Name: Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Leer herbicide-metabolisme meten in dicot onkruid via een weggesneden bladassay. Deze methode vermindert variabiliteit en elimineert storende factoren voor nauwkeurige resultaten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley en Brittany Janney voor hun hulp bij de plantengroei en extracties, Dr. Anatoli Lygin voor zijn hulp bij chromatografische analyses, en Syngenta Crop Protection voor de financiering.

1. Plant Materiaal, Groei Voorwaarden en vegetatieve Klonen Opmerking: Drie waterhemp populaties werden onderzocht in dit onderzoek: MCR (van McLean Provincie, IL), ACR (van Adams County, IL) en WCS (van Wayne County, IL) (tabel 1). <ol><li> Verzamelen en schorten waterhemp zaden in 0,1 g L -1 agar: water oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 30 dagen kieming te verbeteren. Opmerking: Sommige waterhemp populaties slapende, maar deze stap helpt om kiemrust overwinnen en zaad ontkiemt gelijkmatiger. </li><li> Ontkiemen zaden van elke waterhemp populatie (zoals in tabel 1) bij 12 x 12 cm schalen met een medium potten in de kas. <ol><li> Handhaven kas omstandigheden bij 28/22 ° C dag / nacht temperatuur binnen een 16/8 hr fotoperiode 12. </li><li> Supplement natuurlijk licht in de kas met licht van kwik halogeen lampen met een minimum van 500 umol m bieden -2 </sup&gt; sec -1 fotonflux in de fabriek luifel niveau. </li></ol></li><li> Transplant ontstond zaailingen als ze 2 cm lang in 80 cm 3 potten in de kas. </li><li> Zaailingen in 950 cm 3 potten met een 3: 1: 1: 1 mengsel van potgrond: bodem: turf: zand als zaailingen zijn 4 cm hoog. Voeg 5 g slow-release meststof granules elke pot en meng dit grondmengsel. </li><li> Snijd en verwijder de shoot topmeristeem die de drie jongste blaadjes van 7 cm hoge planten aan apicale dominantie te elimineren. Opmerking: Deze stap zorgt ervoor dat elke plant genoeg 3 cm oksel scheuten te klonen zal groeien. </li><li> Accijns vijf axillaire scheuten (3 cm lang) wanneer zaailingen ongeveer 14 cm lang van elke waterhemp populatie (zoals in tabel 1). Verwijder het merendeel van de bladeren van deze axillaire scheuten vochtverlies bij verdere verwerking af, maar behouden twee jongste bladeren verdere groei toe bij overplanten. <br/&gt; Opmerking: Behandel voorzichtig en probeer niet om de scheuten beschadigen wanneer het verwijderen van de bladeren. Label elke plant met een staak. </li><li> Transplant oksel schiet in 80 cm potten 3 (één zaailingen per pot) in potten medium, die hetzelfde medium voor kieming. Oppotten medium moet in eerste instantie worden verzadigd totdat wortels vorm in de groeikamer, onderhouden dan constant vocht en plaats potten in de groei kamer voor 7 dagen om wortels te vestigen. Opmerking: Planten zijn zeer gevoelig op dit punt en mag niet worden benadrukt. <ol><li> Onderhouden kweekkamer omstandigheden bij 28/22 ° C dag / nacht temperatuur binnen een 16/8 hr fotoperiode 12. </li><li> Een combinatie van gloeilampen en tl-lampen kunnen worden gebruikt om licht te geven in de groei kamer en moet ten minste 550 umol m -2 s -1 fotonflux op fabriek luifel level 12 te leveren. </li></ol></li><li> Weer transplantatie in 950 cm 3 potten (één zaailing per pot) containing een 3: 1: 1: 1 mengsel van potgrond: bodem: turf: zand (ook 5 g slow-release meststof korrels) als gekloonde planten zijn 4 cm lang, over te dragen dan terug naar de kas. </li><li> Kloon de planten een tweede keer met behulp van dezelfde methode hierboven beschreven (dwz, herhaal stappen 1,5-1,8, en ga dan verder met stap 2.1). Voor een typische tijdsverloop studie, het genereren van klonen van ten minste zes onafhankelijke planten uit elke waterhemp bevolking en ze opnemen als lijnen MCR 1-6, ACR 1-6 en WCS 1-6. <ol><li> Vaststellen ten minste zes verschillende &quot;ouder&quot; klonale lijnen, om het experiment te herhalen en adequaat vertegenwoordigen genetische variabiliteit binnen elke waterhemp populatie. </li><li> Afhankelijk van hoeveel tijd de punten zullen worden geanalyseerd, het genereren van voldoende sub-klonen van elkaar &quot;ouder&quot; klonale lijn naar een tijdsverloop studie uit te voeren. </li></ol></li></ol> 2. Het uitvoeren van een metabolisme studie met weggesneden Waterhemp Bladeren <ol><li> Uitsnijden derde-jongste bladeren (2-3 cm lang, 0,5 cm onder geschakelde bladsteel) wanneer gekloneerd waterhemp planten 10 tot 12 cm lang voor herbicide metabolisme en DT 50 analyse. </li><li> Gesneden blad bladstelen van elkaar waterhemp fabriek een tweede keer (zorgen dat 0,3 cm van de bladsteel blijft) onder water, en leg deze cut eindigt in 1,5 ml plastic flesjes (één blad per flesje) 15. Opmerking: Het snijden van een tweede keer onder water voorkomt luchtbellen vormen en houtvaten inpluggen. <ol><li> Ten eerste, gedeeltelijk onderdompelen uitgesneden blad met gesneden bladsteel in pre-incubatie buffer (200 pl) van 0,1 M Tris-HCl (pH 6) gedurende 1 uur. </li><li> Ten tweede verplaatst elk blad een nieuwe 1,5 ml flacon met een incubatiebuffer (200 pl) van 0,1 M Tris-HCl (pH 6) plus 150 pM [URL- 14 C] herbicide en incubeer bij 28 ° C gedurende 1 uur tot zorgen voor herbicide absorptie in de bladeren. Opmerking: Beide 14 C-mesotrione en <stot&gt; 14 C-primisulfuron-methyl werden gebruikt in onze studies op specifieke activiteiten van ongeveer 20 mCi mmol -1. Zowel diffusie en opname door het xyleem transpiratie stroom bij aan de hoeveelheid herbicide opgenomen per blad. Opmerking: Het effect van metabole remmers op herbicide metabolisme kan worden bepaald door het modificeren stappen 2.2.1 en 2.2.2 hierboven. Voeg 100 pM van de remmer aan het pre-incubatie buffer en laat incubeer gedurende 2 uur, vervolgens transfer naar incubatiebuffer met herbicide en opnieuw toevoegen 100 pM remmer. Bijvoorbeeld malathion en tetcyclacis remmen bepaalde cytochroom P450-activiteiten in planten 15-17. </li><li> Was het ondergedompelde gedeelte van weggesneden bladeren met gedemineraliseerd water en breng uitgesneden bladeren tot een kwart sterkte Murashige en Skoog (MS) zoutoplossing (500 ul) voor 0 uur, 5 uur, 11 uur, 23 uur of 35 uur, respectievelijk, in de groei kamer voor het tijdsverloop metabolisme studie. </li></ol></li><li> Oogst door het verwijderen van verlofs van incubatieoplossing op het juiste tijdstip handmatig slijpen elk blad weefsel in vloeibare stikstof via een polypropyleen buis (15 ml) en glazen stamper. </li><li> Extract radioactief gemerkt herbicide en metabolieten uit elk blad met 7 ml 90% aceton met een laboratorium weefselhomogenisator dezelfde polypropyleen buis als hierboven. Spoel weefselhomogenisator met een extra 7 ml 90% aceton, en blijven homogeniseer totdat weefsel grondig verpulverd (gewoonlijk ongeveer 2 min). Opmerking: 90% aceton kan worden gebruikt voor de winning van de meeste herbiciden uit plantenweefsel. Indien deze methode kan niet meer dan 90% van het radioactief gemerkte verbindingen opgenomen te extraheren, vervolgens 90% methanol en 90% acetonitril kan worden vervangen als het extractieoplosmiddel. </li><li> Label 90% aceton extracten (14 ml totaal) en opslag bij -4 ° C gedurende 16 uur om voor extra extractie plaatsvinden. Let op: Na deze extractie van behandelde bladeren, de hoeveelheid winbare radioactivity is typisch ten minste 98% van de radioactief gemerkte verbindingen opgenomen door het behandelde blad. In uitgesneden bladeren niet-extraheerbare radioactiviteit (gebonden resten) gemiddeld slechts 0,3% voor alle tijdstippen in onze vorige studie 12, maar dit aantal kan variëren afhankelijk van het gebruikte herbicide en tijdstip onderzocht. </li><li> Centrifugeer monsters bij 5000 xg gedurende 10 min en de supernatanten geconcentreerd bij 40 ° C met een roterende verdamper tot een eindvolume van 0,5 ml wordt verkregen. Transfer dit volume naar een 2,0 ml plastic buis. </li><li> Voeg acetonitril: water (1: 1, betrokken op volume) regelen het eindvolume van de plantenextracten 1,25 ml en re-centrifuge bij 10.000 xg gedurende 10 min om eventuele deeltjes te verwijderen. </li><li> Meet totale radioactiviteit in een monster genomen uit elk monster (dpm gl -1) met vloeistofscintillatietelling spectroscopie (LSS) 12 en normaliseren hoeveelheden [14 C-gelabelde] verbindingen geïnjecteerd voor HPLC-analyse (bijvoorbeeld 10,000 totale dpm / monster / run) zodat y-assen uniform onder monsters zijn als grafische resultaten. </li></ol> 3. HPLC analyse van herbicide Metabolisme in weggesneden Bladeren Opmerking: Resolve totaal extraheerbare radioactiviteit in ouder herbicide en herbicide metabolieten met behulp van de volgende RP-HPLC omstandigheden 12. <ol><li> Voer RP-HPLC met een kolom C 18 (4,6 x 250 mm, 5 urn deeltjesgrootte analytische HPLC) met een stroomsnelheid van 1 ml min-1 voor de meeste niet-polaire herbiciden. Opmerking: C 4 of C 12 RP-HPLC kolommen kunnen ook worden gebruikt om de scheiding van de bovenliggende herbicide van de metabolieten optimaliseren. Een pre-column filter en / of voorkolom kunnen ook worden gebruikt om te beschermen en de levensduur van de kolom RP. <ol><li> Gebruik de volgende mobiele fase voor HPLC-RP: Eluent A, 0,1% mierenzuur (v / v) in water en elutiemiddel B 100% HPLC-kwaliteit acetonitril. Opmerking: HPLC-kwaliteit methanol kan ook gebruikt worden als Eluent B voor het oplossen van meer polaire verbindingen en metabolieten, maar wees ervan bewust dat de retentietijd ook kunnen veranderen. Opmerking: Het elutieprofiel gebruikt mesotrione of primisulfuron-methyl oplossen van de polaire metabolieten in het onderzoek 12 is: Stap 1, A: B (4: 1, v / v) A: B (3: 2, v / v ) in een lineaire gradiënt (12 min); Stap 2, A: B (3: 2, v / v) A: B (3: 7, v / v) in een lineaire gradiënt (5 min); Stap 3, A: B (3: 7, v / v) A: B (1: 9, v / v) in een lineaire gradiënt gedurende 2 min (met in totaal 19 min). Opmerking: Gradiënten en isocratische stappen moeten mogelijk worden aangepast op basis van de fysische eigenschappen van het uitgangsmateriaal om de oplossing te optimaliseren. </li><li> Volg de bovenstaande lineaire gradiënt stappen A: B (1: 9, v / v) A: B (4: 1, v / v) in een lineaire gradiënt (3 min) en A: B (4: 1, v / v) isocratisch stap (tenminste 2 min) opnieuw equilibreren van de kolom RP vóór het injecteren van de volgende extract 12. </li></ol></li><li> Detecteren en visualiseren radioactief gemerkte verbindingen met een Flow Scintillation Analyzer. Noteer de hoeveelheid bovenliggende herbicide resteert in elk monster als percentage van totale radioactiviteit in elk monster (gedetecteerd en gekwantificeerd door flow Scintillation Analyzer volgens de instructies van de fabrikant) met snelheden van herbicide metabolisme in elk waterhemp populatie bepaalt gedurende het tijdsverloop. </li></ol> 4. Statistische Procedures <ol><li> Schik behandelingen in een volledig gerandomiseerd design (of een andere geschikte regeling voor statistische analyse). </li><li> Voer twee onafhankelijke experimenten bij elke behandeling, uit drie biologische herhalingen voor elk experiment. De twee onafhankelijke experimenten omvatten zes biologische herhalingen in totaal. Indien het experiment effect niet significant (α = 0,05), combineren en analyseren van gegevens van elk onafhankelijk experiment. Indien het experiment effect significant is, dan analyseert elk experiment afzonderlijk. Let op: Neem de eerste drie biologische repliceert in Experiment 1 en de volgende drie biologische repliceert in Experiment 2. Elke biologische repliceren vertegenwoordigt een duidelijke &quot;ouder&quot; klonale lijn afgeleid van elke populatie (MCR 1-6, 1-6 ACR en WCS 1-6), zodat elke tijd- Natuurlijk analyse maakt gebruik van genetisch identieke planten. De twee onafhankelijke experimenten omvatten zes biologische herhalingen in totaal, die zorgt voor een adequate vertegenwoordiging van genetische variabiliteit en de bepaling van een gemiddelde DT 50 voor elke waterhemp bevolking. </li><li> Analyseer de gegevens met niet-lineaire kleinste kwadraten regressie en passen ze met een eenvoudige eerste orde curve in te schatten DT 50 s. De vergelijking hieronder beschrijft het model: <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53236/53236eq1.jpg" /></li><li> wanneer in dit model y staat voor het percentage van de ouder herbicide resterende op tijdstip t, μ i de DT 50 perwaterhemp bevolking i, en de parameter C 0 is het geschatte bedrag van de ouder herbicide aanwezig bij t = 0 12. </li></ol>

<ol><li>Yu, Q., Powles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism-based+herbicide+resistance+and+cross-resistance+in+crop+weeds%3A+A+threat+to+herbicide+sustainability+and+global+crop+production%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production.</a> Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).</li>
<li>Powles, S. B., Yu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+in+action%3A+plants+resistant+to+herbicides%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution in action: plants resistant to herbicides.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).</li>
<li>Heap, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+perspective+of+herbicide-resistant+weeds%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Global perspective of herbicide-resistant weeds.</a> Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).</li>
<li>Délye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site-based+resistance+should+be+the+centre+of+attention+for+herbicide+resistance+research%3A+Alopecurus+myosuroides+as+an+illustration%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration.</a> Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).</li>
<li>Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+enzymes+for+a+new+job.+Herbicide+detoxification+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants.</a> Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).</li>
<li>Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detoxification+without+intoxication%3A+herbicide+safeners+activate+plant+defense+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression.</a> Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).</li>
<li>Siminszky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cytochrome+P450-mediated+herbicide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism.</a> Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).</li>
<li>Fonné-Pfister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxylation+of+primisulfuron+by+an+inducible+cytochrome+P450-dependent+monooxygenase+system+from+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).</li>
<li>Steckel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dioecious+Amaranthus+spp.%3A+here+to+stay%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Technology%22%5BJournal%5D)">The dioecious Amaranthus spp.: here to stay.</a> Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).</li>
<li>Horak, M. J., Loughin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+analysis+of+four+Amaranthus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Growth analysis of four Amaranthus species.</a> Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).</li>
<li>Hausman, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+HPPD-inhibiting+herbicides+in+a+population+of+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+from+Illinois%2C+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States.</a> Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).</li>
<li>Ma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+detoxi%EF%AC%81cation+mechanisms+confer+resistance+to+mesotrione+and+atrazine+in+a+population+of+waterhemp%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinct detoxiﬁcation mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp.</a> Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-target-site+resistance+to+ALS+inhibitors+in+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus).</a> Weed Science. in press, (2015).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+waterhemp+%28Amaranthus+tuberculatus%29+biotype+with+multiple+resistance+across+three+herbicide+sites+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Science%22%5BJournal%5D)">A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action.</a> Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).</li>
<li>Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herbicide-insecticide+interaction+in+maize%3A+malathion+inhibits+cytochrome+P450-dependent+primisulfuron+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Pesticide+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).</li>
<li>Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorreia%2C+MA+%22Cytochrome+P450%3A+Structure%2C+Mechanism%2C+and+Biochemistry%22">Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry</a>. Ortiz de Montellano, P. R. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York. 247-322 (2005).</li>
<li>Hawkes, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesotrione%3A+mechanism+of+herbicidal+activity+and+selectivity+in+corn%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Brighton+Crop+Protection+Conference+%E2%80%93+Weeds%22%5BJournal%5D)">Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn.</a> Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).</li>
<li>Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+herbicide+responses+among+Illinois+waterhemp+%28Amaranthus+rudis+and+A.+tuberculatus%29+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations.</a> Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).</li>
<li>Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+resistance+across+glufosinate%2C+glyphosate%2C+paraquat+and+ACCase-inhibiting+herbicides+in+an+Eleusine+indica+population%5BTitle%5D)+AND+%22Weed+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population.</a> Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).</li>
<li>Iwakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+CYP81A12+and+CYP81A21+are+associated+with+resistance+to+two+acetolactate+synthase+inhibitors+in+Echinochloa+phyllopogon%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon.</a> Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De uitgesneden blad hierin beschreven werkwijze is eerder gebruikt in onderzoeken primisulfuron metabolisme in maïs bladeren 15, maar onze resultaten tonen aan dat dit protocol ook doeltreffend, nauwkeurig en reproduceerbaar te meten herbicide metabolisme in een tweezaadlobbige onkruidsoorten 12. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek vergeleken met hele plant studies is dat een uitgesneden blad onafhankelijk is van de hele plant translocatie patronen postemergence, systemische h...

Herbicideresistentie in onkruid vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde productie van voedsel en vezels 1,2. Momenteel duizenden van resistente bevolking en biotypen van meer dan honderd wiet soorten wereldwijd zijn gedocumenteerd en onderzocht 3. Een belangrijk mechanisme dat herbicide resistentie in planten is de verandering van herbicide doel- ter genen en eiwitten, met inbegrip van genetische mutaties die herbicide-eiwit binding kinetiek of amplificatie van het target-gen ter 2 beïnvloeden. Metabole ontgifting via de verhoogde activiteiten van cytochroom P450 monooxygenase (P450) of glutathion S-transferase (GST) enzymen is een ander mechanisme dat herbicideresistentie in onkruid, dat verschilt op verschillende manieren van target-locatie-gebaseerde mechanismen 2 verleent. -Metabolische gebaseerde verzet heeft belangrijke gevolgen voor de vraag of planten fitness kosten (aka fitness sancties) kan het gevolg zijn van het herbicide-resistentie mechanism, alsmede over de mogelijkheden voor een enkele detoxificatie mechanisme om cross- of meerdere herbicideresistentie in onkruidpopulaties 1,2,4 verlenen. In het algemeen, kunnen herbicide metabolisme in planten worden onderverdeeld in drie fasen 5. Fase I omvat herbicide conversie of activering zoals P450-gemedieerde hydroxylering van aromatische ringen of alkylgroepen of door N - of O- dealkylering reacties, wat leidt tot verhoogde polariteit en gedeeltelijke herbicide ontgifting 5,6. Nieuw geïntroduceerde functionele groepen in Fase I koppeling plaatsen voor conjugatie kunnen bieden aan gereduceerd glutathion met GST of glucose door UDP-afhankelijke glycosyltransferases in Fase II 5,7. Bijvoorbeeld, grote initiële metaboliet van primisulfuron-methyl in maïs hydroxy-primisulfuron-methyl 8, die verder kan worden omgezet in hydroxyl-primisulfuron-glucoside (fase II) en vervolgens getransporteerd naar de vacuole voor langdurige opslag of verdere metabolische proverwerking 5,6 (Fase III). Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) is moeilijk te control, tweezaadlobbige jaarlijkse onkruidsoorten die de productie van maïs (Zea mays), sojaboon (Glycine max), en katoen (Gossypium hirsutum) in de Verenigde Staten belemmert. De hoge mate van genetische diversiteit van waterhemp wordt vergemakkelijkt door zijn tweehuizig biologie en lange afstand wind bestuiving, en een vrouwelijke waterhemp plant kan produceren tot een miljoen zaden 9. Deze zaden zijn klein en gemakkelijk verspreid, wat natuurlijk begiftigen waterhemp een effectieve verspreiding mechanisme. Waterhemp toont continu kieming gedurende het groeiseizoen 9, en de zaden kunnen ontkiemen na enkele jaren van kiemrust. Waterhemp is een C 4 plant die een hoger groeipercentage dan de meeste breedbladige onkruiden in akkerbouw teeltsystemen 10 bezit. Daarnaast waren er talrijke waterhemp populatie resistent zijn tegen meerdere famIlies herbiciden 3. Een populatie van waterhemp (aangeduid MCR) vanaf Illinois is tegen 4-hydroxy-fenylpyruvaat dioxygenase (HPPD) -inhibiting herbiciden 11, zoals mesotrione, alsmede atrazine en acetolactaatsynthase (ALS) -inhibiting herbiciden, waaronder primisulfuron-methyl , als gevolg van niet-target-site op basis mechanismen 12,13. Een andere populatie waterhemp aangewezen ACR 14, die primisulfuron-methyl-bestand (als gevolg van een mutatie in het ALS-gen) en atrazine-resistent maar gevoelig voor mesotrione en een waterhemp populatie aangewezen WCS 14 die gevoelig is voor primisulfuron-methyl, mesotrione en atrazine werden vergeleken met MCR in ons eerder onderzoek 12 en actuele experimenten (samengevat in tabel 1). Eerste studies niet veranderingen in de HPPD gensequentie of expressie niveaus, of verminderde opname mesotrione detecteren, in de MCRpopulatie vergelijking met mesotrione-gevoelige populaties 12. Echter, het metabolisme studies met hele planten aangetoond aanzienlijk lagere niveaus van de ouder mesotrion herbicide in MCR vergelijking met ACR en WCS, die gecorreleerd zijn met eerdere fenotypische reacties op Mesotrione 11,12. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Waterhemp Bevolking </td><td> Afkorting </td><td> Fenotype Mesotrione </td><td> Mesotrione resistentiemechanisme </td><td> Fenotype primisulfuron </td><td> Primisulfuron resistentiemechanisme </td></tr><tr><td> McLean County-Resistant </td><td> MCR </td><td> Resistente </td><td> Metabolisme * </td><td> Resistente </td><td> Metabolisme </td></tr><tr><td> Adams County-Resistant </td><td> ACR </td><td> SENSITive </td><td> - </td><td> Resistente </td><td> Target-website mutatie in ALS 14 </td></tr><tr><td> Wayne County-Sensitive </td><td> WCS </td><td> Gevoelig </td><td> - </td><td> Gevoelig </td><td> - </td></tr></tbody></table> * Niet-target-terrein resistentie mechanismen, anders dan verbeterde stofwisseling, kan ook verlenen mesotrione weerstand in de MCR bevolking 12. Tabel 1: beschrijving waterhemp populaties van Illinois in deze studie. Naast het bepalen van de tarieven van herbicide metabolisme in intacte waterhemp zaailingen, werd een verschillende experimentele benadering ontwikkeld en toegepast in lopende onderzoek metabolisme onderzoeken met behulp van een uitgesneden waterhemp bladassay 12 en verschillende P450 remmers (bijv tetcyclacis en malathion). Deze methode is specifiek aangepast voor waterhemp een Previlende onderzoek primisulfuron-methyl metabolisme in weggesneden maïs laat 15, omdat de weggesneden blad test nog niet gemeld voor het uitvoeren van herbicide metabolisme onderzoek in een tweezaadlobbige plant. De organophophosate insecticide malathion is vaak gebruikt voor in vivo en in vitro-metabolisme herbicide onderzoek P450 betrokkenheid 16 geven. Bijvoorbeeld, tolerantie en snelle metabolisme van mesotrione in maïs zijn te wijten aan P450-gekatalyseerde ring hydroxylering, die werd gecontroleerd toen malathion verhoogde gevoeligheid maïs mesotrione 17. Ook malathion remde het metabolisme van de ALS-remmer primisulfuron-methyl in weggesneden maïs laat 15. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek is dat gegevens die onafhankelijk zijn van gehele plant translocatie patronen, een belangrijke factor om te overwegen bij het beoordelen metabolisme van systemische herbiciden na het opkomen in planten. Derhalve maakt deze werkwijze kwantitatief enkwalitatieve metabole analyses te richten op één behandeld blad 12. Een vegetatieve kloneringsstrategie, in combinatie met het uitgesneden blad protocol, is eerder gebruikt in waterhemp tot metabolismeonderzoeken 12 voeren. Vanwege de aard van uitkruising waterhemp (aparte mannelijke en vrouwelijke planten), en de grote mate van genetische diversiteit binnen tweehuizig Amaranthus soorten 9, dit protocol ervoor gezorgd dat genetisch identieke waterhemp zaailingen werden geanalyseerd binnen het tijdsverloop experimenten. Dit artikel toont de bruikbaarheid van het uitgesneden blad werkwijze voor het meten van snelheden van herbicide metabolisme in een dicotyl onkruid (waterhemp). De resterende hoeveelheid bovenliggende herbicide werd bepaald op elk tijdstip (figuur 1) door niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse, en werd geschikt met een eenvoudige eerste orde curve voor de schatting van de tijd tot 50% van de geabsorbeerde herbicide te breken ( DT 50). Vertegenwoordigerchromatogrammen van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) worden getoond voor ALS-bestendige -gevoelige waterhemp populaties, waarbij de verdwijning van bovenliggende herbicide en gelijktijdige vorming van polaire metabolieten (s) geven gedurende een tijdsverloop studie (figuur 2). De focus van het artikel is het beschrijven en demonstreren van de bruikbaarheid van het uitgesneden blad assay in combinatie met een vegetatieve klonen werkwijze voor het bepalen nauwkeurige en reproduceerbare snelheden van herbicide metabolisme in dicotyle planten, met behulp gelijkmatig ring gemerkt (URL- 14 C) herbiciden waterhemp drie populaties die verschillen in hun hele plant reacties op HPPD- en ALS-remmende herbiciden (tabel 1).

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>voor het voorkiemen van zaden</td></tr><tr><td>Potgrond</td><td>Sun Gro Horticulture</td><td>49040233</td><td>voor plantengroei</td></tr><tr><td>Nutricote</td><td>Agrivert&nbsp;</td><td>TOTAL BLEND 13-13-13 T100</td><td>langzaam vrijkomende meststof</td></tr><tr><td>Kweekkamer E15</td><td>Controlled Environments Limited</td><td>20207</td><td>plantenkweek</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>buffer voor uitgesneden bladeren</td></tr><tr><td>HCl (geconcentreerd)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144500</td><td>pH van buffer aanpassen</td></tr><tr><td>Murashige en Skoog (MS) zouten&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0404</td><td>incubatie van uitgesneden bladeren</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>bladwas na incubatie</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td>plantextracties</td></tr><tr><td>Acetonitril (HPLC-kwaliteit)</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MKH07610</td><td>HPLC mobiele fase</td></tr><tr><td>Forminezuur&nbsp;</td><td>Mallinckrodt Analytical</td><td>MK259205</td><td>mobiele fase pH verzuren</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>1,5 of 2,0 ml buisjes</td></tr><tr><td>Centrifuge (temperatuurgestuurd)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>15 of 50 ml buisjes</td></tr><tr><td>Polypropyleen centrifugebuis</td><td>Corning Inc.</td><td>430790</td><td>15 ml, steriel</td></tr><tr><td>Rotorverdamper</td><td>B&Uuml;CHI</td><td>R200</td><td>concentreer plantenmonsters</td></tr><tr><td>Vloeistof scintillatie spectrometrie (LSS)</td><td>Packard Instruments</td><td>104470</td><td>kwantificeren 14C</td></tr><tr><td>Hogedruk vloeistof chromatografie</td><td>Perkin Elmer</td><td>N2910401</td><td>oplossen herbicide metabolieten</td></tr><tr><td>Flow scintillatie analyzer&nbsp;</td><td>LabLogic System</td><td>1103303</td><td>voor HPLC analyse van 14C</td></tr><tr><td>Hypersil Gold C18 kolom&nbsp;</td><td>Thermo-Scientific</td><td>03-050-522&nbsp;</td><td>omgekeerde fase</td></tr><tr><td>Ultima-Flo M cocktail</td><td>Perkin Elmer</td><td>6013579</td><td>voor flow-scintillatie analyzer</td></tr><tr><td>Scintillatie Cocktail (ScintiVerse BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SX18</td><td>voor LSS; biologisch afbreekbaar</td></tr><tr><td>Laboratorium homogenisator</td><td>Kinematica</td><td>CH-6010&nbsp;</td><td>homogeneer bladmonsters</td></tr></tbody></table>

meten tarieven herbicide metabolisme in dicot onkruid met een weggesneden leaf assay

Measuring Rates of Herbicide Metabolism in Dicot Weeds with an Excised Leaf Assay

Om de snelheid van herbicidemetabolisme in een obligate-uitkruisende tweezaadlobbige onkruid, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), te isoleren en nauwkeurig te bepalen, ontwikkelden we een afgesneden bladtest in combinatie met een vegetatieve kloneringsstrategie om herbicide-opname te normaliseren en translocatie als bijdragende factoren te verwijderen in herbicideresistente (R) en -gevoelige (S) waterhemp-populaties. Biokinetische analyses van organische pesticiden in planten omvatten typisch de bepaling van opname, translocatie (levering aan de doelplaats), metabolisch lot en interacties met de doelplaats. Herbicidemetabolisme is een belangrijke parameter om te meten in herbicideresistente onkruiden en herbicidetolerante gewassen, en wordt meestal uitgevoerd met geheel-planttesten met radioactief gelabelde herbiciden. Echter, een moeilijkheid bij het interpreteren van biokinetische parameters afgeleid van geheel-plantmethoden is dat translocatie vaak wordt beïnvloed door snelheden van herbicidemetabolisme, omdat polaire metabolieten meestal niet mobiel zijn in de plant na herbicidedetoxificatiereacties. Voordelen van het protocol beschreven in dit manuscript omvatten reproduceerbare, nauwkeurige en snelle bepaling van herbicide-afbraaksnelheden in R en S populaties, een aanzienlijke vermindering van de hoeveelheid radioactief gelabelde herbiciden die wordt geconsumeerd, een grote vermindering van radioactief gelabelde plantmaterialen die verdere behandeling en verwijdering vereisen, en de mogelijkheid om radioactief gelabelde herbicide-experimenten in het lab of groeikamerraam uit te voeren in plaats van een kas. Aangezien herbicideresistentie zich blijft ontwikkelen en verspreiden in tweezaadlobbige onkruidpopulaties wereldwijd, zal de afgesneden bladtestmethode die hierin wordt ontwikkeld en beschreven, een onschatbare techniek bieden voor het onderzoeken van niet-doelplaatsgebaseerde resistentie als gevolg van verhoogde snelheden van herbicidemetabolisme en detoxificatie.

Grote verschillen in snelheden van mesotrione metabolisme gedetecteerd tussen een WCS en ACR en MCR (figuur 1). Op elk tijdstip was MCR mesotrione sneller dan de twee mesotrione gevoelige populaties, WCS en ACR, correleert met eerdere hele plant fenotypische respons 11 gemetaboliseerd. Door klonen genoeg planten uit een enkele ouderplant van elke populatie, herbicide metabolisme tijdsverloop analyses uniform en reproduceerbaar door het ontbreken van de genetische variatie binnen elke tijdsver...

Dit manuscript beschrijft hoe herbicidemetabolismesnelheden effectief kunnen worden gekwantificeerd met uitgesneden bladeren van een tweezaadlobbig onkruid, waardoor variabiliteit wordt verminderd en alle mogelijke verstorende effecten van herbicideopname of -translocatie, die typisch worden waargenomen in hele-plantassays, worden geëlimineerd.

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we ...

Het algemene doel van deze procedure is om het herbicide-metabolisme in een dichot onkruid te meten met behulp van een assay met uitgesneden bladeren. Dit wordt bereikt door eerst populaties van waterhemp in de kas en groeikamer te planten en te klonen. De tweede stap is om uitgesneden waterhempbladeren te incuberen met radiogemarkeerd herbicide en een tijdreeksstudie uit te voeren.Vervolgens worden het herbicide en de metabolieten ervan geëxtraheerd uit de geïncubeerde bladeren. De laatste stap is de analyse van het herbicide en de metabolieten via reversed-phase hogedrukvloeistofchromatografie. Uiteindelijk wordt deze assay met uitgesneden bladeren gebruikt om nauwkeurige snelheden van herbicidemetabolisme in verschillende onkruidpopulaties of soorten te bepalen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek of bestaande methoden, zoals het aanbrengen van radioactief gelabelde herbicide op bladeren of de hele plant, is dat genetisch identieke of harms zaailingen worden geanalyseerd in onafhankelijke translocaties of translocaties van de hele plant. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de plantbiochemie, zoals het bepalen van herbicide-resisten

measuring-rates-herbicide-metabolism-dicot-weeds-with-an-excised-leaf

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

We beschrijven een relatief snelle (30 min.) en realistische methode voor het gelijktijdig meten van blad hydraulische geleidbaarheid...

Meting van de Leaf Hydraulische geleiding en stomatale geleidbaarheid en hun reacties op Irradiance en uitdroging Met behulp van de adiabatische Flux Methode (EFM)

In this video, we demonstrate a screening assay to identify the efficacy of small-molecule nematicides against nematodes. Nematicides are considered effective if they cause a decrease in the number of mobile nematodes in the sample after exposure.

Small Molecule Nematicides Screening Assay: A Medium Throughput Method to Screen Potential Nematicides Against Ditylenchus dipsaci

Een robuuste en flexibele aanpak om herbicideresistentie in onkruidpopulaties te bevestigen wordt gepresenteerd. Dit protocol maakt het mogelijk om de niveaus van herbicideresistentie te bepalen en toe te passen op een breed scala aan onkruidsoorten en herbiciden met kleine aanpassingen.

Protocollen voor Robuuste herbicideresistentie testen in verschillende Weed Species

Kwantificering van ziekteverwekkergroei is een krachtig hulpmiddel om verschillende Arabidopsis thaliana (hierna: Arabidopsis) immuunresponsen te karakteriseren. De hier beschreven methode presenteert een geoptimaliseerde spuitinfiltratie-assay om de groei van Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 in volwassen Arabidopsis-bladeren te kwantificeren.

Bacteriële Leaf Infiltratie Assay voor Beeldende karakterisatie van Plant Defense Reacties met behulp van de<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Spectrometrie van de massa van de spray blad is een directe analyse van de chemische techniek die minimaliseert de bereiding van de monsters en elimineert chromatografie, rekening houdend met de snelle detectie van kleine moleculen uit plantaardige weefsels.

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

De gepresenteerde methode creëert natuurlijke herbivoor beschadigd plantenweefsel door de toepassing van Manduca sexta larven op losgeraakte bladeren van aardappel. Het plantenweefsel wordt onderzocht voor de uitdrukking van zes transcriptiefactor homologs die betrokken zijn bij vroege reacties op insecten herbivory.

Vrijstaande blad testen voor het vereenvoudigen van genexpressie studies in aardappel tijdens besmetting door kauwen insect Manduca sexta

Dit werk presenteert een protocol voor de oprichting van een cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) bladeren die kunnen worden gebruikt om het metabolisme van de externe verbindingen die kunnen worden opgenomen door de hele plant, zoals insecticiden studie.

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

Dit protocol beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor de identificatie van 2,4-dibroomfenolmetabolieten in planten.

Opheldering van het metabolisme van 2,4-dibroomfenol in planten

Het protocol beschrijft een nieuwe methode om de integrale cytotoxiciteit van metabolieten van triazolpesticiden in planten te beoordelen.

Beoordeling van cytotoxiciteit van metabolieten van typische triazolpesticiden in planten

Dit protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het evalueren van plantionenlekkage, peroxidaseactiviteit en calloseproductie in hetzelfde monster.

Evaluatie van bladreacties op microbiële secundaire metabolieten met behulp van een high-throughput formaat

Leer herbicide-metabolisme meten in dicot onkruid via een weggesneden bladassay. Deze methode vermindert variabiliteit en elimineert storende factoren voor nauwkeurige resultaten.

Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

Meer video's verkennen