Name: Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 4 s
Description: Leer hoe je ex vivo darmzakken gebruikt om de mucosale permeabiliteit te beoordelen in muismodellen voor gastro-intestinale aandoeningen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van de epitheliale barrièrefunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 en een Hunter Medical Research Institute-subsidie gesponsord door Sparke Helmore/NBN Triathlon en de Estate of the late Leslie Kenneth McFarlane.

Alle dierlijke werk op dit protocol wordt uitgevoerd met strikte naleving van de Universiteit van Newcastle Animal Ethics Committee goedgekeurde procedures. 1. Voorbereiding van de instrumenten, Cultuur en Media Dishes <ol><li> Voorverwarmen Media 199 (TC199) of Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) pers 37 ° C. Pre-oxygenaat het medium door doorborrelen met 95% O2 / 5% CO2. Controleer of het medium een ​​uiteindelijke pH van 7,3. </li><li> Bereid hechtdraad door het snijden van twee 5 cm secties voor elke zak. Loop de hechtingen in een ongesloten knoop. </li></ol> 2. Dissection en voorbereiding van het maagdarmkanaal <ol><li> Terugtrekken vast voedsel 12 uur voor euthanasie. Desgewenst plaatst dieren voedende gel supplementen gedurende deze tijd. </li><li> Euthanaseren muizen door natriumpentobarbiton overdosering ([200 mg / kg], intraperitoneale injectie), gevolgd door cervicale dislocatie overeenkomstig institutionele ethische protocols en spuit 70% ethanol op de buik en borst. </li><li> Met behulp van een schaar, maken een horizontale incisie in het midden van de buik en bloot het buikvlies. </li><li> Ga verder te scheiden en het verwijderen van het maagdarmkanaal door het snijden van de bovenste dunne darm van de maag naar de pyloric sluitspier en het snijden van de dikke darm bij de anus. Gebruik een tang om verwijder voorzichtig het mesenterium. Plaats het darmkanaal in voorverwarmde, geoxygeneerd medium. </li><li> Identificeer de sectie darm worden beoordeeld op doorlatendheid (figuur 1) en knip dit gedeelte los van de rest van het darmkanaal. <ol><li> Om de samenhang tussen de dieren te behouden, delen van de twaalfvingerige darm en jejunum opzichte meten aan de maag, en secties van de dikke darm en de dunne darm ten opzichte van te meten aan de blindedarm. </li><li> Bij het selecteren weefselsegmenten, let op de aanwezigheid van mucosa geassocieerde lymfoïde weefsels zoals plaques van Peyer. Deze kunnen worden geïdentificeerd als klein knikjedules aan de serosale zijde van het lumen. </li><li> Met behulp van een 1 ml injectiespuit voorzichtig spoelen van de luminale inhoud van de intestinale segment in een petrischaal met voorverwarmde PBS (37 ° C). Deze fecale inhoud kan worden weggegooid of opgeslagen bij -80 ° C voor verdere analyse zoals gewenst. </li></ol></li></ol> 3. Bereiding van intestinale Sacs <ol><li> Bereid een 1 ml spuit met een 300 ui volume van de testverbinding of molecuul. Voor mucosale integriteit, een 1 mg / ml oplossing van FITC-Dextran M.Wt. 4400 kan worden gebruikt. Probes variërend van 4,400-70,000 Da in grootte kan worden gebruikt voor verhoogde gevoeligheid. Veilig te passen een klein dier vasculaire katheter op de injectiespuit. </li><li> Maatregel 5 cm vanaf de opening van de intestinale segment en bind het segment stevig afgesloten met een hechting-loop op dit punt. Plaats voorzichtig een vooraf gebonden hechting-lus rond de opening van de darm en plaats de afgestompte katheter. Trek de strop gesloten om de intestinale segment beveiligenen laat de 300 ui volume van de spuit in de darm die op de oplossing wordt geïnjecteerd. </li><li> Verwijder voorzichtig de catheter tegelijkertijd trekt de hechtdraad strop om de sluiting van de intestinale zak te beveiligen. Snijd de intestinale zak los van de darm en plaats in een 50 ml conische buis gevuld met 20 ml van geoxygeneerd medium, voorverwarmd tot 37 ° C. </li></ol> 4. Meting van de doordringbaarheid <ol><li> Plaats conische buisjes met de intestinale zakjes in een verwarmd waterbad ingesteld op 37 ° C. Op 0, 30, 60, 90 en 120 min tijdstippen raadpleeg 100 pi monster van de conische buis overgebracht in een plaat met 96 putjes, het volume 100 ul vers medium telkens vervangen. </li><li> Na het eindmonster genomen opengesneden zakken op de plaats van hechting en de lengte van het segment, het blootstellen van het slijmvliesoppervlak. </li><li> Meet de lengte en breedte van elk darmsegment. Als desirood, snap bevriezen de segmenten en bewaar bij -80 ° C voor het eiwit of biochemische analyse, of als alternatief, op te slaan in RNA stabilisatie oplossing voor moleculaire testen. </li><li> Construct een standaard curve van log verdunningen FITC-gemerkte moleculen van 1 tot 1 x 10 -6. </li><li> Meet monsters en standaarden voor FITC op een fluorescerende plaat lezer, FITC excitatie / emissie: 495 nm / 519 nm. </li></ol> 5. Berekening van de schijnbare permeabiliteit voor elk individu Intestinal Sac <ol><li> Omzetten tijdseenheden naar sec. </li><li> Voor elk tijdstip, bereken de cumulatieve concentratie Q Q t = (C t * r V) + (Qt som * Vs) Waar: Q t = Cumulatieve concentratie op tijdstip t Ct = concentratie op tijdstip t Vr = Volume aan ontvangerzijde Q t som = som van alle voorgaande Q t Vs =Volume bemonsterd </li><li> Plot Q versus tijd (T) en het berekenen van de helling: AQ / At </li><li> Bereken de schijnbare permeabiliteit (P app) P app = (AQ / AT) / (A * Co), Waar: A = Oppervlak van weefsel C 0 = Beginconcentratie </li></ol>

<ol><li>Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+Integrin-Mediated+Epithelial+Restitution+during+Mucosal+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation.</a> Frontiers in immunology. 4, 272(2013).</li>
<li>Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+peptides+in+innate+immunity+of+the+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial peptides in innate immunity of the human intestine.</a> Journal of gastroenterology. 38, 717-726 (2003).</li>
<li>Robinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+protection+by+hypoxia-inducible+factor+prolyl+hydroxylase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mucosal protection by hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase inhibition.</a> Gastroenterology. 134, 145-155 (2008).</li>
<li>Feighery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intestinal+permeability+in+rats+subjected+to+traumatic+frontal+lobe+percussion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+trauma%22%5BJournal%5D)">Increased intestinal permeability in rats subjected to traumatic frontal lobe percussion brain injury.</a> The Journal of trauma. 64, 131-137 (2008).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride-led+disruption+of+the+intestinal+mucous+layer+impedes+Salmonella+invasion%3A+evidence+for+an+%27enteric+tear%27+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+physiology+and+biochemistry+%3A+international+journal+of+experimental+cellular+physiology%2C+biochemistry%2C+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Chloride-led disruption of the intestinal mucous layer impedes Salmonella invasion: evidence for an 'enteric tear' mechanism.</a> Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 28, 743-752 (2011).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epithelial+innate+immunity+to+systemic+protection+afforded+by+prolyl+hydroxylase+inhibition+in+murine+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+immunology%22%5BJournal%5D)">Contribution of epithelial innate immunity to systemic protection afforded by prolyl hydroxylase inhibition in murine colitis.</a> Mucosal immunology. 7, 114-123 (2014).</li>
<li>Sourisseau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+PCNA+and+cyclin+D1+expression+and+epithelial+morphogenesis+by+the+ZO-1-regulated+transcription+factor+ZONAB%2FDbpA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of PCNA and cyclin D1 expression and epithelial morphogenesis by the ZO-1-regulated transcription factor ZONAB/DbpA.</a> Mol Cell Biol. 26, 2387-2398 (2006).</li>
<li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 91-106 (2003).</li>
<li>Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+everted+gut+sac+as+a+simple+and+accurate+technique+to+measure+paracellular+transport+across+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+drug+metabolism+and+pharmacokinetics%22%5BJournal%5D)">An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine.</a> European journal of drug metabolism and pharmacokinetics. 23, 313-323 (1998).</li>
<li>Marks, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Delivery+of+Prolyl+Hydroxylase+Inhibitor%3A+AKB-4924+Promotes+Localized+Mucosal+Healing+in+a+Mouse+Model+of+Colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Oral Delivery of Prolyl Hydroxylase Inhibitor: AKB-4924 Promotes Localized Mucosal Healing in a Mouse Model of Colitis.</a> Inflammatory bowel diseases. 21, 267-275 (2015).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor-dependent+regulation+of+platelet-activating+factor+receptor+as+a+route+for+gram-positive+bacterial+translocation+across+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor-dependent regulation of platelet-activating factor receptor as a route for gram-positive bacterial translocation across epithelia.</a> Mol Biol Cell. 21, 538-546 (2010).</li>
<li>Brayden, D. J., Bzik, V. A., Lewis, A. L., Illum, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CriticalSorb+promotes+permeation+of+flux+markers+across+isolated+rat+intestinal+mucosae+and+Caco-2+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">CriticalSorb promotes permeation of flux markers across isolated rat intestinal mucosae and Caco-2 monolayers.</a> Pharmaceutical research. 29, 2543-2554 (2012).</li>
<li>Hubbard, D., Ghandehari, H., Brayden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+transport+of+PAMAM+dendrimers+across+isolated+rat+jejunal+mucosae+in+ussing+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Transepithelial transport of PAMAM dendrimers across isolated rat jejunal mucosae in ussing chambers.</a> Biomacromolecules. 15, 2889-2895 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+ex+vivo+intestinal+tissue+models+to+measure+mucoadhesion+of+poly+%28methacrylate%29+and+N-trimethylated+chitosan+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">In vitro and ex vivo intestinal tissue models to measure mucoadhesion of poly (methacrylate) and N-trimethylated chitosan polymers.</a> Pharmaceutical research. 22, 38-49 (2005).</li>
<li>Maher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+intestinal+absorption+enhancement+and+local+mucosal+toxicity+of+two+promoters.+I.+Studies+in+isolated+rat+and+human+colonic+mucosae%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutical+sciences+%3A+official+journal+of+the+European+Federation+for+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evaluation of intestinal absorption enhancement and local mucosal toxicity of two promoters. I. Studies in isolated rat and human colonic mucosae.</a> European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 38, 291-300 (2009).</li>
<li>Balda, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+dissociation+of+paracellular+permeability+and+transepithelial+electrical+resistance+and+disruption+of+the+apical-basolateral+intramembrane+diffusion+barrier+by+expression+of+a+mutant+tight+junction+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Functional dissociation of paracellular permeability and transepithelial electrical resistance and disruption of the apical-basolateral intramembrane diffusion barrier by expression of a mutant tight junction membrane protein.</a> The Journal of cell biology. 134, 1031-1049 (1996).</li>
<li>Behrens, I., Stenberg, P., Artursson, P., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+lipophilic+drug+molecules+in+a+new+mucus-secreting+cell+culture+model+based+on+HT29-MTX+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Transport of lipophilic drug molecules in a new mucus-secreting cell culture model based on HT29-MTX cells.</a> Pharmaceutical research. 18, 1138-1145 (2001).</li>
<li>Stefka, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+protect+against+food+allergen+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria protect against food allergen sensitization.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 13145-13150 (2014).</li>
<li>Keely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+fluid+transport+regulates+bacterial-epithelial+interactions+and+significantly+shifts+the+murine+colonic+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+microbes%22%5BJournal%5D)">Activated fluid transport regulates bacterial-epithelial interactions and significantly shifts the murine colonic microbiome.</a> Gut microbes. 3, 250-260 (2012).</li>
<li>Barrett, K. E., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+secretion+by+the+intestinal+epithelium%3A+molecular+basis+and+regulatory+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Chloride secretion by the intestinal epithelium: molecular basis and regulatory aspects.</a> Annual review of physiology. 62, 535-572 (2000).</li>
<li>Soni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat%2C+ovine+and+bovine+Peyer%27s+patches+mounted+in+horizontal+diffusion+chambers+display+sampling+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Rat, ovine and bovine Peyer's patches mounted in horizontal diffusion chambers display sampling function.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 115, 68-77 (2006).</li>
<li>Justino, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+role+of+Lactobacillus+acidophilus+on+inflammation+and+gastric+dysmotility+in+intestinal+mucositis+induced+by+5-fluorouracil+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+chemotherapy+and+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulatory role of Lactobacillus acidophilus on inflammation and gastric dysmotility in intestinal mucositis induced by 5-fluorouracil in mice.</a> Cancer chemotherapy and pharmacology. , (2015).</li>
<li>Tran, C. D., Sundar, S., Howarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+zinc+supplementation+and+methotrexate-induced+small+intestinal+mucositis+in+metallothionein-knockout+and+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+biology+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Dietary zinc supplementation and methotrexate-induced small intestinal mucositis in metallothionein-knockout and wild-type mice.</a> Cancer biology & therapy. 8, 1662-1667 (2009).</li>
<li>Musch, M. W., Wang, Y., Claud, E. C., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubiprostone+decreases+mouse+colonic+inner+mucus+layer+thickness+and+alters+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+diseases+and+sciences%22%5BJournal%5D)">Lubiprostone decreases mouse colonic inner mucus layer thickness and alters intestinal microbiota.</a> Digestive diseases and sciences. 58, 668-677 (2013).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.

Hier hebben we de isolatie en bereiding van intestinale zakjes gedetailleerde mucosale barrièrefunctie ex vivo te beoordelen. Intestinale sac voorbereidingen zijn in de eerste plaats zijn gebruikt in het farmaceutisch onderzoek, onderzoek naar de absorptie van kandidaat medicijnen over de darm. Echter, deze test even goed geschikt voor de studie van darmziekten. Darmdoorlaatbaarheid kan sterk verschillen per regio en site-specifieke beoordeling van de permeabiliteit zorgt voor een beter begrip van het regionale...

De intestinale epitheliale barrière van het maagdarmkanaal is een mucosaal oppervlak geraamd op 400 m 2 in de volwassen mens. Derhalve wordt voortdurend blootgesteld aan uitdaging van microben, opgenomen geneesmiddelen, nutriënten en bacteriële toxines. De host moet niet alleen onderscheid maken tussen het aanvaardbare commensale bacteriën en potentiële pathogenen, maar beletten dat deze soorten en hun uitgescheiden moleculen die de epitheliale barrière, terwijl tegelijkertijd waardoor opname van voedingsstoffen. Zo is de rol van het darmepitheel is om als een selectieve barrière voor het luminale inhoud 1. Dit gebeurt in hoofdzaak door de epitheliale aangeboren afweersysteem op het slijmvlies, die door een reagerend biologisch systeem bestaande uit constitutieve en induceerbare mechanismen 2 optreedt. Verlies van epitheliale barrièrefunctie een pathologie die kenmerkend is voor een aantal gastro-intestinale ziekten. In vivoonderzoek van epitheliale barrièrefunctie kan worden beoordeeld door middel van orale sondevoeding van een tracer molecule en daaropvolgende serum analyse 3. Deze techniek geeft geen indicatie van de plaats van barrière disfunctie. In vitro en ex vivo bepaling van transepithele weerstand gebruik Transwell systemen 3 respectievelijk Ussing kamers 4,5, worden gewoonlijk gebruikt als surrogaat markers van epitheliale barrièrefunctie, maar missen de bijdragende ziekte fysiologie van diermodellen 6. In dit protocol beschrijven we een ex vivo model weefselbereiding die direct en gelokaliseerde evaluatie van intestinale integriteit en die kunnen worden gebruikt om mucosale barrièrefunctie beoordeeld op meerdere niveaus mogelijk maakt. Belangrijk is dat deze techniek worden toegepast op diermodellen voor de ziekte, of kan farmacologisch worden gemanipuleerd om grondig afvragen van mucosale barrière disfunctie.

<table><tbody><tr><td>Dekantel&nbsp; Non-absorbable Silk suture</td><td>Braintree Scientific</td><td>SUT-S 116</td><td></td></tr><tr><td>Media 199 (TC199)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11043-023</td><td>Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>21063-045</td><td>Geen fenolrode kleurstof omdat deze interfereert met fluorescentie</td></tr><tr><td>N-acetylcysteïne</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Gebruik bij 10 mM in media</td></tr><tr><td>Vasculair katheter voor kleine dieren: Physiocath</td><td>Data Sciences International</td><td>277-1-002</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 4.400 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-4</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 20.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-20</td><td></td></tr><tr><td>FITC-Dextran 70.000 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD-70</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo intestinale sacs mucosale permeabiliteit beoordelen modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

De epitheliale barrière de eerste aangeboren verdediging van het maagdarmkanaal en selectief regelt vervoer van het lumen aan het onderliggende weefsel compartimenten, beperkt het transport van kleine moleculen door het epitheel en bijna volledig verbod epitheliale macromoleculaire transport. Deze selectiviteit wordt bepaald door het slijmvlies gellaag, die het transport van lipofiele moleculen en zowel de apicale receptoren en strak junctional eiwitcomplexen van het epitheel beperkt. In vitro celcultuur modellen van het epitheel zijn handig, maar als voorbeeld, ze missen de complexiteit van de interacties tussen de microbiota, slijm-gel, epitheel en het immuunsysteem. Anderzijds kan in vivo evaluatie van intestinale absorptie of permeabiliteit worden uitgevoerd, maar deze assays meten totale gastrointestinale absorptie, zonder vermelding van plaatsgebondenheid. Ex vivo permeabiliteit assays met &quot;intestinale sacs&quot;; een snelle en gevoelige werkwijze voor het meten ofwel globaal intestinale integriteit of vergelijkende transport van een specifiek molecuul, met het extra voordeel van intestinale plaatsgebondenheid. Hier beschrijven we de bereiding van intestinale zakjes op doorlatendheid studies en de berekening van de schijnbare permeabiliteit (P app) van een molecuul in de darmwand. Deze techniek kan worden gebruikt als een methode voor de absorptie of regionale epitheliale barrière disfunctie in dierlijke modellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken.

Dit protocol kan worden gebruikt om de regionale veranderingen in de intestinale barrièrefunctie in diermodellen van gastro-intestinale aandoeningen te onderzoeken. Door meting van de flux van een paracellulaire probe over het mucosale oppervlak op verschillende gebieden van het maagdarmkanaal 7, kan de integriteit van de epitheliale tight junctions worden beoordeeld. Bovendien, door het variëren van de aard van de paracellulaire probe op grootte (figuur 2) of...

Dit protocol beschrijft het gebruik van uitgesneden darmweefselpreparaten of 'darmzakken' als een ex vivo model van de darmwandfunctie. Dit model kan worden gebruikt om de integriteit van zowel de epitheliale barrière als de slijmvlieglaag op specifieke darmlocaties in diermodellen van spijsverteringsziekten te beoordelen.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Het algemene doel van deze procedure is om de gelokaliseerde intestinale integriteit in diermodellen van gastro-intestinale ziekten te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over gastro-intestinale ziekten, zoals of de mucosale integriteit verloren is gegaan of dat er een toename is in de opname van een specifiek molecuul of bacteriën tijdens de ziekte. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om specifieke gebieden binnen het maagdarmkanaal te beoordelen. Om het maagdarmkanaal voor te bereiden, begint u met het besproeien van de buik en thorax van de muis met 70% ethanol en gebruikt u een schaar om een horizontale incisie in het midden van de buik te maken om het peritoneum bloot te leggen. Snijd vervolgens de bovenste dunne darm bij de pylorus los van de maag en de dikke darm bij de anale opening. Gebruik daarna een pincet om het mesenterium voorzichtig te verwijderen en plaats het darmstelsel in voorverwarmd, zuurstofrijk medium. Identificeer het gebied waarvan de permeabiliteit moet worden beoordeeld, waarbij de secties van het duodenum en jejunum ten opzichte van de maag worden gemeten, en de secties van het colon en ileum ten opzichte van het caecum, om consistentie tussen de proefdieren te waarborgen. Let op de aanwezigheid van mucosa-geassocieerde lymfoïde weefsels, zoals de plaques van Peyer, die kunnen worden geïdentificeerd als kleine knobbeltjes aan de serosale zijde van het lumen. Snijd vervolgens de geselecteerde sectie af en gebruik een spuit van 1 ml om de luminale inhoud van het segment voorzichtig in een petrischaal met 37

ex-vivo-intestinal-sacs-to-assess-mucosal-permeability-models

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Huidige behandelingen van inflammatoire darmziekten (IBD) zijn gericht op het verlichten van de ziektesymptomen, maar kan ernstige bijwerkingen veroorzaken. Zo worden alternatieve strategieën onderzocht in dierlijke modellen colitis. Hier leggen we uit hoe de gunstige effecten van voedingssupplementen op de klinische IBD borden worden geanalyseerd in een dergelijk colitis model.

Het analyseren van gunstige effecten van voedingssupplementen op darmepitheel Barrier Functies tijdens de Experimental Colitis

Twee methoden worden hier voorgesteld om te bepalen van intestinale barrièrefunctie. Een epitheliale meter (volt/ohm) wordt gebruikt voor metingen van de elektrische weerstand van de transepithelial van gekweekte epithelen rechtstreeks in weefselkweek wells. Bij muizen, wordt de FITC-dextran maagsonde methode gebruikt om te bepalen de intestinale permeabiliteit in vivo.

In Vitro en In Vivo benaderingen te bepalen van intestinale epitheliale cel permeabiliteit

De toegang van voedingsstoffen, microbiota metabolieten en medicijnen voor het verkeer wordt geregeld door de darm-bloed-barrière (GBB). Beschrijven we een directe methode voor het meten van de GBB permeabiliteit in vivo, die, in tegenstelling tot veelgebruikte indirecte methoden, wordt vrijwel niet beïnvloed door de functies van lever en nieren.

Een In Vivo -methode voor het uitrekenen van de Gut-bloed barrière en lever metabolisme van Microbiota producten

Hier beschrijven we een techniek om de barrière-integriteit van kleine darmorganoïden te kwantificeren. Het feit dat de methode is gebaseerd op levende organoïden maakt het sequentiële onderzoek van verschillende barrière-integriteit modulerende stoffen of combinaties daarvan op een tijdopgeloste manier mogelijk.

Onderzoek naar darmbarrière afbraak in levende organoïden

Gebruikmakend van intravitale microscopie, maakt de hier gepresenteerde methode real-time visualisatie van darmeppitheelcelvergieten bij levende dieren mogelijk. Daarom is geigreerd darmslijmvlies (acriflavine en rhodamineB-dextran) van verdoofde muizen afgebeeld tot eencellige resolutie met behulp van confocale microscopie.

Een intravitale microscopie-gebaseerde benadering om darmdoorlatendheid en epitheelcelvergieten prestaties te beoordelen

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

Het huidige protocol schetst een methode die lucifergeel gebruikt in een apicale enteroïde model om de darmdoorlaatbaarheid te bepalen. Deze methode kan worden gebruikt om paracellulaire permeabiliteit te bepalen bij enteroïden die inflammatoire darmziekten modelleren, zoals necrotiserende enterocolitis.

Intestinale permeabiliteit bepalen met lucifergeel in een apical-out enteroïde model

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Dit protocol beschrijft een screeningsplatform met vers geïsoleerde porcine buccale epitheelweefselmucosae om peptidepermeatie te evalueren. De methode integreert permeatie van een GLP-1RA in aanwezigheid van een permeatieversterker uit oplossingen, Hilltop-kamers en films in Franz Diffusiecellen, en 3D-geprinte inserts, vergezeld van histologische mucosale beoordeling.

Een gestandaardiseerd ex vivo porcine oromucosale model voor het evalueren van peptidefluxen

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

Leer hoe je ex vivo darmzakken gebruikt om de mucosale permeabiliteit te beoordelen in muismodellen voor gastro-intestinale aandoeningen. Deze methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van de epitheliale barrièrefunctie.

Ex Vivo Intestinale Sacs mucosale permeabiliteit beoordelen Modellen van gastro-intestinale aandoeningen

Meer video's verkennen