulation of pulsatility index to probe endothelial and smooth muscle cell responses. The system enhances predictive confidence in preclinical vascular research by linking flow dynamics to cytokine release and cross-talk mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by isolating flow as an independent variable in vascular cell remodeling.
- Operational Value: Enables reproducible assessment of cell morphology and protein expression under defined flow conditions.
- Scientific Value: Supports functional target validation by linking hemodynamic stress to cytokine release and cell-type cross-talk.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated co-culture systems for downstream compound screening in vascular disease models.
- Operational Value: Standardizes flow exposure via pressure damping chamber tuning for consistent pulsatility index control.
- Scientific Value: Generates quantitative dependent variable measurements (morphology, actin/myosin expression) for assay readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant shear stress to study vascular cell remodeling in stenosis or hypertension contexts.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery to preclinical validation via tunable flow pathologies.
- Scientific Value: Addresses risk-adjusted advancement by identifying flow-dependent hypertrophy and contractility markers.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement to lead optimization by providing hemodynamic context for vascular phenotypes.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of flow-dependent pathways in endothelial dysfunction and vascular remodeling.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible cell responses under controlled pulsatile and steady flow conditions.
- Analytics: Enables quantitative comparison of cell morphology and protein expression across flow profiles using imaging and staining.
- Translational Research: Connects hemodynamic stimuli to preclinical relevance through co-culture models reflecting arterial wall interactions.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular flow platform adaptable to multiple vascular cell types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by de-risking vascular targets through hemodynamic mechanism elucidation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via calibrated damping chamber and indexed flow waveforms.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by revealing flow-dependent contractility and hypertrophy phenotypes early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of vascular targets based on flow-responsive protein expression thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vascular cell culture and hemodynamic flow system setup.
- Depends on precision fluid handling, pressure damping chambers, and ultrasonic flow metering.
- Necessitates cross-team standardization of pulsatility index protocols for comparative studies.
- Involves adaptation considerations when extending to smooth muscle fibroblasts or co-culture configurations.
- Limited by approximation of complex physiological pulse waveforms, which may affect translational fidelity.
![Ontwikkeling en karakterisering van In Vitro Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca 2+] i En productie van stikstofoxide](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F54014.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A18.166Z&w=384&q=75)
