Name: In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: Leer een in vitro-model van fysiologische en pathologische bloedstroom voor vaatbiologie met endotheelcellen. Deze methode helpt onderzoekers celmorfologie en eiwitexpressie te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen financieringsbronnen, met inbegrip van AHA (13GRNT16990019 aan WT) en NHLBI (HL097246 en HL119371 om WT) te erkennen.

1. silanisatie en Biomolecuul functionalisering van Slide of polycarbonaatmembraan Opmerking: Veel chemicaliën en oplossingen in dit protocol hoge verdamping (ethanol (EtOH), aceton, etc.). Andere stappen inhouden lange incubatietijd voor lage verdamping. Paraffine film wordt aanbevolen om containers te verzegelen. Opgelet: Veel stoffen (inclusief: zwavelzuur, aceton, (3-aminopropyl) triethoxysilaan, glutaaraldehyde, EtOH) zijn gevaarlijke of vluchtige beschouwd. Raadplegen veiligheidsinformatieblad (VIB) van elk materiaal voor een goede opslag, behandeling en verwijdering voor gebruik. <ol><li> Plaats nieuw glasplaatje van 75 mm bij 50 mm bij 1 mm, in schone, glasplaatje vlekken gerecht ongeacht geaardheid, te zorgen voor volledige onderdompeling. Gebruik container voor stappen 1,1-1,12. Opmerking: Voor co-kweek omvatten polycarbonaat (PC) membraan met 0,4 micron poriegrootte, de afmetingen van 75 mm met 50 mm, voor alle volgende steps voor PC functionalisering en EG zaaien. </li><li> Dompel dia in zwavelzuur (20%), O / N. Let op: Raadpleeg de MSDS voor zwavelzuur voor gebruik. </li><li> Was schuif door onderdompeling in gedeïoniseerd water (DI) gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende DI. </li><li> Dompel dia in aceton gedurende 30 min. Let op: Raadpleeg de MSDS voor aceton voor gebruik. </li><li> Dompel dia in 6% (3-aminopropyl) triethoxysilaan / acetonoplossing O / N. Let op: Raadpleeg de MSDS voor (3-aminopropyl) triethoxysilaan en aceton voor gebruik. </li><li> Dompel dia in aceton gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende aceton. Let op: Raadpleeg de MSDS voor aceton voor gebruik. </li><li> Was schuif door onderdompeling in DI gedurende 5 minuten, drie keer, telkens veranderende DI. </li><li> Dompel dia in 1,5% glutaaraldehyde / DI oplossing gedurende 60 min. Let op: Raadpleeg de MSDS voor glutaaraldehyde voor gebruik. </li><li> Was schuif door onderdompeling in DI gedurende 5 min, tweemaal, telkens veranderende DI. </li><li> Plaats slides in 70% ethanol (EtOH) gedurende 30 min in steriele laminaire stroming kap. </li><li> Verwijder EtOH en de resterende residu verdampen. Dompel slides in steriele DI en afvoer om de dia rehydrateren. Opmerking: Slides of PC membraan kan worden afgesloten glasplaatje houder en bewaard bij 4 ° C maximaal een week. Bij gebruik voor celkweek, herhaalt u de stappen 1,10 en 1,11. </li><li> Verwijder de dia uit de diahouder en plaats deze in een 100 mm bij 100 mm vierkante petrischaal in de laminaire stroming kap. Opmerking: Deze container wordt gebruikt voor alle overige stappen. <ol><li> Bereid dia of PC voor endotheelcellen zaaien voor monocultuur experiment. <ol><li> Coat de gefunctionaliseerde dia of PC (stap 1,11) met 1 ml fibronectine (25 ug / ml), aan de ene kant, die het geschatte oppervlakte blootgesteld aan celcultuurkamer. </li><li> Incubeer dia&#39;s of PC steriele incubator ingesteld op 37 ° C gedurende 1-2 uur. </li><li> Na incubatie zuigen de overblijvende oplossing met een glass aspirator pipet verbonden met een vacuümbron. Opmerking: Slides kunnen nu worden opgeslagen O / N bij 4 ° C voor toekomstig gebruik. </li></ol></li><li> Volg 1.12.2 stappen alleen voor het bereiden van EC / SMC co-cultuur. Bereiden en zaad van gladde spiercellen (SMC) cultuur voor co-cultuur experiment. <ol><li> Plaats afdichtring bovenop de slede (stap 1,11), met afmetingen van 75 mm bij 50 mm buitendiameter, binnendiameter van 50 mm bij 30 mm, dikte 0,5 mm, en perforaties die aansluiten bij stromingskamer vacuüm. </li><li> Bereid 1 ml SMC in 10% FBS / DMEM suspensie. Neutraliseer 1 ml oplossing van 2 mg / ml collageen type I met 7% NaHCO3 en 0,1 M NaOH tot pH van 7,4 en meng met SMC vering uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Verspreid SMC oplossing binnen pakking en incubeer slides bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 30 min. </li><li> Na incubatie betrekking op de dia met 25 ml 0,1% foetaal runderserum (FBS) gemengd in Dulbecco&#39;s GemodificeerdEagle Medium (DMEM) voor 72 uur. </li></ol></li></ol></li><li> Cultuur endotheelcellen (EC) op glasplaatje / polycarbonaat membraan. <ol><li> Seed 1 ml EC in 10% FBS / DMEM met beginconcentratie van 6,0 x 10 5 cellen / ml op fibronectine oppervlakken glaasje of polycarbonaat membraan. </li><li> Incubeer cellen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 en 10% FBS gedurende 120 min. </li><li> Dekglaasjes bevattende cellen met 10% FBS / DMEM en plaats in incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 O / N, tot 70% -80% confluent. </li></ol></li></ol> 2. Bepaling van de viscositeit en volumestroom Rate NB: Roterende viscometers zijn gevoelige apparatuur, en de viscometer handleiding moet worden geraadpleegd voordat het kalibreren, op nul zetten, of het uitvoeren van metingen. <ol><li> Bepaal de gewenste vloeistof shear (τ) uit de literatuur van gerichte vaatstelsel van het experiment. </li><li> MEASURe 1% FBS / DMEM viscositeit (μ), met behulp van een roterende viscometer. </li><li> Bepaal vereiste volumestroom (Q) van Poiseuille vergelijking: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53224/53224eq1.jpg" /> , waarbij τ = vloeistof shear, μ = viscositeit, Q = vol. debiet, w = kamer breedte en h = kamer hoogte). </li><li> Stel de pomp om te beoordelen afgeleid in stap 2.3 stromen, en te gebruiken voor alle volgende stappen. </li></ol> 3. Bepaling van Pulsatility Index Opmerking: Alle aansluitingen binnen het systeem moet worden verbonden met de juiste maat lock-ring-to-weerhaak, of vrouwelijke Luer-to-weerhaak verbindingen. Het aansluiten van PVC-buis kan dan worden verbonden met weerhaak fittingen, en circuit voltooid. <ol><li> Sluit stroomkring volgens Figuur 2, met rustkamer (figuur 3) en ultrasone stroommeter in stroomrichting. Opmerking: De ultrasone flowmeter is een gevoelig stuk van de apparatuur, ende gebruiksaanwijzing moet worden geraadpleegd voor gebruik. </li><li> Vul stroom circuit en het reservoir met DI-water, door te zorgen voor reservoir afvoerbuis (de pomp) wordt ondergedompeld in het reservoir volume. Visualiseren golfvorm met een flowmeter. </li><li> Open ontluchtingsventiel op de rustkamer om vloeistof / lucht volume-verhouding te veranderen. Sluiten ontluchtingsventiel op verschillende tijdstippen vloeistofniveau en bereken pulsatility index (PI = (V Max - V min) / V Mean) met behulp van stroom golfvorm piek (V-Max), goot (V Min) en gemiddelde (V Mean). IP-waarden in notebook. </li><li> Mark resulterende vloeistofniveau en PI aan de rustkamer, met behulp van een vilten getipt, permanente inkt pen voor toekomstig gebruik. Bepaal gewenste PI niveaus van pathologie literatuur 11. </li><li> Silicon Tube Formation- Optioneel, meer geavanceerde methode voor het regelen van pulsatiliteit <ol><li> Meng de siliconenelastomeer basis en verharder in verschillende verhoudingen (bijvoorbeeld een base tot crosslinker-verhouding van 10: 1 tot 36:. 1) te variëren gerichte elastische moduli, zoals eerder toegelicht 2 </li><li> Fabriceren siliconen buizen door herhaalde dip-cure proces kort dompelen staal canule (14 G) in de siliconen prepolymeermengsel met een vooraf bepaalde base-to-crosslinker ratio. </li><li> Plaats de prepolymeer-beklede canule in een oven ingesteld op 60 ° C gedurende 4 uur om het polymeer coating te harden aan de canule, schakelen van de richting in het midden van uithardingsproces. </li><li> Herhaal het dompelen met dezelfde siliconenelastomeer mengsel en zet terug in de oven gedurende 4 bijkomende uren, die ~ 0,3 mm buizen resultaten. </li><li> Verwijder de ultradunne silicone buis van de roestvrij stalen canule. </li><li> Verbind buizen om circuit in plaats van rustkamer, en test PI voor elke stroom als in 3.3. </li></ol></li></ol> 4. Pomp Sterilisatie <ol><li> Dompel de stroom kamer (figuur 2), PVC-buis, en pakkingen in 10% waterstofperoxide (H 2 O 2). Wassen met steriele DI vóór stap 4. </li><li> Plaats het bloed pomp op een reserve-incubator plank. Opmerking: Incubator planken moeten roestvast staal, en in staat om het gewicht van de gehele stroomkring ondersteunen. </li><li> Vul de stroom circuit en het reservoir met 10% H 2 O 2 door te zorgen voor het reservoir afvoerbuis (de pomp) wordt ondergedompeld in het reservoir volume. Circuleren H 2 O 2 door pompen door circuit 20 min in laminaire stroming kap met UV licht op. </li><li> Zuig alle H 2 O 2 van buizen en wassen met steriele PBS door het pompen doorstroming circuit. </li></ol> 5. Flow Kamer Vergadering Opmerking: De stromingskamer bestaat uit een acrylaat, maat gemaakte plaat met vacuümpoorten en inlaat- en uitlaat stroompoorten (zie figuur 2). Kamer vergadering bestaat uit het plaatsen van de stroom kamer en pakkingen op de top van de cultuur dia&#39;s, proPerly uitgelijnd en wordt hierna beschreven. <ol><li> Opwarmen 1% FBS / DMEM in een 37 ° C waterbad en bereiden stroom kamer. <ol><li> Neem EG slide van media (van stap 1.13) en plaats de pakking op de top met cel kant naar boven. </li><li> (Optioneel) Neem PC membraan van media (van stap 1.13) en plaats de pakking op de top met cel kant naar boven. Plaats co-cultuur dia met geplaatste SMC (stap 1.12.2) onder PC membraan. </li></ol></li><li> Lijn vacuümkanaal van de stroom kamer met de gaten in de pakking (figuur 2). </li><li> Hechten vacuümbuis vacuüm poorten (figuur 2) zodat er geen media lekken naar vacuüm. </li><li> Plaats polycarbonaat plaat eronder glasplaatje en clamp stroom kamer samenstel met klemveren, een aan elke zijde van stromingskamer (figuren 2 en 5). </li><li> Plaats stroom systeem incubator bij 37 ° C en 5% CO 2, en vul circuit met de media door het pompen van gevuld reservoir bij lage pulsatility.Handhaaf deze stroom gedurende 4 uur voor preconditionering cellen. </li><li> Pas vloeistof volume in rustkamer aan gemarkeerde PI-niveau, en cultuur voor de gewenste tijd. </li></ol>

<ol><li>Scott-Drechsel, D., Su, Z., Hunter, K., Li, M., Shandas, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow+co-culture+system+for+studying+mechanobiology+effects+of+pulse+flow+waves%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">A new flow co-culture system for studying mechanobiology effects of pulse flow waves.</a> Cytotechnology. 64 (6), 649-666 (2012).</li>
<li>Tan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffening-Induced+High+Pulsatility+Flow+Activates+Endothelial+Inflammation+via+a+TLR2%2FNF-%CE%BAB+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Stiffening-Induced High Pulsatility Flow Activates Endothelial Inflammation via a TLR2/NF-κB Pathway.</a> PLoS ONE. 9 (7), e102195(2014).</li>
<li>Wexler, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+Calcification%3A+Pathophysiology%2C+Epidemiology%2C+Imaging+Methods%2C+and+Clinical+Implications+A+Statement+for+Health+Professionals+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery Calcification: Pathophysiology, Epidemiology, Imaging Methods, and Clinical Implications A Statement for Health Professionals From the American Heart Association.</a> Circulation. 94 (5), 1175-1192 (1996).</li>
<li>Lan, T. -H., Huang, X. -Q., Tan, H. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+fibrosis+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Pathol%22%5BJournal%5D)">Vascular fibrosis in atherosclerosis.</a> Cardiovasc Pathol. 22 (5), 401-407 (2013).</li>
<li>Lee, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+endothelial+recovery+and+reducing+neointimal+hyperplasia+using+sequential-like+release+of+acetylsalicylic+acid+and+paclitaxel-loaded+biodegradable+stents%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents.</a> Int J Nanomedicine. 9, 4117-4133 (2014).</li>
<li>Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Remodeling+in+Hypertension+Roles+of+Apoptosis+Inflammation%2C+and+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Vascular Remodeling in Hypertension Roles of Apoptosis Inflammation, and Fibrosis.</a> Hypertension. 38 (3), 581-587 (2001).</li>
<li>Greil, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+carotid+artery+flow+velocities+after+stent+implantation%3A+a+fluid+dynamics+study+with+laser+Doppler+anemometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endovasc+Ther%22%5BJournal%5D)">Changes in carotid artery flow velocities after stent implantation: a fluid dynamics study with laser Doppler anemometry.</a> J Endovasc Ther. 10 (2), 275-284 (2003).</li>
<li>Egorova, A. D., van der Heiden, K., Poelmann, R. E., Hierck, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+as+biomechanical+sensors+in+regulating+endothelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Primary cilia as biomechanical sensors in regulating endothelial function.</a> Differentiation. 83 (2), S56-S61 (2012).</li>
<li>Liu, S. Q., Goldman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+shear+stress+in+the+regulation+of+vascular+smooth+muscle+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+T+Bio-Med+Eng%22%5BJournal%5D)">Role of blood shear stress in the regulation of vascular smooth muscle cell migration.</a> IEEE T Bio-Med Eng. 48 (4), 474-483 (2001).</li>
<li>Scott, D., Tan, Y., Shandas, R., Stenmark, K. R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+pulsatility+flow+stimulates+smooth+muscle+cell+hypertrophy+and+contractile+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Lung+C%22%5BJournal%5D)">High pulsatility flow stimulates smooth muscle cell hypertrophy and contractile protein expression.</a> AJP: Lung C. 304 (1), L70-L81 (2013).</li>
<li>Panaritis, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsatility+Index+of+Temporal+and+Renal+Arteries+as+an+Early+Finding+of+Arteriopathy+in+Diabetic+Patients.%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Pulsatility Index of Temporal and Renal Arteries as an Early Finding of Arteriopathy in Diabetic Patients.</a> Ann Vasc Surg. 19 (1), 80-83 (2005).</li>
<li>Miao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Flow+Patterns+on+the+Localization+and+Expression+of+VE-Cadherin+at+Vascular+Endothelial+Cell+Junctions%3A+In+vivo+and+in+vitro+Investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of Flow Patterns on the Localization and Expression of VE-Cadherin at Vascular Endothelial Cell Junctions: In vivo and in vitro Investigations.</a> J Vasc Res. 42 (1), 77-89 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het reproduceren pulserende stroming in vitro, en kunnen instrumenteel eerste stap bij het ​​bepalen van de bijdrage stroomomstandigheden ziekte pathologieën. Vorige studies met behulp van dit protocol hebben gevonden stroom voorwaarden bijdragen aan vasculaire ontstekingsreactie. 1, 10 Bovendien, dit protocol is bedoeld voor ervaren laboratoria. Als zodanig, noch grondig vloeistofmechanica, of biochemische analyse wordt hierin beschreven. Voor meer...

Ziektecijfers voor hart- en vaatziekten zijn de grootste in Amerika, met veel als gevolg van ongezonde vaatstelsel. Gezonde bloedvaten bestaan ​​uit elastisch weefsel, zachte luminale oppervlak bedekt met een endotheelcel (EC) monolayer. Arteriële stroom kan worden gemodelleerd als een oscillerende golffunctie met positieve gemiddelde debiet. De pulsatility index (PI) is het quotiënt van oscillatie omvang en gemiddelde stroomsnelheid (PI = (max -.. Min) / gemiddelde), 1 en is gemodelleerd in vitro met variabele elasticiteit vat 2 arteriële elasticiteit van belang voor de opslag van stroom. energie uit hart contracties, verwijden onder systolische druk, en speelt een belangrijke rol bij het moduleren van de bloedstroom PI. Omdat het hart handhaaft een constante, pulsatiele, volumestroom, arteriële expansie verhoogt dwarsdoorsnede, verbetering stroming stabiliteit door het verminderen van stroomsnelheid, schuifspanning en PI. Vaak ongezonde slagaders huidige veranderingen in de elasticiteitof compliance, het weergeven van verstijving van vasculaire remodeling, littekenweefsel of calcificatie 3, 4. Bovendien kunnen andere vaataandoeningen, zoals neointima hyperplasie (NIH), aneurysma 5 en 6 hypertensie en vasculaire fibrose 4, diameter vat vernauwen. Echter, de huidige behandeling met geneesmiddelen en het apparaat de behandeling van vasculaire ziekten verwaarlozen vaak het belang van een vaatwand naleving of de bloedstroom dynamiek in vasculaire ziekte die vaak wordt gecompliceerd door veranderingen in het vat morfologie en eigenschappen. Noch ballondilatatie of stenting beantwoorden complicatie van wand 7 elasticiteit. Daarom is in vitro modellen van bloedstromen gevolg van arterieel vaatlijden en behandelingen van belang bij onderzoek ziekte pathologieën en toekomstige effectiviteit van de behandeling. Hierin beschrijven we een werkwijze voor het repliceren van fysiologische en pathologische bloedstroom ontworpen celreactie in vaatziekte Pathol bepalengieën. Vloeistofstroom veroorzaakt schuifspanning in de vaatwand, wat een belangrijk mechanisch signaal in gezond vat, die alle cellen binnen het vaatstelsel. Verschillende mechanische sensoren op het vasculaire endotheel voor vloeistofschuifspanning geïdentificeerd, zoals getoond in recente studies endotheliale mechanosensing 8 primaire cilium. Endotheliale celactiviteit en morfologie worden beïnvloed door stroomsnelheid richting en pulsatiliteit. Bovendien kan gladde spiercel (SMC) migratie beïnvloed door mechanisch-signalen van lage snelheid stroom door interstitiële vloeistof 9, en kunnen ook via de paracrienen van endotheliale cellen door hun reactie te stromen en mechanisch-transductie van stromingssignalen via cytokine 10 los. De &quot;dosis&quot; afhankelijk van de gemiddelde shear, PI en paracriene signalering kunnen ook van elkaar afhankelijk zijn. Daartoe de bepaling van vasculaire celrespons op vloeistofschuifspanning met gevarieerde &quot;dosering&quot; in monolaagkweekof co-cultuur in vitro kon mechanistische inzichten in vasculaire remodeling en verbetering van de ziekte en de behandeling voorspelling. Het stroomsysteem in dit experiment omvat een bloedpomp, een stroomopwaartse stromingsdemping luchtreservoir, een stroomafwaartse flowmeter alleen gebruikt tijdens de experimentele opstelling, een stroomafwaarts celcultuur, parallelle plaat stroming kamer en media reservoir. Controle van vasculaire stroming variabelen zoals betekenen debiet beats per minuut en PI kan worden bereikt door het regelen stroomsnelheid, pulsfrequentie, en invoering van de druk demping. Pulserende bloed pompen zijn leverbaar met een variabele slag verplaatsing, op gecontroleerde slagfrequentie, die rechtstreeks verband houden met volumestroom en polsslag bedoelt. Invoering van een lucht reservoir binnen de stroom circuit zorgt voor druk demping, waardoor de stroom oscillatie omvang. Media is een onsamendrukbare vloeistof, terwijl de lucht in de rustkamer samendrukbaar, waardoor overdruk uit de stroom golf te zijngeabsorbeerd door de lucht compressie. De lucht in de media-ratio zorgt voor controle over hoeveel demping optreedt. Een aangepaste celcultuur stromingskamer 75 mm in de lengte met 50 mm in de breedte is gemaakt van acryl. Flow komt via de inlaat poort, en breidt door het inlaatspruitstuk, consistente stroom over het geheel van de stroom kamer. Vergelijkbare flow en structuren zijn aanwezig op kameruitlaat. Cellen worden gezaaid gefunctionaliseerd slides, en vervolgens bevestigd aan de stromingskamer. Dit zorgt voor grote populaties gemakkelijk teruggevonden na de studie. Co-kweek-experimenten kan een poreus membraan van polycarbonaat om cel-tot-cel contact tussen culturen elimineren terwijl cytokine / stroom transport. Dit systeem is eerder gebruikt om in hoge PI doorstroming en het effect op endotheliale monolaag cultuur en EC / SMC co-kweek 1, 10, tot celrespons op pathologisch hoge PI ziekte te onderzoeken. Met een beschrijving van het protocol dat wordt gebruikt voor het modelleren van deze stroom convoorwaarden, hopen we anderen helpen bij het bepalen bijdrage stroom signaal reactie cel.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuurzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501</td><td></td></tr><tr><td>(3-Aminopropyl)triethoxysilaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde-oplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Glijplaatje (70 mm x 50 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X50</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaatmembraan</td><td>Millipore Corp.</td><td>HTTP09030</td><td></td></tr><tr><td>Siliconen pakking</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>RD 475464</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin (25 &mu;g/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Collageen Type-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fluka</td><td>36486</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Dempingkamer</td><td></td><td></td><td>Deze kamer is op maat gemaakt en kan worden aangevraagd met behulp van de technische tekening van Figuur 3.</td></tr><tr><td>Bloedpomp</td><td>Harvard Apparatus</td><td>529552</td><td></td></tr><tr><td>Poly-vinylcarbonaatbuis</td><td>US Plastic</td><td>65066, 65063, 65062</td><td>Er kunnen verschillende maten nodig zijn</td></tr><tr><td>Luer-verbindingen</td><td>Nordson Medical</td><td>Verschillende</td><td>Er zijn verschillende maten nodig, en er moet een aantal onderdelen worden gekocht voor vervanging.</td></tr><tr><td>Kweekkamer</td><td>Gefabriceerd in eigen beheer</td><td>Op maat</td><td>Acrylic kan worden gekocht in vellen en worden bewerkt voor het beoogde gebruik. De technische tekening die wordt getoond in Figuur 2 kan worden gebruikt om deze kamer te recreëren.</td></tr><tr><td>Vierkante petrischaal</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-14007-10</td><td></td></tr><tr><td>Glijplaatjeshouder</td><td>Capitol Scientific</td><td>WHE-900303</td><td></td></tr><tr><td>Fétaal runderserum</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Debijhouder</td><td>Sonotec, GmbH</td><td>Sonoflow co.55/060</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard-elastomeerkit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036-5EA</td><td></td></tr><tr><td>14 G stalen canule</td><td>General Laboratory Supply</td><td>S8365-1</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro model van de fysiologische en pathologische blood flow met toepassing op onderzoeken van vascular celremodelering

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vaatziekten is een veel voorkomende doodsoorzaak in de Verenigde Staten. Hierin presenteren we een methode om de bijdrage van stromingsdynamica richting vaatziekte pathologieën onderzoeken. Ongezonde slagaders vaak aanwezig met wand verstijving, littekens of gedeeltelijk stenose die allen invloed vloeistofstroomsnelheden en de omvang van de pulserende stroom of pulsatility index. Replicatie van verschillende stromingsomstandigheden is het resultaat van stemmen van een stromingsdruk rustkamer stroomafwaarts van een bloedpomp. Inbrengen van lucht in een gesloten stroom systeem zorgt voor een samendrukbaar medium tot pulserende druk absorberen uit de pomp, en daarom variëren de pulsatility index. De hierin beschreven werkwijze is eenvoudig gereproduceerd met hoge beheersing ingang en gemakkelijk meetbare resultaten. Sommige beperkingen recreatie van de complexe fysiologische pulsgolfvorm, die alleen benaderd door het systeem. Endotheelcellen, gladde spiercellen en fibroblasten worden beïnvloed door de bloedstroom thrdoorgedreven de slagader. De dynamische component van de bloedstroom wordt bepaald door het hartminuutvolume en vaatwand compliance. Vasculaire cel mechanisch-transductie van stroom dynamiek kan cytokineafgifte en cross-talk tussen celtypen binnen de slagader veroorzaken. Co-kweek van vasculaire cellen een nauwkeuriger beeld reflecterende cel-cel interacties aan de bloedvatwand en vasculaire respons op mechanische signalering. Bijdrage van stromingsdynamica, inclusief de celrespons op de dynamische gemiddelde (of constante) componenten van stroom, is daarom een ​​belangrijke maatstaf bepalen pathologie en behandeling werkzaamheid. Door het introduceren van een in vitro co-cultuurmodel en druk demping stroomafwaarts van bloed pomp die gesimuleerde cardiale output produceert, kunnen verschillende vaatlijden pathologieën onderzocht.

Onderhoud van stromingsomstandigheden is afhankelijk juiste montage van de stroomkring (figuur 1). Buisdiameter is een belangrijk selectiecriterium in assembly, met grotere diameters verminderen stromingsweerstand en daaropvolgende drukverlies vóór en na de kweekkamer. Om beoogde druk en de stroomsnelheid te garanderen, monteren van het systeem met flowmeter voor de proef met de bedoeling slang. Uitlijning van de cultuur kamer vacuüm kanaal (figuur 2), met perforaties op silicium pakkin...

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van verschillende pathologieën van pulserende stroming op endotheelcellen in vitro te observeren. Dit wordt bereikt door glazen objectglaasjes eerst chemisch te behandelen en te coaten met eiwit om celhechting te garanderen tijdens blootstelling aan de stroming.Als tweede stap wordt de pulsatie-index van de flow bepaald, wat een vergelijking van de in vitro flow met waarden uit de literatuur mogelijk maakt. Vervolgens worden slides met daarop geplaatste cellen aangesloten op het flowsysteem om de cellulaire respons op flowpathologieën te meten. De resultaten tonen veranderingen in morfologie en eiwitexpressie op basis van flowprofielen, gebruikmakend van optische microscopie en immunofluorescente kleuring.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de peristaltische of pulserende pomp is de mogelijkheid om de flowpulsatie aan te passen om een zieke of gezonde respons na te bootsen. Dit kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van arteriële ziekten. Begin met het plaatsen van nieuwe glazen objectglazen met afmetingen van 75 millimeter bij 50 millimeter bij één millimeter in een scho

in-vitro-model-physiological-pathological-blood-flow-with-application

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Om de interactie van bacteriën met de bloedvaten onder afschuifspanning te bestuderen, worden een stromingskamer en een in vivo mesenteriale intravitale microscopiemodel beschreven die het mogelijk maken om de bacteriële en gastheerfactoren die bijdragen aan vasculaire adhesie te ontleden.

In vitro en in vivo model voor Bacteriële hechting aan de vaatwand Onder Flow omstandigheden te bestuderen

Primaire humane umbilicale veneuze endotheelcellen (HUVEC's) werden gekweekt tot confluentie binnen een microfluïdisch netwerkapparaat. De endotheliale celverbinding en F-actine-verdelingen werden geïllustreerd en de veranderingen in intracellulaire calciumconcentratie en stikstofmonoxideproductie als reactie op adenosinetrifosfaat (ATP) werden gequantificeerd in real-time op individueel cellniveau.

Ontwikkeling en karakterisering van<em&gt; In Vitro</em&gt; Microvaatje Netwerk- en kwantitatieve metingen van endotheliale [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; i</sub&gt; En productie van stikstofoxide

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

We presenteren een in vitro vasculaire ziekte model om hele bloed interacties met patiënt-afgeleide endotheel te onderzoeken. Dit systeem maakt het mogelijk om tromboogene eigenschappen van primaire endotheelcellen onder verschillende omstandigheden te bestuderen. De methode is vooral geschikt om in situ tromboïgeniteit en antistollingstherapie te evalueren tijdens verschillende fasen van stolling.

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

Hier bieden we een microfluïdische chip en een automatisch gecontroleerd, zeer efficiënt circulatiemicrofluïdisch systeem dat de initiële micromilieu van neovascularisatie samenvat, waardoor endotheelcellen (EC's) tegelijkertijd kunnen worden gestimuleerd door hoge luminale schuifspanning, fysiologisch niveau van transendotheliale stroom en verschillende vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) distributie tegelijkertijd.

Microfluïdisch model om de eerste gebeurtenis van neovascularisatie na te bootsen

Hier presenteren we een nieuw protocol om de gerichte afzetting van medicijndragers aan endotheelcellen in gefabriceerde, reële, driedimensionale menselijke slagadermodellen onder fysiologische stroom te bestuderen en in kaart te brengen. De gepresenteerde methode kan dienen als een nieuw platform voor het richten van medicijndragers binnen het vasculaire systeem.

In vitro 3D-celgekweekte arteriële modellen voor het bestuderen van vasculaire drugtargeting onder stroom

Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.

Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor

Hier wordt een eenvoudige workflow beschreven om endotheelcellen te onderscheiden van menselijke pluripotente stamcellen, gevolgd door een gedetailleerd protocol voor hun mechanische stimulatie. Dit maakt het mogelijk om de ontwikkelingsmechanobiologie van endotheelcellen te bestuderen. Deze aanpak is compatibel met stroomafwaartse assays van levende cellen die na mechanische stimulatie uit de kweekchip zijn verzameld.

In vitro Model van foetaal menselijk vat op chip om ontwikkelingsmechanobiologie te bestuderen

We hebben een afstembaar substraat op basis van gelatine gesynthetiseerd en gekarakteriseerd voor het kweken van vasculaire endotheelcellen (EC's) onder relevante vasculaire stromingsomstandigheden. Dit biomimetische oppervlak repliceert zowel fysiologische als pathologische omstandigheden, waardoor de studie van mechanische krachten op het EC-gedrag mogelijk wordt en ons begrip van vasculaire gezondheid en ziektemechanismen wordt bevorderd.

In vitro model dat substraatstijfheid en stroming integreert om endotheelcelreacties te bestuderen

Leer een in vitro-model van fysiologische en pathologische bloedstroom voor vaatbiologie met endotheelcellen. Deze methode helpt onderzoekers celmorfologie en eiwitexpressie te analyseren.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Meer video's verkennen