Name: Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer hoe quorum-quenching lactonases pathogene biofilms van A.baumannii S1 effectief verstoren zonder resistentie. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor anti-bacteriële therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het Academic Research Fund van het Ministerie van Onderwijs, en de National Medical Research Council en de National Research Foundation, Singapore.

1. Crystal Violet kwantificering van Biofilm Formation in A. baumannii S1 <ol><li> Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 lysogenie bouillon (LB) (trypton 10 g / l, gistextract 5 g / l) bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur. </li><li> Pas de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD 600 van 0,8. Met behulp van een 96-wells plaat, beënt de bacteriecultuur (1: 100 verdunning) in vers LB dat 10 ui gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 100 pl. </li><li> Bereid een controle cultuur als goed; Deze ontvangt geen enzymen bevatten. Herhaal vergelijkbare omstandigheden om het gewenste aantal herhalingen opleveren. </li><li> Bedek de plaat met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L kunststoffles. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media. </li><li> Voeg nog 100 ul vers LB-medium tot het putje en incubeer de plaat gedurende 21 uur bij 30 ° C. </li&gt; <li> Na de tweede periode van incubatie, verwijder voorzichtig alle media. Was de planktonische bacteriën cel met 200 pi steriel water. Zorg ervoor dat er slechts een minimale verstoring van de cellen tijdens het wassen. </li><li> Voeg 100 ul van 1% kristalviolet oplossing in elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kristalvioletoplossing door het behandelde goed met 200 ul steriel water. Herhaal het wassen voor nog twee keer. </li><li> Voeg 100 ui 33% azijnzuur aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten onder zacht schudden; Dit zal de kleurstof oplossen. </li><li> Kwantificeren van de hoeveelheid biofilm gevormd door de absorptie van kristalviolet bij 600 nm. De hoeveelheid kristalviolet evenredig met de hoeveelheid biofilm gevormd. </li></ol> 2. confocale laser scanning microscopie van A. baumannii S1 Biofilm <ol><li> Groeien een cultuur 5 ml van A. baumannii S1 in LB bij 30 ° C in een schudincubator (220 rpm) gedurende 16 uur. </li><li> Advertentiealleen de cultuur van A. baumannii S1 een gewenste OD 600 van 0,8. Met behulp van een 35 mm glazen bodem μ-schotel, te enten van de bacteriën cultuur (1: 100 verdunning) in de frisse LB met 30 ul van gezuiverd GKL enzym (40 mg / ml); uiteindelijke volume van de nieuwe cultuur is 1 ml. </li><li> Bedek de μ-schotel met een deksel en plaats het in een afgesloten 10 L plastic container. Incubeer de μ-schotel bij 30 ° C gedurende 3 uur voordat voorzichtig verwijderen van de media. Voeg 30 ul van gezuiverd GKL enzym en vers medium, waardoor deze tot een totaal volume van 1 ml. Incubeer nog eens 21 uur bij 30 ° C. </li><li> Herhaal stap 2,3 en incubeer de μ-schotel nog eens 24 uur bij 30 ° C. Verwijder vervolgens de media voorzichtig. </li><li> Voeg 500 ul van 5 ug / ml Alex Fluor 488-geconjugeerd tarwekiem agglutinine (WGA) opgelost in Hank&#39;s gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) aan de μ-schotel en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; Dit zal het gevormde biofilm vlek. Verwijder de kleuroplossing en wassen thij u-schotel met 2 ml HBSS. Herhaal de wasstap nog een keer. </li><li> Voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde opgelost in HBSS en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min; dit zal de biofilm op de μ-Dish lossen. Was de μ-schotel eenmaal met 2 ml HBSS en volledig verwijder de oplossing. De μ-schotel met biofilm vastgesteld kan worden bewaard in het donker bij 4 ° C voorafgaand aan CLSM beeldvorming. </li><li> Voor CLSM beeldvorming en analyse gebruikt 63 keer vergroot tot 97 stapels per beeld te genereren met een interval van 0,21 micrometer per stapel. </li></ol>

<ol><li>Alanis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+antibiotics%3A+are+we+in+the+post-antibiotic+era%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+medical+research%22%5BJournal%5D)">Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era?</a> Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).</li>
<li>Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+future+prospects+of+antivirulence+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biology and future prospects of antivirulence therapies.</a> Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).</li>
<li>LaSarre, B., Federle, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+quorum+sensing+to+confuse+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+molecular+biology+reviews+%3A+MMBR%22%5BJournal%5D)">Exploiting quorum sensing to confuse bacterial pathogens.</a> Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 77, 73-111 (2013).</li>
<li>Waters, C. M., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing%3A+cell-to-cell+communication+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 21, 319-346 (2005).</li>
<li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature reviews. Drug discovery. 9, 117-128 (2010).</li>
<li>Lazar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum+sensing+in+biofilms--how+to+destroy+the+bacterial+citadels+or+their+cohesion%2Fpower%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Quorum sensing in biofilms--how to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?</a> Anaerobe. 17, 280-285 (2011).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Perez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+challenge+of+multidrug-resistant+Acinetobacter+baumannii%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Global challenge of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51, 3471-3484 (2007).</li>
<li>Tay, S. B., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+quorum-based+anti-virulence+therapeutics+targeting+Gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+molecular+sciences%22%5BJournal%5D)">Development of quorum-based anti-virulence therapeutics targeting Gram-negative bacterial pathogens.</a> International journal of molecular sciences. 14, 16570-16599 (2013).</li>
<li>Igarashi, J., Suga, H. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aIgarashi%2C+J+%22Quorum+Sensing%22">Quorum Sensing</a>. Rumbaugh, K. P. 692, Methods in Molecular Biology. Humana Press. 265-274 (2011).</li>
<li>Ng, F. S., Wright, D. M., Seah, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+phosphotriesterase-like+lactonase+from+Sulfolobus+solfataricus+and+its+immobilization+for+disruption+of+quorum+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a phosphotriesterase-like lactonase from Sulfolobus solfataricus and its immobilization for disruption of quorum sensing.</a> Applied and environmental microbiology. 77, 1181-1186 (2011).</li>
<li>Stacy, D. M., Welsh, M. A., Rather, P. N., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+quorum+sensing+in+the+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+non-native+N-Acyl+homoserine+lactones%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation of quorum sensing in the pathogen Acinetobacter baumannii using non-native N-Acyl homoserine lactones.</a> ACS chemical biology. 7, 1719-1728 (2012).</li>
<li>Chow, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+a+thermostable+quorum-quenching+lactonase+from+the+amidohydrolase+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of a thermostable quorum-quenching lactonase from the amidohydrolase superfamily.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 40911-40920 (2010).</li>
<li>Chow, J. Y., Yang, Y., Tay, S. B., Chua, K. L., Yew, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+biofilm+formation+by+the+human+pathogen+Acinetobacter+baumannii+using+engineered+quorum-quenching+lactonases%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Disruption of biofilm formation by the human pathogen Acinetobacter baumannii using engineered quorum-quenching lactonases.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58, 1802-1805 (2014).</li>
<li>Pour, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+Acinetobacter+baumannii+strains+isolated+from+urinary+tract+infection+and+urinary+catheters%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+immunology+and+medical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by Acinetobacter baumannii strains isolated from urinary tract infection and urinary catheters.</a> FEMS immunology and medical microbiology. 62, 328-338 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

In beide reeksen experiment A. baumannii S1 werd gekweekt in LB-medium zonder NaCl als een hoge zoutconcentratie kan de hoeveelheid biofilm gevormd door de bacteriën 15 te verminderen. De aanwezigheid van dergelijke artefact zou de hoeveelheid biofilm gevormd, evenals de effecten van quorum quenching enzymen in verschillende behandelingsomstandigheden onderschat. Het gebruik van een katalytisch inactieve enzym belangrijk als een negatieve controle de mogelijke effecten enzym sekwestratie elimineren. ...

Behandelingsopties voor infectieziekten zijn gecompliceerd door de snelle toename van multiresistente bacteriën die immuun zijn voor een breed scala van antibiotica 1 zijn. Met een hoge morbiditeit en mortaliteit van resistente bacteriën veroorzaakte infecties, bestaat er behoefte aan de ontwikkeling van geneesmiddelen processen escaleren en / of zoeken naar betere anti-bacteriële alternatieven voor therapeutische opties te verbeteren. De laatste tijd is de anti-virulentie benadering wint belang gezien de mogelijkheden in het voorkomen van virulentie via niet-bacteriedodende methoden, vandaar het verminderen van de risico&#39;s van resistentie mechanismen 2. Quorum-sensing is een &#39;hoofdschakelaar&#39; in bacteriële virulentie en verstoring van deze signalering fenomeen is een veelbelovende anti-virulentie methode tegen pathogenese 3. Het begin van virulentie vereist de accumulatie van quorum moleculen in de extracellulaire omgeving na een kritische bacteriepopulatie dichtheid wordt bereikt. Zoals quorum diffunderen terug in de intracellulaire matrix binden aan hun verwante receptors leidt tot de activering van virulentiefactoren en genen geassocieerd met resistentie tegen antibiotica en biofilmvorming 4. In het algemeen, quorum-sensing verstoring gaat remmen quorum molecuul en receptor interactie zonder dat primaire metabole routes. Daarom heeft het geen directe implicaties voor cellulaire groei. Omdat geschiktheid niet wordt aangetast, er minimale selectiedruk bacteriën evolueren en weerstand tegen dergelijke behandelingen 5 krijgen. Bovendien kunnen quorum-sensing verstoring verstoren inherent bacteriële beschermingsmechanismen zoals bij biofilmvorming, die bescherming tegen antibacteriële middelen verschaft en gastheer immuunreacties. Geschat wordt dat 99% van de microben op aarde bestaat in complexe biofilm-achtige matrices, verleent cruciaal overleving voordelen voor de micro-organismen die binnen these structuren 6. Belangrijker vorming van deze sessiele domeinen is de oorzaak van de meeste hardnekkige en chronische ziekenhuisinfecties 7. Acinetobacter baumannii is een van de belangrijkste menselijke pathogenen die verband houden met globale ziekenhuisinfecties en de virulentie is grotendeels toegeschreven aan quorum-sensing gemedieerde biofilmvorming 8. Quorum-quenching enzymen zijn met succes gebruikt bij het ​​verstoren van quorum-gemedieerde signaaltransductie door zich te richten een groep van verbindingen bekend als N-acyl homoserine lactonen (AHL&#39;s) die worden gevormd door Gram-negatieve bacteriën 9. Verschillende studies hebben ook uitgebreid op het gebruik van deze enzymen om bacteriële pathogenese te blokkeren door de vermindering van virulentiefactor expressie en celaantallen in biofilms 10,11. Helaas blijft er een gebrek aan tastbare demonstratie van het effectieve gebruik van quorum quenching enzymen tegen biofilmvorming door bacteriële pathogenen. Dere pogingen om quorum remmers (AHL-analoga), in plaats van quorum-quenching enzymen, A. verstoren geweest baumannii biofilmvorming 12. Hoewel deze methode van het gebruik van kleine moleculen remmers is een geldig aanpak, het behoud van de biologische beschikbaarheid in translationeel toepassingen kan een uitdaging zijn. Daarentegen kan het gebruik van katalytische-quorum quenching enzymen de biobeschikbaarheid probleem omzeilen enzymen ontvankelijker richting immobilisatie op oppervlakken van biomedische inrichtingen voor therapeutische effecten. Hier beschrijven we een beoordeling van de effecten van gemanipuleerde-quorum blussen lactonases van Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 op bacteriële biofilmvorming, met behulp van kristalviolet kleuring en confocale laser scanning microscopie (CLSM). Deze studie is de eerste succesvolle demonstratie van biofilm verstoring in een klinisch relevante A. baumannii S1 stam met behulp van quorum-blussen enzymen. De werkwijzen beschrevenin deze studie zijn bruikbaar voor het beoordelen van de werkzaamheid van andere quorum quenching enzymen in latere therapeutische ontwikkelingsinspanningen tegen pathogene Gram-negatieve bacteriën.

<table><tbody><tr><td>Tryptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Costar</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Violet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6158</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Lab-Scan</td><td>PLA00654X</td><td>Let op: Ontvlambaar</td></tr><tr><td>&mu;-Dish</td><td>Ibidi</td><td>80136</td><td></td></tr><tr><td>Alex Fluo 488-conjugated WGA</td><td>Invitrogen</td><td>W11261</td><td></td></tr><tr><td>Hank&rsquo;s balanced salt solution&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>141475095</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Let op: Corrosief&nbsp;</td></tr><tr><td>Synergy HT Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X-81 Inverted Fluorescence Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

anti-virulente verstoring van pathogene biofilms met engineered quorum-blussen lactonases

Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases

De snelle opkomst van multi-resistente bacteriën heeft de noodzaak versneld voor nieuwe therapeutische benaderingen om levensbedreigende infecties te bestrijden. De aanhoudendheid van bacteriële infecties wordt vaak geassocieerd met quorum-sensing-gemedieerde biofilmvorming. Daarom vormt de verstoring van dit signaalcircuit een aantrekkelijke anti-virulentiestrategie. Het is gemeld dat quorum-quenching lactonasen effectieve verstoorders zijn van quorum-sensing circuits. Er zijn echter zeer weinig meldingen geweest van het effectieve gebruik van deze enzymen bij het verstoren van bacteriële biofilmvorming. Dit protocol beschrijft een methode om biofilmvorming in een klinisch relevante A. baumannii S1-stam te verstoren door het gebruik van een geëngineerde quorum-quenching lactonase. Acinetobacter baumannii is een belangrijke humane pathogeen die wereldwijd betrokken is bij ernstige ziekenhuisinfecties en de virulentie ervan wordt voornamelijk toegeschreven aan de vasthoudendheid van zijn biofilm. De behandeling met de geëngineerde lactonase bereikte een significante reductie van A. baumannii S1 biofilm. Deze studie toonde ook de mogelijkheid aan om geëngineerde quorum-quenching enzymen te gebruiken bij de toekomstige behandeling van door biofilm gemedieerde bacteriële ziekten. Ten slotte kan de methode worden gebruikt om de competentie van veelbelovende quorum-quenching enzymen te evalueren.

In het kristal violet kwantificering experiment werden twee quorum-blussen enzymen die worden gebruikt om de haalbaarheid aan te tonen in het verstoren van biofilmvorming: wild-type GKL en een verbeterde GKL dubbele mutant (E101G / R230C). Beide enzymen bleken lactonase-activiteit vertonen tegen 3-hydroxy-decanoyl-L-homoserinelacton (3-OH-C 10 -HSL), grote quorum molecuul gebruikt door A. baumannii S1 14. Voor geldige beoordeling van de biofilm verstoring, ...

Quorum-quenching enzymen zijn anti-virulente en antibacteriële opties die pathogenese kunnen verminderen zonder het risico op resistentie, door het voorkomen van de expressie van virulentiefactoren en genen die geassocieerd zijn met antibioticaresistentie en biofilmvorming. In deze studie rapporteren we een methode die de werkzaamheid van quorum-quenching enzymen bij het onderbreken van bacteriële biofilms aantoont.

Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases

The rapid emergence of multi-drug resistant bacteria has accelerated the need for novel therapeutic approaches to counter life-threatening infections. The ...

Het algemene doel van dit experiment is om de effectiviteit van quorum-quenching enzymen bij de disruptie van bacteriële biofilms aan te tonen. Deze methode zal helpen om kernvragen op het gebied van antibacteriële therapeutica te beantwoorden en om het effect van quorum-quenching lactonasen op pathogene bacteriën binnen een biofilmomgeving te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat quorum-quenching lactonasen direct kunnen worden toegevoegd in een in vitro omgeving.Hierdoor is het effect op de disruptie van de biofilm eenvoudig te kwantificeren. Deze procedure wordt gedemonstreerd door Terrence Tay, een technicus in ons laboratorium. Begin met het kweken van een cultuur van 5 mililiter A.baumannii S1 in LB bij 30 °C in een schuddende incubator gedurende 16 uur.Pas de cultuur aan tot een OD 600 van 0,8. Gebruik vervolgens vers LB met 4 mg/mL gezuiverd GKL-enzym om de cultuur 1:100 te verdunnen. Voeg vervolgens 100 µL toe aan de wells van een 96-wells plaat.Gebruik de deksels om de platen af te dekken en plaats deze in een plastic container van 10 liter. Sluit de container af en incubeer deze drie uur lang bij 30 °C, voordat het medium voorzichtig wordt verwijderd. Voeg opnieuw 100 µL vers LB-medium toe aan de wells en incubeer de plaat 21 uur lang bij 30 °C.Nadat het medium voorzichtig is verwijderd, worden de planktonische bacteriële cellen voorzichtig gewassen met 200 µL steriel water. Plaats de pipetpunt op de bodem van de well en verwijder het vloeibare medium voorzichtig om minimale verstoringen van de biofilm tussen de lucht- en vloeistofinterface te garanderen. Voeg vervolgens 100 µL van een 1% kristalviolet-oplossing toe aan elke well en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de kristalvioletoplossing door de wells drie keer te wassen met 200 µL steriel water. Voeg 100 µL 33% azijnzuur toe aan elke well en incubeer 15 minuten onder zachte schudding om de kleurstof op te lossen. Kwantificeer de hoeveelheid biofilm door de absorbentie van kristalviolet te meten bij 600 nm.De hoeveelheid kristalviolet is proportioneel aan de hoeveelheid gevormde biofilm. Om confocale laserscanmicroscopie, of CLSM, uit te voeren op A.baumannii S1-biofilms, wordt een cultuur van 5 mL A.baumannii S1 gekweekt in LB bij 30 °C in een schudincubator gedurende 16 uur. Pas de cultuur van A.baumannii S1 aan tot een OD 600 van 0,8.Gebruik vervolgens vers LB met 1,2 mg/mL gezuiverd GKL-enzym om de cultuur 1:100 te verdunnen en voeg één ml toe aan een glazen microdish met een bodem van 35 ml. Dek de microdish af met een deksel, plaats deze in een plastic container van 10 liter en sluit deze af voordat de dish gedurende drie uur wordt geïncubeerd bij 30 °C. Verwijder vervolgens voorzichtig het medium en voeg één ml vers medium toe dat 30 µL gezuiverd GKL-enzym bevat, waarna er opnieuw gedurende 21 uur wordt geïncubeerd bij 30 °C.Verwijder voorzichtig voor een tweede maal het medium en vervang dit door nog één milliliter GKL-enzym in vers medium. Incubeer 24 uur bij 30 °C. Verwijder na de incubatie voorzichtig het medium en voeg 500 µL toe van 5 µg/mL Alexa Fluor 488-geconjugeerd tarwekiemagglutinine opgelost in HBSS.Incubeer de microdish gedurende 30 minuten bij 37 °C om de biofilms te kleuren. Om de biofilms te fixeren, voegt u 500 µL 3,7% formaldehyde opgelost in HBSS toe en incubeert u dit gedurende 30 minuten bij 37 °C. Was de microdish eenmaal met 2 mL HBSS en verwijder vervolgens de oplossing volledig.Bewaar de schaal in het donker bij vier graden Celsius voorafgaand aan CLSM-beeldvorming. Gebruik voor CLSM-beeldvorming en analyse een 63X objectief om 97 stacks per afbeelding te genereren met een interval van 0,21 microns per stack. In het experiment voor de kwantificering van kristalviolet werden Wild-type GKL en een verbeterd GKL dubbel-mutant quorum-quenching enzym gebruikt voor de lactonase-activiteit tegen drie hydroxydecanoyl l homoserine lacton of 3OHC10HSL, het belangrijkste quorum-molecuul dat wordt gebruikt door A.baumanii S1. Zoals hier wordt getoond, waren beide enzymen in staat om de biofilmvorming in vooraf behandelde Wild-type A.baumanii S1 significant te verminderen. De mate van biofilmverstoring door beide enzymen is niet proportioneel aan hun effectiviteit tegen 3OHC10HSL.Zoals in deze tabel te zien is, is de turnoverrate van de gemuteerde GKL zes keer hoger dan die van Wild-type GKL tegen 3OHC10HSL. Het verschil in de mate van biofilmdisruptie tussen de enzymen is echter slechts tweevoudig. In dit experiment werden het verbeterde GKL-mutantenzym en het bijbehorende catecholy-inactieve enzym gebruikt voor vergelijking.Deze DIC-afbeelding laat zien dat behandeling met het verbeterde GKL-mutante enzym resulteerde in een afname van de biofilmgrootte vergeleken met het inactieve enzym. Analyse van de fluorescentiebeelden onthulde tevens dat er een afname was in het oppervlak, de biomassa en de gemiddelde dikte van de biofilms bij behandeling met het verbeterde GKL-mutante enzym. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier uur worden uitgevoerd, exclusief de incubatietijd, mits deze correct wordt uitgevoerd.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat het verwijderen en verstoren van de biofilm tijdens de wastappen tot een minimum moet worden beperkt. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals celtelling en enzymstabiliteitsassays, worden uitgevoerd. Dit zal aanvullende vragen beantwoorden, zoals de effecten van quorum-quenching lactonases op de celpopulatie binnen de biofilm, evenals hun werkingsduur.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van de behandeling van infectieziekten om de effecten van potentiële quorum-quenching lactonases in de biofilm die door pathogene bacteriën wordt geproduceerd, te onderzoeken. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de disruptie van de biofilm kunt kwantificeren met kristalvioletkleuring, en hoe u morfologische veranderingen in de biofilm kunt beoordelen met confocale beeldvorming. Vergeet niet dat het werken met pathogeen materiaal uiterst gevaarlijk kan zijn.Bij het uitvoeren van deze procedure moeten altijd voorzorgsmaatregelen worden genomen, zoals het gebruik van geschikte faciliteiten voor biologische risicobeheersing.

anti-virulent-disruption-pathogenic-biofilms-using-engineered-quorum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Tay, S. B., et al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)The video demonstrates a method to quantify biofilm biomass in a pathogenic bacterium, comparing untreated controls with samples treated with a quorum-quenching enzyme. The enzyme disrupts bacterial signaling during early incubation, reducing cell adhesion. After washing and further incubation, control wells form dense biofilms, while treated wells show...

Quantifying Enzyme-Induced Biofilm Suppression in Pathogenic Bacteria

Source: Tay, S. B., et.al. Anti-virulent Disruption of Pathogenic Biofilms using Engineered Quorum-quenching Lactonases. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of inhibiting biofilm formation by introducing an enzyme that disrupts bacterial cell signaling. The enzyme prevents the bacteria from producing extracellular polymeric substances, thereby reducing biofilm development on a glass-bottomed microdish. Finally, the biofilm structure is visualized using fluorescent lectins and...

Microscopic Assessment of Enzyme-Mediated Inhibition of Biofilm Formation

Deze studie presenteert de ontwikkeling van reproduceerbare methodologieën om biofilmremmers en hun effecten op Bacillus subtilis multicellulariteit te bestuderen.

Methodologieën voor het bestuderen<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms als een model voor het karakteriseren van Small Molecule biofilminhibitoren

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Door antimicrobiële stoffen geïnduceerde veranderingen in de biofilmarchitectuur van Pseudomonas aeruginosa verschillen tussen klinische isolaten die zijn gekweekt van patiënten met cystische fibrose en chronische longinfectie. Na confocale microscopie kan COMSTAT-software worden gebruikt om variaties in biofilmarchitectuur (bijv. oppervlakte, dikte, biomassa) voor individuele isolaten te kwantificeren om de werkzaamheid van anti-infectiemiddelen te beoordelen.

Kwantificering van de effecten van antimicrobiële stoffen op in vitro biofilmarchitectuur met behulp van COMSTAT-software

Dit protocol presenteert methodologie om biofilmgroei- en biomassametingen uit te voeren met behulp van zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met diepe put voor statische biofilmscreening met hoge doorvoer en 96-well gekoppelde deksels.

Generatie van grotere bacteriële biofilmbiomassa met behulp van PCR-Plate Deep Well Microplate-apparaten

Dit protocol beschrijft een aanpak die statische en dynamische methoden combineert om de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van biofilms in de zuivelindustrie te evalueren. Deze aanpak kan ook worden gebruikt om de effectiviteit van nieuwe biologische of chemische formuleringen voor de bestrijding van biofilms te testen.

Evaluatie van de werkzaamheid van organische peroxyzuren voor het uitroeien van zuivelbiofilms met behulp van een aanpak die statische en dynamische methoden combineert

Thiofeensulfonamideverbindingen zijn krachtige en specifieke remmers van Vibrio quorum sensing regulatoren LuxR/HapR die hun activiteit in vivo blokkeren, waardoor transcriptie van genen voor virulentie, beweeglijkheid en biofilms wordt voorkomen. Dit protocol beschrijft hoe deze verbindingen worden gesynthetiseerd, gemodelleerd in silico en in vivo worden getest op activiteit tegen LuxR/HapR.

Synthese en bepaling van Vibrio quorum sensing-remmers

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van de productie van violaceïne door Chromobacterium violaceum ATCC 12472 als een proxy voor het beoordelen van quorum sensing-remming door bioactieve stoffen.

Kwantificering van violaceïne in Chromobacterium violaceum en de remming ervan door bioactieve stoffen

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere...

Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Leer hoe quorum-quenching lactonases pathogene biofilms van A.baumannii S1 effectief verstoren zonder resistentie. Deze methode biedt nieuwe mogelijkheden voor anti-bacteriële therapieën.

Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases

Meer video's verkennen