Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Het algemene doel van deze methode is om milligram hoeveelheden van outer membrane beta-barrel eiwitten te verkrijgen die zullen kristalliseren en diffracteren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van membraaneiwitvouwing en transport, zoals hoe beta-barrel eiwitten in celmembranen worden ingebracht. Het grote voordeel van deze techniek is dat deze robuust is voor beta-barrel eiwitten.

Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn in deze methode worstelen, omdat de keuze van detergenten voor zuivering, kristallisatie en diffractie uitdagend is. Jeremy Guerin, een postdoc uit het laboratorium van Susan Buchanan, zal de procedure demonstreren, naast mijzelf en collega's in het lab. Begin deze procedure met de constructie van een T7 expressievector die het codon geoptimaliseerde doel outer membrane eiwit, of OMP gen, bevat voor in vivo expressie naar het membraan zoals beschreven in het tekstprotocol.

Transformeer het construct in een expressiestam van bacteriën voor expressie door een microliter van plasmide in 50 microliters van BL21(DE3) chemisch competente cellen te pipetten, en meng voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. Na incubatie, hittepuls gedurende 30 seconden op 42 graden Celsius met behulp van een waterbad, en plaats vervolgens één minuut terug op ijs.

Voeg één milliliter voorverwarmde SOC media toe en schud gedurende één uur bij 37 graden Celsius bij 1000 RPM met behulp van een tafelcentrifuge incubator. Na incubatie, plateer 100 microliters cellen op LB Agar platen met een geschikt antibioticum en incubeer overnacht bij 37 graden Celsius, omgekeerd. Voer vervolgens kleinschalige expressietesten uit door vijf milliliter LB met antibioticumcultuur te inoculeren met een enkele kolonie.

Herhaal voor vijf tot 10 koloniën. Laat groeien bij 37 graden Celsius met schudden tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer nul punt zes. Induceer expressie van het doel OMP door vijf microliters van één molaar IPTG toe te voegen aan elke kweekbuis en laat een extra één tot twee uur groeien.

Om expressieniveaus voor alle koloniën te vergelijken, centrifugeer één milliliter van elke kweek gedurende één minuut bij 15.000 keer G, met behulp van een microcentrifuge. Verwijder de supernatant en resuspendeer de cellen in 200 microliters van 1X SDS-PAGE laadbuffer. Verhit gedurende vijf minuten bij 100 graden Celsius en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende vijf minuten bij 15.000 keer G.

Analyseer de monsters met behulp van SDS-PAGE door 20 microliters in elk putje van een tien procent gel te pipetteren. Laat het gel 35 minuten draaien bij een constante 200 volt. Verzamel tenslotte de cellen door centrifugatie bij 6000 keer G gedurende tien minuten.

Resuspendeer de cellen in lysisbuffer in een verhouding van vijf milliliter per gram celpasta. Lyseeër de cellen met behulp van een French press of celhomogenisator. Draai vervolgens de gelyseeerde cellen bij 15.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius om ongelyseeerde cellen en celdebris te verwijderen.

Breng het supernatant over in een schone buis en centrifugeer opnieuw op hoge snelheid gedurende één uur bij vier graden Celsius. Het resulterende pellet is de membraanfractie die het eiwit van belang bevat. Resuspendeer de membraanfractie met behulp van een Dounce homogenisator.

Overbreng eerst de membranen en voeg vervolgens solubilisatiebuffer toe in 2X concentratie zonder detergent. Giet de gesuspendeerde membranen in een maatcilinder en voeg water toe totdat een uiteindelijke concentratie van 1X solubilisatiebuffer is bereikt. Breng het monster over in een beker en voeg langzaam detergent toe tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 keer de kritische micelleconcentratie.

Roer vervolgens gedurende 0,5 tot 16 uur bij vier graden Celsius, afhankelijk van hoe gemakkelijk het doelwiteiwit uit de membranen wordt geëxtraheerd. Centrifugeer tenslotte het gesolubiliseerde monster bij 300.000 keer G gedurende één uur bij vier graden Celsius. Bereid een 1 tot 5 milliliter IMAC kolom voor of gebruik een voorverpakte kolom.

Voer vervolgende chromatografiestappen uit bij vier graden Celsius. Spoel met water om eventuele sporen van conserveermiddelen te verwijderen. Als u een geautomatiseerd zuiveringssysteem gebruikt, installeer de kolom volgens de instructies van de fabrikant.

Bereid 500 milliliter IMAC buffer A zonder imidizool en 250 milliliter IMAC buffer B met één molaar imidizool voor. Equilibreer de IMAC kolom met behulp van 10 kolomvolumes van IMAC buffer A. Voeg imidizool toe aan het eiwitmonster tot een uiteindelijke concentratie van 25 millimolar en meng. Laad vervolgens het monster op de geëquilibreerde IMAC kolom met twee milliliter per minuut.

Verzamel het doorstromende materiaal. Was vervolgens de IMAC kolom met vijf kolomvolumes van stijgende concentraties imidizool, met behulp van buffer B. Verzamel de wassingen in twee milliliter fracties. Elueer het monster met een uiteindelijke concentratie van 250 millimolar voor vijf kolomvolumes en verzamel het elueerde monster in twee milliliter fracties.

Analyseer het doorstromende materiaal, de wasfracties en de elutiefracties met behulp van SDS-PAGE analyse op basis van hun absorptie bij 280 nanometer. Pool de fracties die het doelwit beta-barrel OMP bevatten, zoals geverifieerd door SDS-PAGE analyse. Verwijder vervolgens de 6X histidine tag door TEV protease toe te voegen aan het gepoolde monster en in te kuilen gedurende één nacht bij vier graden Celsius met zachtjes schudden.

Laad het monster protease oplossing opnieuw op een IMAC kolom om het doelwit beta-barrel OMP te scheiden van de afgebroken tags en eventueel niet afgebroken monster. Het doorstromende materiaal zal het afgebroken monster bevatten zonder de tag. Om voorbereiding voor kristallisatie te doen, laad het monster op een gel filtratie kolom in een buffer met de detergent die voor kristallisatie zal worden gebruikt.

Verzamel een milliliter fracties en analyseer met behulp van SDS-PAGE analyse op basis van hun absorptie bij 280 nanometer. Pool die fracties die het doelwiteiwit bevatten