Name: Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Leer een geautomatiseerd modulair high-throughput screeningsplatform voor exopolysacchariden met gevoelige koolhydraatvingerafdruk-analyse. Deze methode versnelt het identificeren van nieuwe bacteriële stammen aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Thomas Howe en Jörg Carsten oprecht voor de programmering en technische ondersteuning met de vloeistofafhandelingssystemen.

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
<li>Thibodeau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protecting+the+skin+from+environmental+stresses+with+an+exopolysaccharide+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cosmet+Toiletries%22%5BJournal%5D)">Protecting the skin from environmental stresses with an exopolysaccharide formulation.</a> Cosmet Toiletries. 120 (12), 81-90 (2005).</li>
<li>Prajapati, V. D., Jani, G. K., Zala, B. S., Khutliwala, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insight+into+the+emerging+exopolysaccharide+gellan+gum+as+a+novel+polymer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">An insight into the emerging exopolysaccharide gellan gum as a novel polymer.</a> Carbohydr Polym. 93 (2), 670-678 (2013).</li>
<li>Schmidt, W., Brouwers, H. J. H., Kuehne, H. C., Meng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+working+mechanism+of+starch+and+diutan+gum+in+cementitious+and+limestone+dispersions+in+presence+of+polycarboxylate+ether+superplasticizers%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Rheol%22%5BJournal%5D)">The working mechanism of starch and diutan gum in cementitious and limestone dispersions in presence of polycarboxylate ether superplasticizers.</a> Appl. Rheol. 23 (5), 52903(2013).</li>
<li>Srinivasan, R. Natural Polysaccharides as Treatment Agents for Wastewater. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSrinivasan%2C+R+%22Green+Materials+for+Sustainable+Water+Remediation+and+Treatment%22">Green Materials for Sustainable Water Remediation and Treatment</a>. , The Royal Society of Chemistry. 51-81 (2013).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+exopolysaccharide+screening+platform%3A+From+strain+cultivation+to+monosaccharide+composition+and+carbohydrate+fingerprinting+in+one+day%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">High throughput exopolysaccharide screening platform: From strain cultivation to monosaccharide composition and carbohydrate fingerprinting in one day.</a> Carbohydr Polym. 122, 212-220 (2015).</li>
<li>Ortega-Morales, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+polymers+synthesized+by+tropical+intertidal+biofilm+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular polymers synthesized by tropical intertidal biofilm bacteria.</a> J Appl Microbiol. 102 (1), 254-264 (2007).</li>
<li>Xu, R., Ma, S., Wang, Y., Liu, L., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+identification+and+statistic+optimization+of+a+novel+exopolysaccharide+producing+Lactobacillus+paracasei+HCT%5BTitle%5D)+AND+%22Afr.+J.+Microbiol.+Res%22%5BJournal%5D)">Screening identification and statistic optimization of a novel exopolysaccharide producing Lactobacillus paracasei HCT.</a> Afr. J. Microbiol. Res. 4 (9), 783-795 (2010).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determination+of+sugars+and+related+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal. Chem. 28 (3), 350-356 (1956).</li>
<li>Masuko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+analysis+by+a+phenol-sulfuric+acid+method+in+microplate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format.</a> Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).</li>
<li>Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+rapid+method+of+total+sugar+analysis+for+soybean+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed.</a> Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).</li>
<li>Sutherland, I. W. Ch 16, Microbial Exopolysaccharides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSutherland%2C+IW+%22Polysaccharides+Structural+Diversity+and+Functional+Versatility%22">Polysaccharides Structural Diversity and Functional Versatility</a>. Dumitriu, S. , Marcel Dekker. 431-457 (2005).</li>
<li>Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. What are Bacterial Extracellular Polymeric Substances?. Microbial extracellular polymeric substances: characterization, structure and function. Wingender, J., Neu, T. R., Flemming, H. C. , Springer. 258(1999).</li>
<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Polysaccharide detectie met fenol-zwavelzuur methode: Verschillende monosacchariden tonen verschillende absorptiemaxima en molaire extinctie coëfficiënten met behulp van deze methode 9. Dit resulteert in verschillende absorptiemaxima van polymeren, die verschillende suikers in verschillende hoeveelheden. De verschillende golflengten van absorptiemaxima voor 16 verschillende commerciële polymeren worden in tabel 5. De polymeren werden opgelost (1 g / l) in DDH 2 O, geroerd (150 rpm) gedurende de nacht en gemeten met fenol-zwavelzuur-werkwijze . Diutangom toonde de laagste absorptiemaxima bij 470 nm en scleroglucan en hyaluronzuur de hoogste bij 484 nm. Op basis van deze resultaten werd 480 nm gekozen voor deze screening platform. De relatieve absorptie van de polymeren werd berekend op basis van de absorptie verkregen met 1 g / l glucose (ingesteld op 100%). De laagste resultaten werden verkregen met scleroglucan en succinoglycan, beide met 92%. Dit was expecteerde omdat scleroglucan bevat alleen glucose en succinoglycan bevat glucose en galactose in een verhouding van 7: 1. Zowel commerciële polymeren hebben verschillende verliezen drogen en verschillende asgehalte, dit is de reden waarom de theoretische waarde van ~ 110% niet bereikt. Xylan toonde de hoogste relatieve absorptie met 311%. De reden hiervoor is de hoge molaire extinctiecoëfficiënt bereikt van xylose door het meer dominante furanose vorm. In een gehalte van 0,1 g / L glucose werd de detectielimiet bereikt, evenals de detectielimiet bij een concentratie &lt;0,05 g / l. De detectielimiet voor positieve spanningen in de screening hoger is dan 0,7 g / L en Aldus was de zuiverheid presteerde goed. Om betrouwbare resultaten, de resterende glucose na gelfiltratie werd bepaald met een glucose-assay en deze waarde werd afgetrokken van de waarde van het fenol-zwavelzuur methode. Geautomatiseerde glucose-assay verdunning: De voorstellingvan de glucosebepaling na kweken (verdunning 1: 100) werd onderzocht. Hiervoor werden 10 pl supernatant overgebracht naar 990 ul van DDH 2 O in een diepe put plaat en gemixt via tien keer opzuigen en afgeven van 180 ul van deze verdunning. De tweede kritische stap was het correct pipetteren van slechts 5 pl aliquot van de 1:10 verdunning van de glucose-analyse na gelfiltratie. Om de verdunning 25 pl DDH 2 O genereren overgebracht met een 50 eerste ul-tip werd vervolgens 20 ul DDH 2 O en 5 pl gel-filtraat elkaar afgezogen. Dit zorgt voor een betere verwijdering van de 5 pl aliquot uit de punt. Beide verdunningsstappen werden geverifieerd met verschillende glucose standaarden via een glucose-assay. De resultaten van twee voorbeeldige concentraties zijn in tabel 6 de 1:. 100 verdunning voor het bepalen van het glucosegehalte na kweken vertoonden grote nauwkeurigheid voor beide standaarden met een CV &amp; #60; 1,2%. Tegelijkertijd de nauwkeurigheid voor de hogere standaard was tot 11,6 (% fout). Dit is echter verwaarloosbaar als glucosebepaling vertegenwoordigt alleen de resterende glucosegehalte na kweek en daarom niet van belang voor het polymeer detectie. De verdunning van 1:10 voor de resterende glucose na gel-filtratie toonde zeer betrouwbare resultaten met een CV &lt;1,4% en een nauwkeurigheid &lt;2,1% fout. Behandeling verdamping: The screening vereist 3,5 h uit de eerste stap om de eerste glucose-assay. Om te weten te komen, of dit tijdsbestek heeft een invloed op de afgetopte MTP opslag, 50 pi glucose-assay kalibratienormen werden opgeslagen met en zonder dekking voor 3,5 uur in de robot carrousel. In de kalibratie bereik (45 tot 4,5 mg / l) nauwelijks gestegen het monster concentratie. Een toename - door verdamping - was onder 2,1% en alleen de twee laagste concentraties (1,8 en 0,9 mg / l) reikte tot 12,4% ( <strong&gt; Tabel 7). Gelfiltratie: hoge hoeveelheden niet-gemetaboliseerd glucose verstoren de kwantitatieve detectie van glucose uit het gehydrolyseerde polymeer. Daarom werd een gel-filtratiestap vereist om de resterende glucose na kweek te verwijderen. Bovendien, de gelfiltratie zuivert het polymeer bevattende supernatant van zouten en koolhydraten monomere verbindingen, andere dan glucose, de analytische achtergrond in het monomeer analyse te minimaliseren. Voor deze gelfiltratie stap 35 pl van het filtraat werden in het midden van de put. Om waarmerking van de robuustheid van gelfiltratie in het automatische systeem werden acht kalibratienormen van 0,045 tot 9 g / l glucose gefiltreerd (n = 8). Het glucosegehalte van elke concentratie werd steeds met meer dan 95% van de oorspronkelijke waarde (Tabel 8). Daarbij de gel-filtratie vertoonde zeer goede resultaten in verschillende concentraties glucose. Daarnaast is de resterende glucose na gel-filtration werd ook bepaald met een glucose-assay en afgetrokken van het fenol-zwavelzuur wil om de juiste hoeveelheid glucose-equivalent te ontvangen voor het gehydrolyseerde polymeer. Pyruvaat-assay: Ten eerste werd onderzocht of het geneutraliseerd en verdund (1:10) TFA-matrix van de hydrolysestap interfereert met de enzymatische reactie. Daarom werd de volledige test tweemaal uitgevoerd, eenmaal met en eenmaal zonder matrix en toonde betrouwbare resultaten. Tenslotte werd de pyruvaatgehalte van 16 commercieel verkrijgbare polymeren succes gemeten en is weergegeven in figuur 3. Het is algemeen bekend dat uit deze 16 polymeren alleen succinoglycan en xanthaan bevatten van nature pyruvaat. Met onze pyruvaat-assay beide polymeren werden correct geïdentificeerd. In scleroglucan werd welan gom en xylaan pyruvaat ook gedetecteerd in significante hoeveelheden. Kortom, het vermogen van de werkwijze werd gevalideerd en pyruvaat-assay showed een high performance. Het bleek te kunnen detecteren pyruvaat verschillende polymeren na hydrolyse. Koolhydraten vingerafdruk: Na het uitvoeren van alle analytische modules in de geautomatiseerde screening, werden potentiële EPS producenten geselecteerd voor de koolhydraten vingerafdruk analyse. Hiervoor zijn verschillende criteria toegepast: 1) positieve waarneming van viscositeit na centrifugeren en / of na filtratie. 2) Neerslag vóór en na filtratie. Waargenomen vezels en vlokken werden beoordeeld als positief. 3) Glucose tegenwaarde van de fenol-zwavelzuur methode. Waarden&gt; 700 mg / l werden als positieve waarden tussen 300 en 700 mg / l werden als vermeende EPS producenten. Wanneer twee of drie criteria werd beoordeeld als positief werden de stammen geselecteerd voor verdere koolhydraten vingerafdrukanalyse. De criteria kunnen worden aangepast op de individuele doel van de EPS screening (bijvoorbeeld lage viscositeit EPS). Onze aanpak gericht op het vinden efficient EPS producenten. Bij het zoeken naar stammen die alleen produceren kleine hoeveelheden EPS de evaluatie grens van het glucose-equivalent te verlagen. Technische voordeel en toekomstige toepassingen: Een interessante eigenschap van dit protocol is het modulaire karakter van de stappen en de verschillende analytische modules. Ze kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren, aangepast aan de individuele behoeften en nieuwe modules kunnen eenvoudig worden geïmplementeerd. Bovendien kan de analytische modules afzonderlijk worden gebruikt, bijvoorbeeld de hydrolyse module in combinatie met de HT-PMP-derivatisatie module kan een monomere samenstelling analyse uit te voeren van verschillende polymeeroplossingen (1 g / l) in 96-well formaat. Laboratorium zonder toegang tot een vloeistofverwerking moet de gehele screening kan handmatig worden verwerkt zonder enige veranderingen in de regeling pipetteren. Het gebruik van een vloeistofverwerking verhoogt de doorvoersnelheid tot 768 stammen (in plaats van 192 stammen als Screened handmatig) per dag. Het protocol dat hier wordt beschreven, kan een screening voor verschillende genera en derhalve voor het screenen van grote stammenverzamelingen op nieuwe EPS producenten te identificeren en analyseren hun koolhydraat vingerafdruk in een benadering (figuur 4). Bovendien kan een doelgerichte screening op polysacchariden met zeldzame suikers zoals fucose, uronzuren of onbekende suikers worden uitgevoerd via de gedetailleerde monosaccharide analyse. Ook kunnen verschillende combinaties suiker in gedefinieerde verhoudingen worden gedetecteerd. Dit maakt de eenvoudige identificatie van structureel verwante varianten van reeds bekende of nieuwe EPS EPS.

Microbiële exopolysaccharides (EPS) zijn structureel zeer diverse groep van polymeren die verschillende biologische functies vervullen. Meestal zijn opgebouwd uit complexe herhalende eenheden, die worden onderscheiden door verschillende typen monomeren (suiker, suikerderivaten, suikerzuren), de bindingen tussen de monomeren en hun vervangingen. De structurele diversiteit van microbiële polysacchariden verleent nogal verschillende kenmerken van de leden van deze molecule klasse, die hun toepassing in verschillende gebieden, zoals voedsel 1 toelaat, cosmetica 2,3, bouw chemie 4 of waterbehandeling 5. Om het toepassingsgebied van deze bio- dergelijke duurzame polymeren de identificatie van nieuwe natuurlijke microbiële polysachariden en de engineering van uitvoeringsvarianten vormt werkvorm verder uitbreiden. Hoe dan ook, is een snelle screeningsmethode nodig zijn om snel een groot aantal microbiële stammen voor thei scannenr polysaccharide vormen, en hun producten te analyseren. Daarom hebben wij onlangs een 96-well HT-screening platform voor de analyse van microbiële polysaccharideproductie uit natuurlijke isolaten of aangelegde stamvarianten dat de identificatie van de monomere samenstelling 6 omvat. Toegepast platform voor een eerste screening ronde van ~ 500 natuurlijke isolaten lieten identificeren slechts ongeveer 10 tot 20% van de bekomen stammen als het kunnen produceren EPS (gegevens niet getoond). Dit betekent dat 80-90% van de geanalyseerde stammen niet EPS onder de toegepaste omstandigheden produceerde, en dus een verdere analyse van de gedetailleerde koolhydraat vingerafdruk niet nodig. Aangezien dit zeer verfijnde identificatie van de monomere samenstelling een tijdrovend proces, vooral voor gegevensanalyse, snel pre-screening methode om de stammen positief EPS productie identificeren drastisch de efficiëntie. Voorts reagentia,verbruiksartikelen en meettijd op UHPLC UV-ESI-MS worden verminderd. Bovendien, de verschillende analytische modules, terwijl aan de ene kant maakt de werkwijze zeer betrouwbaar zijn anderzijds complicerende het manueel hanteren van meer dan twee 96-well platen in parallel, en als zodanig het volledige potentieel van de werkwijze beperkt. Om deze redenen hebben we besloten om een ​​geautomatiseerde screening platform te ontwikkelen. Daarom combineerden we de modulaire indeling van de vingerafdruk koolhydraat bestaande techniek van een volledige snelle detectiemethode van het totale suikergehalte, gebaseerd op absorptiemeting. De fenol-zwavelzuur methode vormt nog steeds de methode van de keuze voor de snelle bepaling van het totale koolhydraatgehalte van bacteriële en plantaardige polysacchariden 7,8. Deze werkwijze werd eerst beschreven door Dubois et al. 9 en aangepast voor verschillende toepassingen en steekproefomvang, zelfs voor kleine schaal in 96-well platen 10,11. de phenol-zwavelzuur methode meet het totale koolhydraatgehalte één waarde sommeren van alle monomere, oligomere en polymere koolhydraten van de monsters. Rekening houdend met deze aspecten rekening, de keuze van een geschikt kweekmedium is essentieel om deze methode toe te passen. Complexe media die oligomere of polymere koolhydraten verbindingen zoals gistextract zou kunnen leiden tot een veranderde polymeergehalte en daarom moet absoluut vermeden worden. Bovendien worden grote hoeveelheden suiker als C-bron voor de kweek van de stammen. Hoge niveaus van resterende koolhydraten uit het teeltproces kan negatief interfereren met de meting van de EPS inhoud. Daarom wordt het gebruik van gedefinieerde en zuivere suikers geadviseerd. In onze experimenten gebruikten we glucose voor het kweken van de cellen. De resterende glucose na kweek werd gereduceerd via een gelfiltratie en bepaald via een glucose-assay. Tenslotte de glucose-equivalents van de polysacchariden werd berekend door de resterende glucose na gelfiltratie van het totale koolhydraatgehalte die waargenomen waren met het fenol-zwavelzuur methode. Gelfiltratie en glucose-assay in combinatie met fenol-zwavelzuur methode betrouwbare resultaten en kunnen zijn onze eerste, volledig geautomatiseerd detectiesysteem. Twee nieuwe analytische modules in de geautomatiseerde screening platform om de hoeveelheid informatie van de EPS-detectiesysteem verhogen: de neerslag en de waarneming van een toename van de viscositeit. Vele verschillende EPS - bijvoorbeeld succinoglycan, xanthan en colon acid 12 - gemeld worden aangepast met een niet-koolhydraat pyruvaat ketaal suiker positie C4 en C6. Die pyruvaat ketalen (net zoals succinyl halfesters en uronzuren) bijdragen aan de polyanionische natuur en daarom de fysieke properties van het polymeer door interactie via tweewaardig kation bruggen 13. Om deze bepaalde polymeren identificeren de bepaling van pyruvaat werd als een aanvullende analyse module. Hierdoor wordt de informatie over de polysaccharide substituenten en hun potentieel macroscopische eigenschappen. Combineren van alle modules maakt de identificatie van verschillende EPS evenals een snelle en efficiënte bepaling van EPS producenten. Door dat de aanpak van de screening platform kan worden onderverdeeld in twee grote delen (figuur 1). In de geautomatiseerde screening (deel I) de workflow optreedt volautomatische (tabel 1) om snel preselectie EPS producerende stammen. Het koolhydraat vingerafdrukanalyse (deel II) bepaalt kwantitatief de monomeersamenstelling van de EPS door de vooraf gekozen stammen. Daardoor werd de gegevensanalyse geminimaliseerd teneinde de screening van grote stammenverzamelingen optimaliseren. Dezebiedt de mogelijkheid om 384 stammen in één geautomatiseerde screening run en met twee runs die per dag van 768 stammen per dag mogelijk zijn te analyseren. Bovendien, het koolhydraat vingerafdrukanalyse geeft een nog meer gedetailleerd overzicht van alle geïdentificeerde EPS. Dit maakt de gerichte analyse en identificatie van slechts licht verschillen EPS varianten of geheel nieuwe vergelijking met de reeds beschreven chemische structuren van EPS.

<table><tbody><tr><td>96 well deep well plate 2.0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Main-cultuur (CP 1-1 tot 1-4), evenwichtsplaten voor gel-filtratie (CP 1-6, 1-7, 2-6 en 2-7), 1:100 verdunning voor de glucose assay (CP 4-1 tot 4-4) met 990&nbsp;&micro;l ddH2O</td></tr><tr><td>Breathable Sealing Film</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>Incubatiefilm voor pre- en main-cultuur DWP</td></tr><tr><td>Aluminum Sealing Film</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200</td><td>-80 &deg;C opslagfilm voor glycerol-stock platen</td></tr><tr><td>MCA96 Nested Disposable Tips 200 &micro;l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Worktafel positie (WTP 2-1 tot 2-4)</td></tr><tr><td>A/B glass-filter-plate 1&nbsp;&micro;m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Opgeslagen op collector plaat (CP 2-1 tot 2-4)</td></tr><tr><td>96-well micro titer plate V-Bottom</td><td>Greiner Bio-One</td><td>651201</td><td>Collector plaat voor filtratie plaat (CP 2-1 tot 2-4)</td></tr><tr><td>96-well SpinColumn G-25</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>Opgeslagen op wassend DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 en 2-7)</td></tr><tr><td>96-well micro titer plate V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Collector plaat voor gel-filtratie plaat (CP 3-1 tot 3-4)</td></tr><tr><td>Nested Disposable Tips SBS 50 &micro;l tips</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Carrousel positie (CP 4-6, 4-7 en 5-1 tot 5-6)</td></tr><tr><td>Trough 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetaat buffer pH 5.6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>96-well micro titer plate F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>precipitatie 1 (CP 6-1 tot 6-4), pH-waarde (CP 7-1 tot 7-4), precipitatie 2 (CP 8-1 tot 8-4), fenol-zwavelzuur methode (CP 8-5 tot 8-8), glucose-assay (CP 9-1 tot 9-9), dummy platen (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>96-well silicon cap mat&nbsp;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Dekmat voor MTP</td></tr><tr><td>200 &micro;l pipette tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Voor handmatig hanteren</td></tr><tr><td>1,000 &micro;l pipette tips</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Voor handmatig hanteren</td></tr><tr><td>96-well-PCR micro titer plate&nbsp;</td><td>Brand</td><td>781350</td><td>Hydrolyse, PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>TPE (thermoplastic elastomer) cap mat&nbsp;</td><td>Brand</td><td>781405</td><td>Hydrolyse, PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Filter plate 0.2&nbsp;&micro;m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtratie van monsters voor UHPLC-ESI-MS analyse met een MTP collector plaat</td></tr><tr><td>Pipette Tips LHS 5-300&nbsp;&micro;l</td><td>Brand</td><td>732150</td><td>Brand LHS systeem</td></tr><tr><td>Glucose oxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Glucose-assay</td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Glucose-assay, pyruvaat-assay</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine natriumzout)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Pyruvaat-assay</td></tr><tr><td>Pyruvate oxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Pyruvaat-assay</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Pyruvaat- en glucose-assay</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Pyruvaat- en glucose-assay</td></tr><tr><td>Thiamine pyrophosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Pyruvaat-assay</td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Pyruvaat-assay</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Precipitatie</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Fenol-zwavelzuur methode</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Fenol-zwavelzuur methode</td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hydrolyse</td></tr><tr><td>Ammonium solution</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hydrolyse, PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hydrolyse, PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Phenol red&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hydrolyse, PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Methanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Acetonitril LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Ethanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>PMP-derivatisatie</td></tr><tr><td>Methyl red</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>pH-waarde</td></tr><tr><td>Robotic liquid handling system&nbsp;</td><td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>Worktafel setup in Figuur 2</td></tr><tr><td>Liquid handling station LHS</td><td>Brand</td><td>709400</td><td>Worktafel setup in Figuur 2</td></tr><tr><td>Tip-Adapter</td><td>Brand</td><td>709434</td><td>Worktafel setup in Figuur 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp;&micro;l</td><td>Brand</td><td>709416</td><td>Worktafel setup in Figuur 2</td></tr><tr><td>Adapter 60 mm</td><td>Brand</td><td>709430</td><td>Worktafel setup in Figuur 2</td></tr></tbody></table>

geautomatiseerde modular high throughput exopolysaccharide screening platform samen met highly sensitive koolhydraten fingerprint analysis

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Veel micro-organismen kunnen produceren en uitscheiden exopolysaccharides (EPS), die belangrijke gevolgen medische gebieden, voedseltoepassingen of de vervanging van petrochemische derivaten hebben. We beschrijven een analytische platform te automatiseren op een liquid handling systeem dat de snelle en betrouwbare analyse van het type en de hoeveelheid EPS geproduceerd door micro-organismen toestaat. Het stelt de gebruiker in staat om nieuwe natuurlijke microbiële exopolysaccharide producenten te identificeren en het koolhydraat vingerafdruk van de overeenkomstige polymeren binnen een dag analyseren high-throughput (HT). Met behulp van dit platform, kunnen stam collecties evenals bibliotheken van stam varianten die in technische oplossingen zouden kunnen worden verkregen worden gescreend. Het platform heeft een modulaire opbouw, die een scheiding van het protocol in twee grote delen mogelijk maakt. Ten eerste is er een geautomatiseerde screening systeem, dat verscheidene polysaccharide detectiemodules combineert: een semi-kwantitatieve analyse van viscosity vorming door een centrifugatie stap een analyse van polymeervorming via alcoholprecipitatie en de bepaling van het totale koolhydraatgehalte via een fenol-zwavelzuur transformatie. Hier is het mogelijk om op het scherm tot 384 stammen per run. Het tweede deel bevat een gedetailleerde monosaccharide analyse van alle geselecteerde EPS producenten die in het eerste deel door twee essentiële modules: de analyse van de totale monomeersamenstelling via high performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan ultraviolet en electrospray ionisatie ionenval detectie ( UHPLC-UV-ESI-MS) en de bepaling van pyruvaat als polymeer substituent (aanwezigheid van pyruvaat ketal) via enzymatische oxidatie die gekoppeld is aan een kleurvorming. Alle analytische modules van deze screening platform kunnen worden gecombineerd op verschillende manieren en aangepast aan de individuele eisen. Bovendien, ze kunnen allemaal worden handmatig verwerkt of uitgevoerd met een vloeistofverwerking systeem. Daarbij, de screening plaTForm maakt een enorme flexibiliteit om verschillende EPS identificeren.

We presenteren een geautomatiseerde modulaire methode met hoge doorvoer voor de identificatie en karakterisering van microbiële exopolysachariden op kleine schaal. Deze methode combineert een snelle preselectie om de totale hoeveelheid uitgescheiden polysacchariden te analyseren met een gedetailleerd koolhydraat-vingerafdruk om het snelle screenen van nieuw geïsoleerde bacteriestammen of hele stamcollecties mogelijk te maken.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

Het algemene doel van deze benadering is het snel en betrouwbaar screenen van microbiële exopolysacharideproducenten en de identificatie van hun koolhydraatvingerafdruk. Dit is een essentiële stap om de onontdekte diversiteit van exopolysachariden te benutten. Onze methode kan helpen om het onderzoek naar polymeren in het veld van microbiële exopolysachariden te versnellen.Het maakt de snelle identificatie mogelijk van nieuwe polysacharidevarianten met verschillende eigenschappen voor specifieke toepassingen. Het grote voordeel van deze techniek is de combinatie van verschillende exopolysacharidedetectiesystemen in een modulair en volledig geautomatiseerd screeningconcept. Dit maakt het extreem snel en betrouwbaar.Deze techniek kan ook handmatig worden uitgevoerd in laboratoria waar er geen automatiseringsplatform beschikbaar is, waardoor het gebruik ervan zeer flexibel is en kan worden aangepast aan verschillende screeningbehoeften. Deze exopolysacharide- of EPS-screeningplatform heeft een modulaire opstelling, die het mogelijk maakt om het protocol in twee hoofdgedeelten te scheiden, Geautomatiseerd screenen en Koolhydraatvingerafdruk. De eerste taak is het kweken van de stammen voor screening en het verwijderen van de cellen door centrifugatie.De stammen worden gekweekt op glucose als koolstofbron in 96-well platen bedekt met ademende afdichtingsfolie op micro titer plate shaker bij 30 graden Celsius en 1.000 RPM. Op de dag van het screen, bereid de robotwerktafel en opslageigenschappen zoals beschreven in de protocoltekst. Verwijder de ademende afdichtingsfolie van de platen en wijs de hoofdculturen toe aan de carrouselpositie 1-1 tot 1-4.Start het geautomatiseerde robotprogramma. Om cellen na cultivatie te verwijderen, breng de hoofdcultuur diep welpenplaten van de carrouseel naar de centrifuge, en centrifugeer bij 4.300 x g en 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Voor de precipitatie vóór filtratie, verplaats de micro titer platen, evenals de pH-indicator micro titer platen, van de carrouseel naar de werktafel.Breng ook de filtratieplaten over, die zorgen voor de volledige verwijdering van alle bacteriële cellen, samen met de verzamellades naar hun werktafelposities. Na centrifugatie, breng 180 microliter van de hoofdcultuursupernatant over naar de filtratieplaat. Aspirateer 150 microliter van de hoofdcultuursupernatant en doseer 50 microliter in de micro titer plaat voor precipitatie vóór filtratie, en 100 microliter naar de pH-indicatorplaat.Precipitatie van het supernatant met 2-propanol wordt uitgevoerd om EPS-productie te beoordelen. Gebruik een 12,5-milliliter multi-step pipette om handmatig 150 microliter 2-propanol toe te voegen aan elke put. Na het schudden van de micro titer platen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten bij 900 RPM, observeer visueel vezel- of vlokformaties die EPS-productie aangeven.Nadat de hoofdcultuurplaten terug zijn opgeslagen in de carrouseel, onderzoek de fermentatiebrouwsels, die een verminderde sedimentatie na centrifugatie zouden moeten vertonen. De toename van de viscositeit is een andere indicatie van EPS-productie. De tweede taak is om een volledige celverwijdering uit het viskeuze fermentatiebrouwsel te garanderen via een 96-well filtratie.Centrifugeer de filtratieplaten bij 3.000 x g en 20 graden Celsius gedurende 10 minuten. Breng de platen vervolgens terug naar hun thuispositie in de carrouseel en voer de gelijkgewichtsbepaling van de gel-filtratie uit zoals beschreven in de protocoltekst. Pipetteer vervolgens 35 microliter filtraat naar het centrum van de geëquilibreerde gel-filtratieplaat, en 50 microliter naar de micro titer plaat die wordt gebruikt voor precipitatie.Verplaats de gel-filtratieplaten naar de centrifuge, en verplaats alle andere platen van de werktafel terug naar de startposities in de carrouseel. Nadat alle platen weer in de carrouseel zijn opgeslagen, let op de zeer viskeuze supernatanten zoals aangegeven door restanten in de filterplaat. Een gebrek aan filtraat kan leiden tot valse negatieve resultaten in de volgende analytische modules.De derde taak in geautomatiseerd screenen is het verwijderen van de resterende monomere suikers uit het groeimedium via een 96-well gelfiltratie. Centrifugeer de gelfiltratieplaten bij 1.000 x g en 20 graden Celsius gedurende twee minuten. Bereid de werktafel voor via de robotische manipulator voor het verwerken van de gelfiltraten.Om de resterende glucose na gelfiltratie te detecteren, gebruik 50-microliter tips om 25 microliter dubbel gedistilleerd water over te brengen naar een nieuwe micro titer plaat. Aspirateer 20 microliter dubbel gedistilleerd water, vijf microliter lucht en 5 microliter gel-filtraat, en doseer in dezelfde plaat. Neem 200-microliter tips en aspireer 50 microliter glucose-assayreagens-mix van werktafelpositie 1-2 om de eerste test te starten.Verplaats de micro titer platen naar de incubator. Na 30 minuten incubatie, verplaats de platen van de incubator naar de micro titer lezer, en neem de absorptie op bij 418 en 480 nanometer. Om het totale koolhydraatgehalte te bepalen door de fenol-zwavelzuurmethode, pipetteer 20 microliter gel-filtraat naar de micro titer platen.Verwijder de platen handmatig uit de carrouseel en plaats ze in de vloeistofbhandelingsstation. Neem de kalibratieplaat op met 20 microliter van verschillende glucoseconcentraties in drievoudig. Plaats een afvalcontainer op positie 1, een 300-microliter tipbox op positie 2, en een 250-milliliter bak met 110 milliliter vers bereid fenol-zwavelzuur op positie 3.Gebruik een 8-kanaals pipetteerder met 300-microliter tips om 180 microliter fenol-zwavelzuur over te brengen naar elke rij van alle platen. Bedek alle micro titer platen met deksels en meng door gedurende vijf minuten bij 900 RPM bij kamertemperatuur te schudden. Incubeer gedurende 35 minuten bij 80 graden Celsius in een oven voor de kleurreactie.Nadat de platen zijn afgekoeld onder een afzuigkap, meet u de extinctie bij 480 nanometer. Stammen uit het geautomatiseerde screenen worden aangeduid als EPS-positief als ze aan ten minste twee van de volgende drie criteria voldoen. Viscositeitscontrol

automated-modular-high-throughput-exopolysaccharide-screening

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een snelle manier is beschreven om inzicht te krijgen in de structuur van de polysacchariden in een extracellulaire matrix. De methode maakt gebruik van de specificiteit van glycosylhydrolases en de gevoeligheid van massaspectrometrie waarmee minieme hoeveelheden van de materialen worden geanalyseerd. Deze techniek is aan te passen aan direct worden gebruikt op weefsel zelf.

Oligo Mass Profiling (Olimp) van extracellulaire polysacchariden

Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays

In this video, we demonstrate a high throughput assay for carbohydrate-active enzyme screening using insoluble chromogenic polymer hydrogel substrates. The enzyme degrades these substrates into a soluble colored product that can be quantified by measuring the color intensity of the product.

Chromogenic Polymer Hydrogel-Based Enzyme Screening Assay: A High Throughput Method to Screen the Carbohydrate-Active Enzymes Using Synthetic Substrates

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Een hoogdoorvoerprotocol werd ontwikkeld voor gecombineerde proteomics en glycomics zuivering en LC-MS/MS kwantificering in plasma. Deamidatie-analyse van N-gekoppelde glycosyleringsmotieven was specifiek voor degekoppelde sites. Nauwkeurige kwantificering van N-glycanen werd bereikt door filterondersteunde N-glycaanscheiding te koppelen aan de individualiteitsnormalisatie bij het labelen met glycaanhydrazide-tagsstrategie.

Een kwantitatieve Glycomics en Proteomics Combined Purification Strategy

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Hier beschrijven we de high-throughput detectie en kwantificering van fucosylated menselijke melk oligosacchariden (zorgorganisaties) met behulp van een geheel-cel biosensor. We ook laten zien hier, de aanpassing van dit platform naar analyse van HMO productie stammen, gericht op het verbeteren van de signaal / ruisverhouding.

Analyse van de Fucosylated mens melk trisacharide in biotechnologische Context, waarbij het genetisch gecodeerd biosensoren

Microarray polymer profiling (MAPP) is een high-throughput techniek voor samenstellingsanalyse van glycanen in biologische monsters.

Microarray Polymer Profiling (MAPP) voor high-throughput glycaananalyse

Eerder werd al een systeem ontwikkeld voor de geautomatiseerde en snelle analyse van glycanen op eiwitten. Dit artikel presenteert het protocol voor "glyco-kwalitatieve analyse", geoptimaliseerd voor een breed spectrum van gebruikers, zoals degenen die zich bezighouden met het analyseren van glycaanstructuren in biofarmaceutica en andere glycoconjugaatmaterialen.

Snelle glyco-kwalitatieve beoordeling van recombinante eiwitten met behulp van een volledig geautomatiseerd systeem

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een geautomatiseerd modulair high-throughput screeningsplatform voor exopolysacchariden met gevoelige koolhydraatvingerafdruk-analyse. Deze methode versnelt het identificeren van nieuwe bacteriële stammen aanzienlijk.

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis (Video) | JoVE Journal

Geautomatiseerde Modular High Throughput exopolysaccharide Screening Platform Samen met Highly Sensitive Koolhydraten Fingerprint Analysis

Meer video's verkennen