Anti-virulente Verstoring van pathogene biofilms met Engineered Quorum-blussen Lactonases
1 januari 2016
Quorum-quenching enzymen zijn anti-virulente en antibacteriële opties die pathogenese kunnen verminderen zonder het risico op resistentie, door het voorkomen van de expressie van virulentiefactoren en genen die geassocieerd zijn met antibioticaresistentie en biofilmvorming. In deze studie rapporteren we een methode die de werkzaamheid van quorum-quenching enzymen bij het onderbreken van bacteriële biofilms aantoont.
Het algemene doel van dit experiment is om de werkzaamheid van quorum-quenching enzymen bij het verstoren van bacteriële biofilms aan te tonen. Deze methode zal helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van antibacteriële therapieën, en om het effect van quorum-quenching lactonasen op pathogene bacteriën binnen een biofilm-omgeving te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat quorum-quenching lactonasen direct kunnen worden toegevoegd in een in vitro-omgeving.
Dus, het effect ervan op biofilm-verstoring kan gemakkelijk worden gekwantificeerd. Het demonstreren van deze procedure is Terrence Tay, een technicus in ons lab. Om te beginnen, kweek een 5 milliliter cultuur van A.baumannii S1 in LB bij 30 graden Celsius in een schuddende incubator gedurende 16 uur.
Pas de cultuur aan tot een OD 600 van 0,8. Gebruik vervolgens vers LB met 4 milligram per milliliter gezuiverde GKL-enzym om de cultuur te verdunnen tot een verhouding van 1 tot 100. En voeg 100 microliter toe aan de putjes van een 96-putjesplaat.
Gebruik de deksels om de platen te bedekken en plaats ze in een 10 liter plastic container. Sluit de container en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende drie uur, voordat het medium voorzichtig wordt verwijderd. Voeg nogmaals 100 microliter vers LB-medium toe aan de putjes en incubeer de plaat bij 30 graden Celsius gedurende 21 uur.
Na het voorzichtig verwijderen van het medium, gebruik 200 microliter steriel water om de planktonische bacteriecellen voorzichtig te wassen. Plaats de pipettentip op de bodem van de put en verwijder voorzichtig het vloeibare medium om minimale verstoringen in de biofilm te garanderen tussen het lucht- en vloeistofvlak. Voeg vervolgens 100 microliter 1% kristallen violet oplossing toe aan elke put en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
Verwijder de kristallen violet oplossing door 200 microliter steriel water te gebruiken om de putjes drie keer te wassen. Voeg 100 microliter 33% azijnzuur toe aan elke put en incubeer met zacht schudden gedurende 15 minuten om de kleurstof op te lossen. Kwantificeer de hoeveelheid biofilm door de absorptie van kristallen violet te meten bij 600 nanometer.
De hoeveelheid kristallen violet is evenredig aan de hoeveelheid gevormde biofilm. Om confocale laserscanningmicroscopie, of CLSM, van A.baumannii S1 biofilms uit te voeren, kweek een vijf milliliter cultuur van A.baumannii S1 in LB bij 30 graden Celsius in een schuddende incubator gedurende 16 uur. Pas de cultuur van A.baumannii S1 aan tot een OD 600 van 0,8.
Gebruik vervolgens vers LB met 1,2 milligram per milliliter gezuiverde GKL-enzym om de cultuur te verdunnen, één tot 100, en voeg één milliliter toe aan een 35 milliliter glazen bodem microschaal. Bedek de microschaal met een deksel en plaats deze in een 10 liter plastic container en sluit deze voordat de schaal wordt geïncubeerd bij 30 graden Celsius gedurende drie uur. Na het voorzichtig verwijderen van het medium, voeg één milliliter vers medium toe dat 30 microliter gezuiverde GKL-enzym bevat, en incubeer vervolgens bij 30 graden Celsius gedurende nog eens 21 uur.
Verwijder het medium een tweede keer voorzichtig en vervang het door nog eens één milliliter GKL-enzym in vers medium. Incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur. Na de incubatie, verwijder voorzichtig het medium en voeg 500 microliter van vijf microgram per milliliter Alexa Fluor 488 geconjugeerd tarwegommaggglutinine toe, opgelost in HBSS.
Incubeer de microschaal bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten om de biofilms te kleuren. Om de biofilms te fixeren, voeg 500 microliter 3,7% formaldehyde toe, opgelost in HBSS, en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten. Gebruik twee milliliter HBSS om de microschaal eenmaal te wassen en verwijder vervolgens de oplossing volledig.
Bewaar de schaal in het donker bij vier graden Celsius voorafgaand aan CLSM-beeldvorming. Voor CLSM-beeldvorming en analyse, gebruik een 63X objectief om 97 stapels per afbeelding te genereren met een interval van 0,21 micron per stapel. In het kristalviolet kwantitatieve experiment werden Wild-type GKL en een verbeterde GKL dubbele mutant quorum-quenching enzym gebruikt voor lactonase activiteit tegen drie hydroxydecanoyle l homoserine lacton of 3OHC10HSL, de belangrijkste quorum molecuul gebruikt door A.baumanii S1. Zoals hier getoond, waren beide enzymen in staat om de biofilmvorming in voorbehandelde Wild-type A.baumanii S1 aanzienlijk te verminderen. De mate van biofilmverstoring door beide enzymen is niet evenredig aan hun werkzaamheid tegen 3OHC10HSL.
Zoals te zien in deze tabel, is de omzetsnelheid van de mutant GKL zes keer sneller dan Wild-type GKL tegen 3OHC10HSL. Echter, het verschil in de mate van biofilmverstoring tussen de enzymen is slechts twee keer. In dit experiment werden de verbeterde GKL mutant enzym en zijn catecholy inactieve enzym gebruikt voor vergelijking.
Deze DIC-afbeelding toont dat behandeling met het verbeterde GKL mutant enzym resulteerde in een afname van de biofilmgrootte vergeleken met het inactieve enzym. Analyse van de fluorescentie afbeeldingen onthulde ook dat er een vermindering was in oppervlakte, biomassa en gemiddelde dikte van biofilms, wanneer behandeld met het verbeterde GKL mutant enzym. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier uur worden uitgevoerd, exclusief incubatietijd, als deze correct wordt uitgevoerd.
Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om te onthouden om de verwijdering en verstoring van de biofilm tijdens de wasstappen te minimaliseren. Na dit proces kunnen andere methoden zoals celtelling en enzymstabiliteitsassays worden uitgevoerd. Dit zal aanvullende vragen beantwoorden zoals de effecten van quorum-quenching lactonasen op de celpopulatie binnen de biofilm evenals hun duur van werking.
Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft dit de weg ge
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie demonstreert de effectiviteit van quorum-quenching enzymen bij het verstoren van bacteriële biofilms. Deze enzymen fungeren als anti-virulentiemiddelen die de pathogenese verminderen zonder het risico op resistentie.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Biotechnologie
- Infectieziekten
Achtergrond
- Quorum-quenching enzymen kunnen de expressie van virulentiefactoren voorkomen.
- Ze zijn effectief tegen antibioticaresistentie en biofilmvorming.
- Inzicht in hun rol kan antibacteriële therapieën verbeteren.
- Deze studie richt zich op hun toepassing in een in vitro omgeving.
Doel van de studie
- Om de effectiviteit van quorum-quenching-enzymen bij de afbraak van biofilms te evalueren.
- Om hun potentieel bij de bestrijding van pathogene bacteriën te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen in antibacteriële therapeutische strategieën.
Gebruikte methoden
- Kweek van A.baumannii S1 in LB-medium bij 30 °C.
- Incubatie in een schudincubator gedurende 16 uur.
- Directe toevoeging van quorum-quenching lactonases aan de kweek.
- Kwantitatieve beoordeling van de biofilm-disruptie.
Belangrijkste resultaten
- Quorum-quenching enzymen verstoorden bacteriële biofilms effectief.
- De methode maakte een eenvoudige kwantificering van de biofilmverstoring mogelijk.
- Aangetoond potentieel voor het verminderen van de pathogeniciteit in biofilmomgevingen.
- Ondersteunde de ontwikkeling van nieuwe antibacteriële therapieën.
Conclusies
- Quorum-quenching enzymen zijn veelbelovende instrumenten in antibacteriële strategieën.
- Ze kunnen het risico op resistentie bij pathogene bacteriën verminderen.
- Deze studie legt de basis voor toekomstig onderzoek naar biofilmbeheer.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het verstoren van quorum-sensing-gemedieerde biofilmvorming pakt een kritieke bottleneck in de ontdekking van anti-virulentiemiddelen aan, vooral voor multiresistente pathogenen zoals Acinetobacter baumannii. Engineered quorum-quenching lactonasen bieden een mechanistisch gerichte aanpak om de veerkracht van biofilms te verminderen, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid van vroege anti-infectieve portfolio's. Deze methode maakt functionele validatie van anti-virulentiestrategieën mogelijk, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in R&D voor infectieziekten ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse mogelijk van quorum-sensingpaden die betrokken zijn bij de vorming van pathogene biofilms.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door de impact van lactonasevarianten op de disruptie van biofilms te kwantificeren.
- Faciliteert functionele doelwitvalidatie voor anti-virulentiemechanismen in klinisch relevante stammen.
- Biedt een platform voor het screenen van enzymkandidaten op basis van kwantitatieve biofilmreductie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Vestigt een reproduceerbaar in vitro systeem voor het evalueren van de effectiviteit van quorum-quenching enzymen.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten via kristalvioletkleuring en confocale beeldvorming.
- Maakt comparatieve beoordeling van wild-type en gemanipuleerde enzymvarianten mogelijk voor screening-pipelines.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform voor high-throughput evaluatie van anti-biofilmverbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen door gebruik te maken van klinisch significante A. baumannii stammen.
- Biedt translationele continuïteit van mechanistische ontdekking tot preklinische validatie van anti-virulentie.
- Informeert de ontwikkeling van biomarkers door enzymactiviteit te correleren met biofilm-fenotypen.
- Vermindert het risico bij de verdere ontwikkeling van anti-biofilm middelen door functionele resultaten in pathogene systemen te kwantificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek voor anti-infectieve R&D, waarmee een brug wordt geslagen tussen mechanistische validatie en de prioritering van kandidaten.
- Ontdekkingsbiologie: Kwantificeert het effect van quorum-quenching enzymen op biofilmvorming, waardoor anti-virulentiemechanismen worden verduidelijkt.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare assays voor de evaluatie van enzymen en verbindingen.
- Analytiek: Levert kwantitatieve absorptie- en imaging-outputs voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro bevindingen met ziekterelevante biofilmmodellen voor preklinische afstemming.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een herbruikbare workflow voor het evalueren van diverse quorum-quenching agentia over verschillende pathogene stammen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de validatie van anti-virulentiedoelen en het mechanistisch verminderen van risico's.
- Operationele waarde: Standaardiseert assays voor de afbraak van biofilms voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen mogelijk en vermindert biologische risico's in een laat stadium binnen anti-infectieve portfolio's.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van enzymkandidaten en anti-biofilmstrategieën.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in microbiologie, enzymologie en technieken voor biofilm-kwantificering.
- Toegang tot absorbentie-plaatlezers en infrastructuur voor confocale microscopie is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van de was- en kleuringsstappen tussen teams is vereist om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Aanpasbaar aan andere pathogene stammen en varianten van quorum-quenching enzymen door middel van protocoloptimalisatie.
- Protocollen voor biohazard-insluiting en veiligheid zijn essentieel bij het werken met klinisch relevante pathogenen.
