Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis
11 april 2016
We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.
Het algemene doel van deze benadering is het snel en betrouwbaar screenen van microbiële exopolysacharideproducenten en de identificatie van hun koolhydraatvingerafdruk. Dit is een essentiële stap om de onontdekte diversiteit van exopolysachariden te benutten. Onze methode kan helpen om het onderzoek naar polymeren in het veld van microbiële exopolysachariden te versnellen.
Het maakt de snelle identificatie mogelijk van nieuwe polysacharidevarianten met verschillende eigenschappen voor specifieke toepassingen. Het grote voordeel van deze techniek is de combinatie van verschillende exopolysacharidedetectiesystemen in een modulair en volledig geautomatiseerd screeningconcept. Dit maakt het extreem snel en betrouwbaar.
Deze techniek kan ook handmatig worden uitgevoerd in laboratoria waar er geen automatiseringsplatform beschikbaar is, waardoor het gebruik ervan zeer flexibel is en kan worden aangepast aan verschillende screeningbehoeften. Deze exopolysacharide- of EPS-screeningplatform heeft een modulaire opstelling, die het mogelijk maakt om het protocol in twee hoofdgedeelten te scheiden, Geautomatiseerd screenen en Koolhydraatvingerafdruk. De eerste taak is het kweken van de stammen voor screening en het verwijderen van de cellen door centrifugatie.
De stammen worden gekweekt op glucose als koolstofbron in 96-well platen bedekt met ademende afdichtingsfolie op micro titer plate shaker bij 30 graden Celsius en 1.000 RPM. Op de dag van het screen, bereid de robotwerktafel en opslageigenschappen zoals beschreven in de protocoltekst. Verwijder de ademende afdichtingsfolie van de platen en wijs de hoofdculturen toe aan de carrouselpositie 1-1 tot 1-4.
Start het geautomatiseerde robotprogramma. Om cellen na cultivatie te verwijderen, breng de hoofdcultuur diep welpenplaten van de carrouseel naar de centrifuge, en centrifugeer bij 4.300 x g en 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voor de precipitatie vóór filtratie, verplaats de micro titer platen, evenals de pH-indicator micro titer platen, van de carrouseel naar de werktafel.
Breng ook de filtratieplaten over, die zorgen voor de volledige verwijdering van alle bacteriële cellen, samen met de verzamellades naar hun werktafelposities. Na centrifugatie, breng 180 microliter van de hoofdcultuursupernatant over naar de filtratieplaat. Aspirateer 150 microliter van de hoofdcultuursupernatant en doseer 50 microliter in de micro titer plaat voor precipitatie vóór filtratie, en 100 microliter naar de pH-indicatorplaat.
Precipitatie van het supernatant met 2-propanol wordt uitgevoerd om EPS-productie te beoordelen. Gebruik een 12,5-milliliter multi-step pipette om handmatig 150 microliter 2-propanol toe te voegen aan elke put. Na het schudden van de micro titer platen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 900 RPM, observeer visueel vezel- of vlokformaties die EPS-productie aangeven.
Nadat de hoofdcultuurplaten terug zijn opgeslagen in de carrouseel, onderzoek de fermentatiebrouwsels, die een verminderde sedimentatie na centrifugatie zouden moeten vertonen. De toename van de viscositeit is een andere indicatie van EPS-productie. De tweede taak is om een volledige celverwijdering uit het viskeuze fermentatiebrouwsel te garanderen via een 96-well filtratie.
Centrifugeer de filtratieplaten bij 3.000 x g en 20 graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de platen vervolgens terug naar hun thuispositie in de carrouseel en voer de gelijkgewichtsbepaling van de gel-filtratie uit zoals beschreven in de protocoltekst. Pipetteer vervolgens 35 microliter filtraat naar het centrum van de geëquilibreerde gel-filtratieplaat, en 50 microliter naar de micro titer plaat die wordt gebruikt voor precipitatie.
Verplaats de gel-filtratieplaten naar de centrifuge, en verplaats alle andere platen van de werktafel terug naar de startposities in de carrouseel. Nadat alle platen weer in de carrouseel zijn opgeslagen, let op de zeer viskeuze supernatanten zoals aangegeven door restanten in de filterplaat. Een gebrek aan filtraat kan leiden tot valse negatieve resultaten in de volgende analytische modules.
De derde taak in geautomatiseerd screenen is het verwijderen van de resterende monomere suikers uit het groeimedium via een 96-well gelfiltratie. Centrifugeer de gelfiltratieplaten bij 1.000 x g en 20 graden Celsius gedurende twee minuten. Bereid de werktafel voor via de robotische manipulator voor het verwerken van de gelfiltraten.
Om de resterende glucose na gelfiltratie te detecteren, gebruik 50-microliter tips om 25 microliter dubbel gedistilleerd water over te brengen naar een nieuwe micro titer plaat. Aspirateer 20 microliter dubbel gedistilleerd water, vijf microliter lucht en 5 microliter gel-filtraat, en doseer in dezelfde plaat. Neem 200-microliter tips en aspireer 50 microliter glucose-assayreagens-mix van werktafelpositie 1-2 om de eerste test te starten.
Verplaats de micro titer platen naar de incubator. Na 30 minuten incubatie, verplaats de platen van de incubator naar de micro titer lezer, en neem de absorptie op bij 418 en 480 nanometer. Om het totale koolhydraatgehalte te bepalen door de fenol-zwavelzuurmethode, pipetteer 20 microliter gel-filtraat naar de micro titer platen.
Verwijder de platen handmatig uit de carrouseel en plaats ze in de vloeistofbhandelingsstation. Neem de kalibratieplaat op met 20 microliter van verschillende glucoseconcentraties in drievoudig. Plaats een afvalcontainer op positie 1, een 300-microliter tipbox op positie 2, en een 250-milliliter bak met 110 milliliter vers bereid fenol-zwavelzuur op positie 3.
Gebruik een 8-kanaals pipetteerder met 300-microliter tips om 180 microliter fenol-zwavelzuur over te brengen naar elke rij van alle platen. Bedek alle micro titer platen met deksels en meng door gedurende vijf minuten bij 900 RPM bij kamertemperatuur te schudden. Incubeer gedurende 35 minuten bij 80 graden Celsius in een oven voor de kleurreactie.
Nadat de platen zijn afgekoeld onder een afzuigkap, meet u de extinctie bij 480 nanometer. Stammen uit het geautomatiseerde screenen worden aangeduid als EPS-positief als ze aan ten minste twee van de volgende drie criteria voldoen. Viscositeitscontrol
Overzicht
Dit artikel presenteert een geautomatiseerde modulaire hoog-doorvoermethode voor het identificeren en karakteriseren van microbiële exopolysachariden (EPS). De methode combineert snelle preselectie en gedetailleerde koolhydraatvingerafdrukken om de screening van bacteriestammen te vergemakkelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiële biotechnologie
- Exopolysacharide-onderzoek
- Hoog-doorvoer screeningmethoden
Achtergrond
- Microbiële exopolysachariden hebben diverse toepassingen.
- Traditionele methoden voor het screenen van EPS-producenten kunnen langzaam en arbeidsintensief zijn.
- Geautomatiseerde methoden kunnen de efficiëntie van EPS-identificatie verbeteren.
- Het begrijpen van koolhydraatvingerafdrukken is cruciaal voor het benutten van EPS-diversiteit.
Doel van het onderzoek
- Om een snelle en betrouwbare screeningmethode voor EPS-producenten te ontwikkelen.
- Om koolhydraatvingerafdrukken van nieuw geïsoleerde bacteriestammen te identificeren.
- Om polymeeronderzoek in microbiële exopolysachariden te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Kweek van bacteriestammen in 96-well platen.
- Geautomatiseerde celverwijdering en EPS-precipitatie met behulp van 2-propanol.
- Filtratie en gel-filtratietechnieken voor het analyseren van supernatanten.
- Colorimetrische assays om het totale koolhydraatgehalte te meten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van EPS-positieve stammen op basis van viscositeit en glucose equivalent criteria.
- Aangetoonde flexibiliteit van de methode voor zowel geautomatiseerd als handmatig gebruik.
- Snelle screening maakte de detectie van nieuwe polysacharidevarianten mogelijk.
- Bijdragend aan een uitgebreid protocol voor EPS screening en karakterisering.
Conclusies
- De geautomatiseerde screeningmethode versnelt EPS-onderzoek aanzienlijk.
- Modulair ontwerp maakt aanpassing mogelijk voor verschillende screeningbehoeften.
- Deze aanpak opent nieuwe wegen voor het onderzoeken van microbiële exopolysacharidediversiteit.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This platform enables rapid identification of microbial exopolysaccharide (EPS) producers and detailed carbohydrate fingerprinting, supporting early-stage discovery of novel biopolymers with potential applications in pharmaceuticals, food, and industrial biotechnology. By combining high-throughput screening with sensitive analytical modules, it reduces time and labor in EPS characterization, accelerating lead identification from strain libraries. The modular design allows integration into discovery workflows for target validation and predictive de-risking of biosynthetic pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of microbial strain collections for EPS production, supporting hypothesis testing of biosynthetic gene clusters.
- Operational Value: Automated screening of up to 384 strains per run increases throughput and reduces manual labor in early discovery.
- Predictive Value: Carbohydrate fingerprinting via UHPLC-UV-ESI-MS provides structural insights that help predict functional properties of novel EPS.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Combines semi-quantitative viscosity, alcohol precipitation, and phenol-sulfuric acid assays for multi-parametric EPS detection.
- Operational Value: Modular setup allows customization of detection modules based on screening goals and resource availability.
- Scalability: Platform can be adapted for manual or automated use, enabling flexibility across laboratory settings.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Detailed monosaccharide and substituent analysis (e.g., pyruvate ketal) supports structure-function correlation for downstream application development.
- Mechanistic De-risking: Links genetic modifications to changes in EPS composition, enabling prediction of biosynthetic pathway outcomes.
- Continuity: Positive hits from primary screening feed directly into detailed fingerprinting, creating a seamless discovery-to-characterization pipeline.
Pipeline & Workflow Integration
The platform fits within the early discovery continuum, supporting strain screening, hit validation, and lead optimization for exopolysaccharide-based products. It enables rapid progression from library screening to structural characterization, reducing bottlenecks in biopolymer development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening of microbial diversity for novel EPS producers.
- Screening: Provides standardized, reproducible detection of EPS formation via viscosity, precipitation, and carbohydrate content assays.
- Analytics: Generates quantitative carbohydrate fingerprints that allow comparison of EPS structures across strains and conditions.
- Translational Research: Enables structure-guided selection of EPS variants with desired properties for application testing.
- Enterprise Reuse: Modular design allows reuse across projects targeting different polysaccharide types or microbial hosts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target validation by linking genotype to polysaccharide phenotype through detailed fingerprinting.
- Operational Value: Automation reduces hands-on time and improves reproducibility across large strain sets.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions in biopolymer programs by rapidly identifying high-potential producers.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EPS candidates based on structural novelty and production yield.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, carbohydrate analysis, and liquid handling systems.
- Needs access to centrifuges, plate readers, UHPLC-UV-ESI-MS, and automation platforms for full implementation.
- Standardization across sites requires training on both automated and manual modes of operation.
- Adaptation to non-glucose carbon sources or alternative precipitation solvents may require protocol optimization.
- Manual execution increases variability; automation is recommended for high-throughput consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Automated Screening of EPS-producing Strains
4:41
Automated Screening: Glucose-assay and Phenol-sulfuric-acid Method
7:00
Carbohydrate Fingerprinting: 96-well Micro Hydrolysis
8:41
Carbohydrate Fingerprinting: HT-PMP-derivatization
10:06
Results: Identification and Characterization of Microbial Exopolysaccharides in High-throughput
11:02
Conclusion
