Name: Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer een robuuste methode voor de productie van β-barrel buitenmembraaneiwitten in milligramhoeveelheden voor kristallisatie en structurele analyse. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van membraaneiwitvouwing en -transport.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Herve Celia van de CNRS bedanken voor het verstrekken van de UV-beelden en Chris Dettmar en Garth Simpson in het Department of Chemistry aan de Purdue University voor het verstrekken van de SONICC-beelden. We willen de financiering erkennen van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases en het Intramural Research Program bij de National Institutes of Health. Daarnaast willen we extra financiering erkennen van het National Institute of General Medical Sciences (A.M.S. en C.J.), het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01), en het Department of Biological Sciences aan de Purdue University (N.N.).

<ol><li>Walther, D. M., Rapaport, D., Tommassen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins+in+bacteria+and+eukaryotes%3A+evolutionary+conservation+and+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of beta-barrel membrane proteins in bacteria and eukaryotes: evolutionary conservation and divergence.</a> Cell Mol Life Sci. 66, 2789-2804 (2009).</li>
<li>Ricci, D. P., Silhavy, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bam+machine%3A+A+molecular+cooper%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The Bam machine: A molecular cooper.</a> Biochim Biophys Acta. 1818, 1067-1084 (2012).</li>
<li>Hagan, C. L., Silhavy, T. J., Kahne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Barrel+membrane+protein+assembly+by+the+Bam+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Biochem%22%5BJournal%5D)">beta-Barrel membrane protein assembly by the Bam complex.</a> Ann Rev of Biochem. 80, 189-210 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+iron+piracy+by+pathogenic+Neisseria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for iron piracy by pathogenic Neisseria.</a> Nature. 483, 53-58 (2012).</li>
<li>Noinaj, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+biogenesis+of+beta-barrel+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the biogenesis of beta-barrel membrane proteins.</a> Nature. 501, 385-390 (2013).</li>
<li>Gatzeva-Topalova, P. Z., Walton, T. A., Sousa, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+YaeT%3A+conformational+flexibility+and+substrate+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of YaeT: conformational flexibility and substrate recognition.</a> Structure. 16, 1873-1881 (2008).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+an+essential+component+of+the+outer+membrane+protein+assembly+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of an essential component of the outer membrane protein assembly machine.</a> Science. 317, 961-964 (2007).</li>
<li>Geibel, S., Procko, E., Hultgren, S. J., Baker, D., Waksman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+energetic+basis+of+folded-protein+transport+by+the+FimD+usher%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and energetic basis of folded-protein transport by the FimD usher.</a> Nature. 496, 243-246 (2013).</li>
<li>Phan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+FimD+usher+bound+to+its+cognate+FimC-FimH+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the FimD usher bound to its cognate FimC-FimH substrate.</a> Nature. 474, 49-53 (2011).</li>
<li>van den Berg, B., Black, P. N., Clemons, W. M. Jr, Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+long-chain+fatty+acid+transporter+FadL%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the long-chain fatty acid transporter FadL.</a> Science. 304, 1506-1509 (2004).</li>
<li>Fairman, J. W., Noinaj, N., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+biology+of+beta-barrel+membrane+proteins%3A+a+summary+of+recent+reports%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">The structural biology of beta-barrel membrane proteins: a summary of recent reports.</a> Curr Op Struct Bio. 21, 523-531 (2011).</li>
<li>Noinaj, N., Guillier, M., Barnard, T. J., Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-dependent+transporters%3A+regulation%2C+structure%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-dependent transporters: regulation, structure, and function.</a> Ann Rev of Micro. 64, 43-60 (2010).</li>
<li>Siburt, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hijacking+transferrin+bound+iron%3A+protein-receptor+interactions+involved+in+iron+transport+in+N.+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Metallomics%22%5BJournal%5D)">Hijacking transferrin bound iron: protein-receptor interactions involved in iron transport in N. gonorrhoeae.</a> Metallomics. 1, 249-255 (2009).</li>
<li>Cornelissen, C. N., Hollander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TonB-Dependent+Transporters+Expressed+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Micro%22%5BJournal%5D)">TonB-Dependent Transporters Expressed by Neisseria gonorrhoeae.</a> Front in Micro. 2 (117), (2011).</li>
<li>Dautin, N., Bernstein, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+secretion+in+gram-negative+bacteria+via+the+autotransporter+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+of+Micro%22%5BJournal%5D)">Protein secretion in gram-negative bacteria via the autotransporter pathway.</a> Ann Rev of Micro. 61, 89-112 (2007).</li>
<li>Leo, J. C., Grin, I., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+V+secretion%3A+mechanism%28s%29+of+autotransport+through+the+bacterial+outer+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Type V secretion: mechanism(s) of autotransport through the bacterial outer membrane.</a> Phil Trans of the Royal Soc of London. Series B, Biological Sciences. 367, 1088-1101 (2012).</li>
<li>Buchanan, S. K., Yamashita, S., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchanan%2C+SK+%22Comprehensive+Biophysics%22">Comprehensive Biophysics</a>. Engelman, E. H., Tamm, L. K. 5, Academic Press. 139-163 (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+colicin+I+receptor+bound+to+the+R-domain+of+colicin+Ia%3A+implications+for+protein+import%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of colicin I receptor bound to the R-domain of colicin Ia: implications for protein import.</a> EMBO J. 26, 2594-2604 (2007).</li>
<li>Yamashita, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+Ail-mediated+adhesion+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into Ail-mediated adhesion in Yersinia pestis.</a> Structure. 19, 1672-1682 (2011).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Res. 18, 6069-6074 (1990).</li>
<li>Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reliable+ligation-independent+cloning+of+PCR+products+using+modified+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Rapid reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors.</a> BioTechniques. 13, 515-518 (1992).</li>
<li>Rosenbusch, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+major+envelope+protein+from+Escherichia+coli.+Regular+arrangement+on+the+peptidoglycan+and+unusual+dodecyl+sulfate+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of the major envelope protein from Escherichia coli. Regular arrangement on the peptidoglycan and unusual dodecyl sulfate binding.</a> J Biol Chem. 249, 8019-8029 (1974).</li>
<li>Barnard, T. J., Wally, J. L., Buchanan, S. K., et al. Crystallization of integral membrane proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarnard%2C+TJ+%22Curr+Prot+in+Prot+Science%22">Curr Prot in Prot Science</a>. Coligan, J. E., et al. Chapter 17, Unit 17 19(2007).</li>
<li>Ujwal, R., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+using+the+lipidic+bicelle+method%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">High-throughput crystallization of membrane proteins using the lipidic bicelle method.</a> JoVE. , e3383(2012).</li>
<li>Faham, S., Ujwal, R., Abramson, J., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Aspects+of+Membrane+Proteins+Crystallization+in+Bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Topics+in+Membranes%22%5BJournal%5D)">Practical Aspects of Membrane Proteins Crystallization in Bicelles.</a> Curr Topics in Membranes. 63, 111-127 (2009).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , e4000(2012).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> JoVE. , (2011).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+and+refolding+of+an+80-kDa+iron+transporter+from+the+outer+membrane+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Overexpression and refolding of an 80-kDa iron transporter from the outer membrane of Escherichia coli.</a> Biochem Soc Trans. 27, 903-908 (1999).</li>
<li>Buchanan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-barrel+proteins+from+bacterial+outer+membranes%3A+structure%2C+function+and+refolding%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Beta-barrel proteins from bacterial outer membranes: structure, function and refolding.</a> Curr Op in Struct Bio. 9, 455-461 (1999).</li>
<li>Stanley, A. M., Fleming, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+process+of+folding+proteins+into+membranes%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+of+Biochem+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">The process of folding proteins into membranes: challenges and progress.</a> Arch of Biochem and Biophysics. 469, 46-66 (2008).</li>
<li>Pautsch, A., Schulz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+outer+membrane+protein+A+transmembrane+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure of the outer membrane protein A transmembrane domain.</a> Nature Struct Bio. 5, 1013-1017 (1998).</li>
<li>Cowan, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+OmpF+porin+in+a+tetragonal+crystal+form%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">The structure of OmpF porin in a tetragonal crystal form.</a> Structure. 3, 1041-1050 (1995).</li>
<li>Ujwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+mouse+VDAC1+at+2.3+A+resolution+reveals+mechanistic+insights+into+metabolite+gating%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of mouse VDAC1 at 2.3 A resolution reveals mechanistic insights into metabolite gating.</a> PNAS. 105, 17742-17747 (2008).</li>
<li>Robert, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+factor+Omp85+recognizes+its+outer+membrane+protein+substrates+by+a+species-specific+C-terminal+motif%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Bio%22%5BJournal%5D)">Assembly factor Omp85 recognizes its outer membrane protein substrates by a species-specific C-terminal motif.</a> PLoS Bio. 4, e377(2006).</li>
<li>Paramasivam, N., Habeck, M., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+the+C-terminal+insertional+signal+in+Gram-negative+bacterial+outer+membrane+proteins+species-specific+or+not%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Is the C-terminal insertional signal in Gram-negative bacterial outer membrane proteins species-specific or not?</a> BMC Genomics. 13, 510(2012).</li>
<li>Agah, S., Faham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in bicelles.</a> Methods in Mol Bio. 914, 3-16 (2012).</li>
<li>Ujwal, R., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+bicelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles.</a> Methods. 55, 337-341 (2011).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cur+Op+in+Struct+Bio%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Cur Op in Struct Bio. 21, 559-566 (2011).</li>
<li>Luecke, H., Schobert, B., Richter, H. T., Cartailler, J. P., Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+bacteriorhodopsin+at+1.55+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure of bacteriorhodopsin at 1.55 A resolution.</a> J Mol Biol. 291, 899-911 (1999).</li>
<li>Kato, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+channelrhodopsin+light-gated+cation+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the channelrhodopsin light-gated cation channel.</a> Nature. 482, 369-374 (2012).</li>
<li>White, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+agonist-bound+neurotensin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the agonist-bound neurotensin receptor.</a> Nature. 490, 508-513 (2012).</li>
<li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+beta2+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the beta2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477, 549-555 (2011).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

β-barrel OMP dienen een essentiële rol in Gram-negatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten en zijn belangrijke doelen voor structurele analyse die een schat aan informatie over wezenlijke moleculaire mechanismen die aan de buitenste membranen van deze respectieve organellen bieden. Echter produceert genoeg monster voor structurele analyse is niet altijd eenvoudig en daarom wordt een algemene pijpleiding gepresenteerd voor de productie van voldoende hoeveelheden doelwit β-barrel OMP&#39;s voor structuurbepaling, ...

β-barrel OMP&#39;s alleen worden gevonden in het buitenmembraan van mitochondria, chloroplasten, en Gram-negatieve bacteriën 1-3. Terwijl ze gelijkaardige rol dienen als α-helix eiwitten, ze hebben een heel andere plooi bestaande uit een centrale membraan ingebedde β-barrel domein variërend 8-26 antiparallelle β-strengen met elk onderdeel zijn nauw verbonden met de twee aangrenzende strengen (figuren 1 en 2). De eerste en laatste strengen van het β-barrel domein interageren dan met elkaar bijna uitsluitend in een anti-parallelle wijze (behalve mitochondriale VDAC), sluiten en afdichten van de β-barrel domein van de omringende membraan. Alle β-barrel OMP&#39;s zijn extracellulaire lussen van verschillende sequentie en lengte die een belangrijke rol ligand interacties en / of eiwit-eiwit contacten spelen met deze loops soms zijn zo groot als 75 resten, zoals in Neisseria transferrine bindende proTein A (TbpA) 4. β-barrel OMP kunnen ook N-terminale of C-terminale periplasmatische extensies, die als extra domeinen dienen voor het eiwit functioneel doel (bijv BAMA 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Hoewel vele soorten β-barrel OMP aanwezig 11 zijn twee van de meest voorkomende hierna beschreven als voorbeeld voor niet-ervaren het veld (1) TonB-afhankelijke transporters en (2) autotransporters. TonB-afhankelijke transporters (bv, FEPA, TbpA, BTub, Cir, etc.) zijn essentieel voor voedingsstoffen import en bevatten een N-terminaal plug domein bestaande uit ~ 150 resten die gevonden is weggestopt in een C-terminaal 22-stranded β- barrel domein ingebed in de buitenste membraan 12 (figuur 3). Hoewel deze plug domein voorkomt substraat vrijelijk door het vat domein, substraatbinding induceert een conformationele verandering binnen het plug domein thbij leidt tot de vorming van poriën (hetzij door plug herschikking of door gedeeltelijke / volledige uitwerpen van de stop), die vervolgens substraat transport over de buitenste membraan kan faciliteren in het periplasma. TonB-afhankelijke transporteurs zijn vooral belangrijk voor de overleving van sommige pathogene stammen van Gram-negatieve bacteriën zoals Neisseria meningitidis die gespecialiseerde transporteurs die voedingsstoffen kapen zoals ijzer direct uit menselijke gastheer- 4,13,14 geëvolueerd. Autovrachtwagens behoren tot het type V secretiesysteem van Gram-negatieve bacteriën en zijn P-barrel OMP&#39;s die bestaan ​​uit een β-barrel domein (typisch 12-strengen als met ESTA en ESPP) en een passagier domein dat ofwel wordt uitgescheiden en gepresenteerd op de oppervlak van de cel 15,16 (figuur 3). De β-barrel OMP&#39;s dienen vaak een belangrijke rol in celoverleving en virulentie bij de passagier domein dienen ofwel als een protease, adhesine, en / of andere effector die bemiddelt pathogenese. Structurele werkwijzen zoals röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie en elektronenmicroscopie (EM) laten modellen bepalen de OMP&#39;s bij atomaire resolutie die weer gebruikt kan worden om te ontcijferen hoe ze functioneren in het buitenmembraan. Deze waardevolle informatie kan dan worden gebruikt voor het geneesmiddel en vaccinontwikkeling, indien van toepassing. Bijvoorbeeld, transferrine bindend eiwit A (TbpA) gevonden op het oppervlak van Neisseria en is vereist voor pathogenese omdat het direct bindt humaan transferrine en vervolgens extraheert en invoert ijzer tot zijn eigen overleving. Zonder TbpA, kan Neisseria niet vangen ijzer uit de menselijke gastheer en zijn gemaakt van niet-pathogene. Na de kristalstructuur van humaan transferrine gebonden aan TbpA 4 opgelost, het veel duidelijker hoe de twee eiwitten geassocieerd werden, welke gebieden van TbpA gemedieerde interactie, welke residuen belangrijk ijzer extractie waren door TbpA enhoe men zou kunnen ontwikkelen therapieën tegen Neisseria targeting TbpA. Daarom, gezien het belang van β-barrel OMP&#39;s in Gram-negatieve bacteriën om te overleven en pathogenese, en in mitochondria en chloroplasten functie en de behoefte aan aanvullende structurele informatie over deze unieke klasse van membraaneiwitten en de systemen waarin ze functioneren , algemene protocollen worden met de algemene doelstelling van het uitdrukken en zuiveren doel OMP op een hoog niveau voor de karakterisering door structurele methoden.

<table><tbody><tr><td>Crystallization Robot</td><td>TTP Labtech, Art Robbins</td><td>-</td><td>Elk wat zou hier moeten werken, behalve LCP-kristallisatie</td></tr><tr><td>PCR thermocycler</td><td>Eppendorf, BioRad</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Media Shaker</td><td>New Brunswick, Infors HT</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>UV-vis spectrometer</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE apparaat</td><td>BioRad</td><td>1645050, 1658005</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE en native gels</td><td>BioRad, Life Technologies</td><td>4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Prime</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>AkTA Purifier</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (lage-middelhoge snelheid)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge (hoge snelheid)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>SS34 rotor</td><td>Sorvall</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 45 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Fisher Scientific</td><td>06 435C</td><td></td></tr><tr><td>Emulsiflex</td><td>Avestin</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Dialysebuis</td><td>Sigma</td><td>D9652</td><td></td></tr><tr><td>LCP gereedschappen</td><td>Hamilton, TTP Labtech</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24 wel plaatjes</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>Sandwich plaatjes</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions</td><td>HR3-151, MD11-50 (MD11-53)</td><td></td></tr><tr><td>Grace Kristallisatie vellen</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>875238</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep S300 HR kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1167-01</td><td></td></tr><tr><td>Q-Sepharose kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0510-01</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisatie schermen</td><td>Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Gas-tight spuit (100 ml)</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

van constructen naar crystals - naar structuur bepaling van β-barrel outer membrane proteins

From Constructs to Crystals &#8211; Towards Structure Determination of &#946;-barrel Outer Membrane Proteins

Membraaneiwitten hebben belangrijke functies in cellen zoals nutriëntentransport, beweeglijkheid, signaaltransductie, overleven en virulentie, maar vormen slechts ongeveer 1% van de bekende structuren. Er zijn twee typen membraaneiwitten, α-helicale en β-vat. Terwijl α-helicale membraaneiwitten in bijna alle celmembranen kunnen worden gevonden, kunnen β-vat membraaneiwitten alleen worden gevonden in de buitenmembranen van mitochondriën, chloroplasten en Gram-negatieve bacteriën. Een veelvoorkomende bottleneck in structurele studies van membraaneiwitten in het algemeen is het verkrijgen van voldoende zuivere monsters voor analyse. In de hoop om degenen te helpen die geïnteresseerd zijn in het oplossen van de structuur van hun favoriete β-vat buitenmembraaneiwit (OMP), worden algemene protocollen gepresenteerd voor de productie van doel-β-vat OMP's op niveaus die nuttig zijn voor structuurbepaling door middel van röntgenkristallografie en/of NMR-spectroscopie. Hier schetsen we het ontwerp van constructen voor zowel native expressie als voor expressie in inclusielichamen, zuivering met behulp van een affiniteitstag en kristallisatie met behulp van detergent screening, bicelle en lipidische kubieke fase technieken. Deze protocollen zijn getest en bleken te werken voor de meeste OMP's van Gram-negatieve bacteriën; er zijn echter enkele doelen, met name voor mitochondriën en chloroplasten, die andere methoden voor expressie en zuivering kunnen vereisen. Als zodanig zouden de methoden hier toepasbaar moeten zijn voor de meeste projecten die OMP's van Gram-negatieve bacteriën omvatten, maar de expressieniveaus en hoeveelheid gezuiverd monster zullen variëren afhankelijk van het doel-OMP.

YiuR een TonB afhankelijk ijzer transporter die een vermeende vaccin doelgroep tegen Yersinia pestis. Het werd oorspronkelijk geïdentificeerd met behulp van een microarray analyse. Hier zijn de stappen die werden genomen om de structuur van YiuR bepalen met X-ray kristallografie worden geschetst (Figuur 9). Voor klonering van de DNA-sequentie YiuR (minus het N-eindstandige signaalsequentie) werd PCR geamplificeerd uit genomisch DNA en gesubkloneerd in een vector...

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% ...

Het algemene doel van deze methode is om milligramhoeveelheden van buitenmembraan beta-barrel-eiwitten te verkrijgen die kunnen kristalliseren en diffractie vertonen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van membraaneiwitvouwing en -transport, zoals de wijze waarop beta-barrel-eiwitten in celmembranen worden ingebouwd. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze robuust is voor beta-barrel-eiwitten.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat de keuze van detergentia voor zuivering, kristallisatie en defractie uitdagend is. Jeremy Guerin, een postdoc uit het laboratorium van Susan Buchanan, zal de procedure demonstreren, samen met mijzelf en collega's in het lab. Begin deze procedure met de constructie van een T7-expressievector die het codon-geoptimaliseerde target outer membraaneiwit, of OMP-gen, bevat voor in vivo expressie naar het membraan, zoals beschreven in het tekstprotocol.Transformeer het construct naar een expressiestam van bacteriën voor expressie door één microliter plasmid in 50 microliters chemisch competente BL21(DE3)-cellen te pipetteren en voorzichtig te mengen door herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Voer na de incubatie een hittepuls uit bij 42 °C gedurende 30 seconden in een waterbad, en plaats de cellen vervolgens gedurende één minuut terug op ijs.Voeg één milliliter voorverwarmd SOC-medium toe en schud gedurende één uur bij 37 °C op 1000 RPM met behulp van een benchtop-schudincubator. Plaats na incubatie 100 µL cellen op LB-agarplaten die een geschikt antibioticum bevatten en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C, ondersteboven. Voer vervolgens kleinschalige expressietesten uit door vijf milliliter LB-medium met antibioticum te inoculeren met een enkele kolonie.Herhaal dit voor vijf tot 10 kolonies. Kweek bij 37 °C met schudden tot een optische dichtheid bij 600 nanometer van ongeveer 0,6. Induceer de expressie van het doeleiwit OMP door 5 µL 1 M IPTG aan elke cultuurbuis toe te voegen en laat dit nog één tot twee uur groeien.Om de expressieniveaus van alle kolonies te vergelijken, centrifugeer één milliliter van elke cultuur gedurende één minuut bij 15.000 ×g in een microcentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 µL 1X SDS-PAGE laadbuffer. Verhit gedurende vijf minuten bij 100 °C en centrifugeer vervolgens opnieuw gedurende vijf minuten bij 15.000 ×g.Analyseer de monsters via SDS-PAGE door 20 µL in elke put van een gel van 10% te pipetteren. Laat de gel 35 minuten lopen bij een constante spanning van 200 V. Oogst ten slotte de cellen door centrifugatie bij 6000 ×g gedurende tien minuten.Resuspendeer de cellen in lysisbuffer met een verhouding van vijf milliliter per gram celpasta. Lyseer de cellen met behulp van een French press of celhomogenisator. Centrifugeer vervolgens de gelyseerde cellen 30 minuten bij 15.000 ×g bij vier graden Celsius om niet-gelyseerde cellen en celdebris te verwijderen.Overbreng de supernatant naar een schone buis en centrifugeer opnieuw op hoge snelheid gedurende één uur bij vier graden Celsius. De resulterende pellet is de membraanfractie die het eiwit van belang bevat. Resuspendeer de membraanfractie met behulp van een Dounce-homogenisator.Breng eerst de membranen over en voeg vervolgens solubilisatiebuffer toe in een 2X concentratie zonder detergent. Giet de geresuspendeerde membranen in een maatsilinder en voeg water toe tot een eindconcentratie van 1X solubilisatiebuffer is bereikt. Breng het monster over naar een bekerglas en voeg langzaam detergent toe tot een eindconcentratie van ongeveer 10 keer de kritische micelconcentratie.Roer vervolgens 0,5 tot 16 uur bij vier graden Celsius, afhankelijk van hoe gemakkelijk het doeleiwit uit de membranen wordt geëxtraheerd. Centrifugeer ten slotte het gesolutiseerde monster 1 uur bij 300.000 ×g bij vier graden Celsius. Bereid een IMAC-kolom van één tot vijf milliliter voor of gebruik een voorgevulde kolom.Voer de volgende chromatografiestappen uit bij vier graden Celsius. Spoel met water om eventuele sporen van conserveermiddelen te verwijderen. Als er een geautomatiseerd zuiveringssysteem wordt gebruikt, installeer de kolom dan volgens de instructies van de fabrikant.Bereid 500 milliliter IMAC-buffer A zonder imidiazool en 250 milliliter IMAC-buffer B met één molaire imidiazool voor. Equilibreer de IMAC-kolom met 10 kolomvolumes IMAC-buffer A. Voeg imidiazool toe aan het eiwitmonster tot een eindconcentratie van 25 millimolair en meng dit. Laad vervolgens het monster op de geëquilibreerde IMAC-kolom met een stroomsnelheid van twee milliliter per minuut.Verzamel de doorstroomvloeistof. Was vervolgens de IMAC-kolom met vijf kolomvolumes van oplossingen met toenemende concentraties imidizool, met behulp van buffer B. Verzamel de wasbeurten in fracties van twee milliliter. Elueer het monster met een eindconcentratie van 250 millimolair gedurende vijf kolomvolumes en verzamel het eluaat in fracties van twee milliliter.Analyseer de flow-through, de wasfracties en de elutiefracties met behulp van SDS-PAGE-analyse op basis van hun absorptie bij 280 nanometer. Pool de fracties die het doelsegment van het bèta-barrel OMP bevatten, zoals geverifieerd door SDS-PAGE-analyse. Verwijder vervolgens de 6X histidine-tag door TEV-protease aan het gepoolde monster toe te voegen en dit gedurende de nacht te incuberen bij vier graden Celsius met rustig schudden.Laad de protease-monsteroplossing opnieuw op een IMAC-kolom om het doelwit bèta-barrel OMP te scheiden van de afgesplitste tags en eventueel niet-afgesplitst monster. De doorloopfractie zal het afgesplitste monster bevatten dat de tag mist. Ter voorbereiding op kristallisatie wordt het monster geladen op een gelfiltratiekolom in een buffer die het detergent bevat dat voor de kristallisatie zal worden gebruikt.Verzamel fracties van één milliliter en analyseer deze met SDS-PAGE op basis van hun absorptie bij 280 nanometer. Pool de fracties die het doeleiwit bevatten en concentreer deze vervolgens tot ongeveer 10 milligram per milliliter. Assembleer de gelapparatuur voordat de monsters worden voorbereid.Gebruik voorgekoelde gel-runbuffer of voer de gel-elektroforese uit in de koude kamer. Filter het monster met een 0,22 micron centrifugaalfilter om particulate en neerslag te verwijderen. Pipetteer vervolgens 0,25 microliter van het monster in twee 1,5 milliliter microcentrifugebuisjes.Label de ene als "gekookt" en de andere als "RT". Voeg vervolgens 9,75 µL van de monsterbuffer toe aan elke buis en meng door te pipetteren. Voeg aan beide monsters ook 10 µL 2X SDS-laadbuffer toe en meng voorzichtig door te pipetteren. Kook het "gekookte" monster vijf minuten lang bij 95 °C, terwijl het "RT"-monster op kamertemperatuur blijft.Centrifugeer vervolgens de gekookte monsters kort. Laad daarna 20 µL van beide monsters op de vooraf klaargezette native gel. Nadat de gel 60 minuten lang is gerund bij een constante spanning van 150 V, wordt de gel verwijderd en geweekt in kleuringsoplossing om de resultaten te visualiseren.Voer kristallisatieproeven uit in detergent, bi-cells en lipidische kubische fase, gebruikmakend van eerder gepubliceerde JoVE-methoden. Kristallisatiekoppen worden gevisualiseerd onder een UV-microscoop om te verifiëren dat de kristallen inderdaad proteïnen zijn en geen zout, lipide of detergent. Topkristallen worden gescreend met een eigen bron of bij de synchrotron om te bepalen of de kristallen diffracteren.Nadat de gegevens van kristallen die goed diffracteren zijn verzameld, worden deze verwerkt met behulp van verwerkingssoftware, zoals HKL2000. De resulterende bestanden worden overgedragen naar een softwarepakket voor structuurbepaling, zoals Phoenix Suit, waarna moleculaire vervanging wordt uitgevoerd voor de initiële fasering en structuurbepaling. De kristalstructuur van YIUR werd met deze methode bepaald bij een resolutie van 2.6 Angstrom.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee weken worden voltooid, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe bacteriële eiwitten van het buitenmembraan kunnen worden tot expressie gebracht en gezuiverd voor structurele studies.

from-constructs-to-crystals-towards-structure-determination-barrel

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

We beschrijven een kader dat eenvoudige biochemische en computationele analyses combineert om de karakterisering en kristallisatie van grote coiled-coil-domeinen te begeleiden. Dit kader kan worden aangepast voor globulaire eiwitten of worden uitgebreid om een verscheidenheid aan hoogdoorvoertechnieken te integreren.

De combinatie van natte en droge Lab Technieken om de kristallisatie van grote opgerolde-coil bevattende eiwitten Gids

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Dit protocol is ontwikkeld om de dimer-dodecamer overgang van TmPep1050, een M42 aminopeptidase, op structureel niveau te bestuderen. Het is een eenvoudige pijplijn vanaf eiwitzuivering tot röntgengegevensverwerking. Crystallogenesis, data set indexatie, en moleculaire vervanging zijn benadrukt door middel van een geval van studie, TmPep1050H60A H307A variant.

X-Ray Kristallografie om de oligomerische staat overgang van de Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050 studie

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

Leer een robuuste methode voor de productie van β-barrel buitenmembraaneiwitten in milligramhoeveelheden voor kristallisatie en structurele analyse. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van membraaneiwitvouwing en -transport.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Meer video's verkennen