Name: Microbiologisch Induced calciet Neerslag gemedieerd door Sporosarcina pasteurii (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer microbiologisch geïnduceerde calcietprecipitatie met Sporosarcina pasteurii voor biomineralisatieonderzoek. Deze gestandaardiseerde methode versterkt de druksterkte van materialen door calciumcarbonaat neerslag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij wensen de partners in de Helmholtz-Alberta Initiatief, de Helmholtz Association en de University of Alberta te erkennen voor de ondersteuning die het resultaat is van deelname aan deze samenwerking. Onderzoeksfinanciering wordt verstrekt door de Initiative and Networking Fund van de Helmholtz Association, de deelnemende Helmholtz Centers en door de Regering van Alberta via Alberta Environment's ecoTrust-programma.
Dr. Tanushree Ghosh wordt dankbaar erkend voor haar kritische input in een aantal cruciale stadia.

OPMERKING: Voer de experimentele protocollen in de hieronder beschreven volgorde. De bacteriecultuur protocol wordt besproken in paragraaf 1 (zie ook figuur 1). Hoofdstuk 2 beschrijft het protocol voor het verrijken van het kweekmedium met behulp van externe toevoegingen. Hoofdstuk 3 beschrijft de protocollen voor multi-mode microscopie. Gewichten van de afzonderlijke componenten kunnen worden gemeten met een analytische balans. Volume van elke oplossing kan worden gemeten met een volumetrische fles. LET OP: De juiste bioveiligheid protocollen moeten worden gevolgd voor de afdelingen 1 - 2. Raadpleeg voor meer informatie de institutionele veiligheid kantoor. 1. bacteriekweek <ol><li> Cultuur Bacteriën - Agar Plate Medium Voorbereiding <ol><li> Monteren apparatuur en ingrediënten zoals Petrischalen, kolf, Tris-base, HCl, agar, Millipore water, pH-meter etc.Sterilize alle containers autoclaaf bij 121 ° C voor gebruik. </li><li> Bereid 1 liter 0,13 M waterige oplossing van Tris-buffer door het mengen van 15,75 g Tris-base met 1 L van Millipore water. Om de pH van de oorspronkelijke oplossing (pH 10,4) toe te verlagen 2800 pl HCl (50% concentratie). Controleer continu met behulp van een pH-meter tot pH = 9 ingesteld. </li><li> Verdeel de 1 L bufferoplossing in twee delen als volgt: <ol><li> Neem 800 ml van deze oplossing. Verdeel het tevens in twee delen van elk 400 ml. Ontbinden 8 g (NH 4) 2 SO 4 een oplossing en 16 g gistextract aan het andere oplossing. </li><li> Neem de resterende (200 ml) oplossing en verdeel het weer in twee delen van elk 100 ml. Meng 2 g (NH 4) 2 SO 4 een. Voeg 4 g gistextract en 4 g agar naar de andere. </li></ol></li><li> Autoclaaf de 4 oplossingen afzonderlijk na het verpakken van de respectievelijke kolven in Al folie en plakken autoclaaf tapes. OPMERKING: Indien een benchtop autoclaaf eenheid wordt gebruikt, moet het volume ingesteld op 500 ml (temperatuur en druk automaattisch bepaald naar gelang van volume). </li><li> Na het nemen van hen uit de autoclaaf, stellen de twee 400 ml oplossingen opzij voor stap 1.3.1 (hieronder). Meng de twee 100 ml oplossingen van een 200 ml oplossing hebben. Giet het mengsel in 10-12 petrischalen. </li></ol></li><li> Cultuur Bacteriën - Agar Plate Monstervoorbereidingstesten <ol><li> Verwijder de bacteriële voorraad van de vriezer (-80 ° C) en laat het ontdooien. Na goed te ontdooien, plaatst de bacteriële voorraad en de agarplaat in een bioveiligheid kap. </li><li> Selecteer de micropipet van de kleinste beschikbare afmeting (0,5-10 pi is een goede keuze) aan de tip met de Sporosarcina pasteurii voorraad teisteren. Streak een agar plaat met de micropipet tip. Plaats de weggeschoten agarplaat in een non-schudden incubator bij 31 ° C gedurende 48 uur. </li><li> Na 48 uur, verwijder de plaat uit de incubator en visueel te onderzoeken voor het bestaan ​​van enkele kolonies. Als er geen enkele kolonies, plaats deze dan in tHij incubator voor een ander 24 uur. </li><li> Herhaal dit totdat enkele kolonies gedetecteerd. Niet meer dan 7 dagen trial. Opmerking: als enkele kolonies niet verschijnen, zelfs na een week, dan is de conclusie dat de maatregelen niet goed zijn gevolgd en het hele proces moet worden herhaald vanaf stap 1. </li></ol></li><li> Cultuur Bacteriën - Final Monstervoorbereidingstesten <ol><li> Meng 400 ml beide oplossingen (Tris buffer + (NH 4) 2 SO 4 en Tris buffer + gistextract (1.5.1) samen voor het verkrijgen van een 800 ml oplossing. Breng 125 ml van deze oplossing in een kolf. </li><li> Voer een visueel onderzoek van het oppervlak van de agarplaat om gebieden te identificeren met een hoge concentratie van enkele kolonies. Zachtjes nudge en breek een van de kolonies met een micropipet tip. </li><li> Dompel dezelfde micropipet tip in de ml fles 125 en roer het grondig aan dat er voldoende aantal cellen voor robuuste vermenigvuldiging te waarborgen krijgen overgedragen. Plaats de kolf in een schudincubator bij 150 rpm, 30 ° C gedurende 2-3 dagen. Na 2-3 dagen, verwijder de kolf uit de incubator. </li></ol></li><li> Cultuur Bacteriën - Final celgetal <ol><li> Voer seriële verdunning van de niet-verdunde kweekoplossing behulp PBS tot een verdunning van ten minste tien miljoen (10 -7) bereiken waarborgen telbare enkele kolonies verschijnen. Trekken zeven parallelle equidistante lijnen op één van de agar-platen. <ol><li> Doe dit door trekken vette lijnen aan de onderkant van de petrischaal prominente voldoende toegankelijk van boven zijn. Drop 3 kleine druppels niet-verdunde oplossing in één segment. Voeg 1 ml onverdunde oplossing van 9 ml van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een 1:10 verdunning te verkrijgen. </li></ol></li><li> Neem een ​​kleine hoeveelheid (~ 0,1 ml) van deze onlangs verdunde oplossing met een pipet en neerzetten 3 meer kleine druppels op het volgende segment. Zet de pas verdunde oplossing naar een nieuwe kolf en verder verdunde tienmaal (10x) vantoevoegen van PBS. Dit brengt vaststelling van de verdunning tot 10 -2 of 1: 100. <ol><li> Gebruik 1: 100 oplossing in het volgende segment. Herhaal dit proces hij met kleine volumes van de vers verdunde oplossingen door ze achtereenvolgens overbrengen van nieuwe flessen en continu verdunnen tienvoudige (10x) samen met PBS steeds meer verdunde monsters van 10 -3 en 1 te verkrijgen: 1000 helemaal tot 10 -7 of 01:10 miljoen in het laatste segment. </li></ol></li><li> Uitvoeren kolonievormende eenheid (CFU) kiemgetal het aantal cellen aanwezig in de agar kiemgetal na incuberen van de plaat gedurende 1-2 dagen bij 31 ° C. Dit geeft een kwantitatieve maat voor het aantal bacteriën in het onverdunde monster. OPMERKING: De CFU waarde wordt gemeten op basis van het vermogen van het systeem om tot kolonies geven onder de specifieke omstandigheden van voedingsmedium, temperatuur en tijd ervan uitgaande dat elke kolonie afzonderlijk en opgericht door een levensvatbare microbiële cel. </li><li> zeehondde Petrischalen met zelfdichtende film en bewaar overige items in de koelkast voor toekomstig gebruik. </li></ol></li></ol> 2. Protocol voor de verrijking van Nutrient te Neerslag Accelerate <ol><li> Overdracht 9 ml van de bereide vloeistof (cellen + medium) in verschillende gesteriliseerde centrifugebuizen van 10 ml elk volume. </li><li> Bereid een 100 ml voorraadoplossing van de externe verrijking bestaat uit vier componenten in de volgende concentraties in vers medium: Ureum: 2 g / l, Ammoniumchloride: 1 g / l, Natriumbicarbonaat: 212 mg / L, calcium chloride: 280 mg / L. Meet zorgvuldig alle ingrediënten met een analytische balans en meng alles behalve ureum vers medium in een beker en plaats in de autoclaaf (121 ° C, 15 psi, 15 min). <ol><li> Na autoclaaf Meng de benodigde hoeveelheid ureum (2 mg) met 1 ml vers medium en passeren een injectiespuit voorzien van 0,22 urn spuitfilter de werkwijze van verrijking voltooien. </li><li> Voeg 1ml van deze ophopingsmedium met additieven voor gesteriliseerde centrifugebuizen met 9 ml van de bereide vloeistof (cellen + medium) (zie stap 2,1). Opmerking: Van al deze componenten, ureum afbreekbaar bij verhoogde temperaturen, kan niet worden gesteriliseerd in een autoclaaf. Na toepassing van de andere componenten zijn autoclaaf (121 ° C, 15 psi, 15 min), ureum laatste toegevoegd door een 0,22 urn spuitfilter. </li></ol></li><li> Vortex elke buis grondig met een mechanische vortexer. Plaats de verrijkte vloeistoffen (cellen + medium + additieven) in een niet-schudincubator bij 30 ° C. Monitor alle eenheden regelmatig voor aanvang van de neerslag. Met behulp van een lichtmicroscoop, beginnen microscopische waarneming na aanvang neerslag wordt met het blote oog. Dit is gewoonlijk tussen 30-36 uur na het begin van experimenten. </li></ol> 3. Protocol voor multi-mode Microscopie <ol><li> Transfer een klein volume (~ 1 ml) vloeistof een hoge magnification microscopie-chambered dekglaasje systeem om de eerste waarnemingen met heldere veld modus uit te voeren. Om te beginnen, beginnen alle waarnemingen met de kleinste vergroting (4x). hetgeen een groot dekkingsgebied en dus globale informatie over de verdeling van precipitaten. </li><li> Selecteer specifieke gebieden met aanzienlijke hoeveelheden neerslag en opnieuw in (20X, 40X, 60X) van de vergroting geleidelijk toeneemt. LET OP: Omdat het onmogelijk is om de cellen van de extracellulaire polymere substantie (EPS) onder bright-field goed op te lossen (als gevolg van zeer dicht brekingsindex), schakel fase-contrast-modus wanneer dat nodig is. In deze modus slechts de contouren van de celmembranen (zijnde een andere fase dan de bulk cel) zijn toegankelijk, waardoor visuele differentiatie. </li><li> Tot slot vlek sommige kamers met Live / Dead vlek die selectief kleurstoffen de live-componenten als groene terwijl het inkleuren van de doden componenten in het rood. Raadpleeg standaardprotocollen 28 &lt;/ Sup&gt;. </li><li> Schakel fluorescerende modus goed onderscheid tussen de rode en groene gebieden. Rood (rode filter kubus met excitatie golflengte van 540-580 nm, Dichroic spiegel van 595 nm en Barrier filter van 600-660 nm) en Groen (GFP Long-pas Green filter kubus met excitatie golflengte van 440-480 nm, Dichroic spiegel van de 505 nm en Barrier filter van 510 nm) filter kubussen worden gebruikt om fluorescerende microfoto vergemakkelijken. </li><li> Zodra alle multi-mode data verzameld, selecteert de beste afbeeldingen handmatig overlay (individuele helderveld, fasecontrast en fluorescentiebeelden) om de best mogelijke contrast en helderheid te verkrijgen. </li><li> SEM uitvoeren van de droge vaste monsters kristalstructuren begrijpen. Dit is een gevestigde en standaard procedure. 22 Voer XPS chemische handtekeningen van functionele groepen (carbonaten) te identificeren. Dit is een gevestigde en standaardprocedure ook. 23 </li></ol>

<ol><li>Gibson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+Bacillus+pasteurii+group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">An investigation of the Bacillus pasteurii group.</a> Journal of Bacteriology. 28, 491-502 (1934).</li>
<li>Greenfield, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+and+concentration+of+calcium+and+magnesium+and+precipitation+of+calcium+carbonate+by+a+marine+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Metabolism and concentration of calcium and magnesium and precipitation of calcium carbonate by a marine bacterium.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 109, 23-45 (1963).</li>
<li>Phillips, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+applications+of+ureolytic+biomineralization%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Engineered applications of ureolytic biomineralization: a review.</a> Biofouling. 29, 715-733 (2013).</li>
<li>Dhami, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+of+calcium+carbonates+and+their+engineered+applications%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Biomineralization of calcium carbonates and their engineered applications: a review.</a> Frontiers in microbiology. 4, 314(2013).</li>
<li>Cuthbert, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+on+the+rate+of+ureolysis+and+the+morphology+of+carbonate+precipitated+by+S.+Pasteurii+biofilms+and+limits+due+to+bacterial+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Controls on the rate of ureolysis and the morphology of carbonate precipitated by S. Pasteurii biofilms and limits due to bacterial encapsulation.</a> Ecological Engineering. 41, 32-40 (2012).</li>
<li>Okwadha, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimum+conditions+for+microbial+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Optimum conditions for microbial carbonate precipitation.</a> Chemosphere. 81, 1143-1148 (2010).</li>
<li>Stocks-Fischer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+precipitation+of+CaCO3%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Microbiological precipitation of CaCO3.</a> Soil Biology and Biochemistry. 31, 1563-1571 (1999).</li>
<li>Lauchnor, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterially+induced+calcium+carbonate+precipitation+and+strontium+coprecipitation+in+a+porous+media+flow+system%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Bacterially induced calcium carbonate precipitation and strontium coprecipitation in a porous media flow system.</a> Environmental science & technology. 47, 1557-1564 (2013).</li>
<li>Al Qabany, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+Affecting+Efficiency+of+Microbially+Induced+Calcite+Precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Geotechnical+and+Geoenvironmental+Engineering%22%5BJournal%5D)">Factors Affecting Efficiency of Microbially Induced Calcite Precipitation.</a> Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering. 138, 992-1001 (2012).</li>
<li>Morita, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcite+precipitation+by+marine+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Geomicrobiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Calcite precipitation by marine bacteria.</a> Geomicrobiology Journal. 2, 63-82 (2009).</li>
<li>Chafetz, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marine+peloids%3A+A+product+of+bacterially+induced+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Sedimentary+Petrology%22%5BJournal%5D)">Marine peloids: A product of bacterially induced carbonate precipitation.</a> Journal of Sedimentary Petrology. 56, 812-817 (1986).</li>
<li>Biomason.com. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.biomason.com">http://www.biomason.com</a> (2015).</li>
<li>Whiffin, V. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microbial+CaCO3+precipitation+for+the+production+of+biocement%22">Microbial CaCO3 precipitation for the production of biocement</a>. , Murdoch University. PhD thesis (2004).</li>
<li>Paassen, L. A., et al. Scale up of BioGrout: a biological ground reinforcement method. Proceedings of the 17th International Conference on Soil Mechanics and Geotechnical Engineering. , 2328-2333 (2009).</li>
<li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbially+enhanced+geologic+containment+of+sequestered+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Procedia%22%5BJournal%5D)">Microbially enhanced geologic containment of sequestered supercritical CO2.</a> Energy Procedia. 1, 3245-3252 (2009).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Cunningham, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+risk+of+well+bore+leakage+of+CO2+using+engineered+biomineralization+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Energy+Procedia%22%5BJournal%5D)">Reducing the risk of well bore leakage of CO2 using engineered biomineralization barriers.</a> Energy Procedia. 4, 5178-5185 (2011).</li>
<li>Jonkers, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bacteria+as+self-healing+agent+for+the+development+of+sustainable+concrete%5BTitle%5D)+AND+%22Ecological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Application of bacteria as self-healing agent for the development of sustainable concrete.</a> Ecological Engineering. 36, 230-235 (2010).</li>
<li>Tobler, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+Sporosarcina+pasteurii+in+sandstone+and+its+significance+for+subsurface+engineering+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Geochemistry%22%5BJournal%5D)">Transport of Sporosarcina pasteurii in sandstone and its significance for subsurface engineering technologies.</a> Applied Geochemistry. 42, 38-44 (2014).</li>
<li>Mortensen, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+environmental+factors+on+microbial+induced+calcium+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+microbiology%22%5BJournal%5D)">Effects of environmental factors on microbial induced calcium carbonate precipitation.</a> Journal of applied microbiology. 111, 338-349 (2011).</li>
<li>Phillips, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+CO2+leakage+reduction+through+biofilm-induced+calcium+carbonate+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+science+%26+technology%22%5BJournal%5D)">Potential CO2 leakage reduction through biofilm-induced calcium carbonate precipitation.</a> Environmental science & technology. 47, 142-149 (2013).</li>
<li>Robbins, R. Scanning Electron Microscope Operation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf">http://www.utdallas.edu/~rar011300/SEM/Scanning%20Electron%20Microscope%20Operation.pdf</a> (2010).</li>
<li>vander Heide, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Heide%2C+P+%22X-ray+Photoelectron+Spectroscopy%3A+An+introduction+to+Principles+and+Practices%22">X-ray Photoelectron Spectroscopy: An introduction to Principles and Practices</a>. , John Wiley & Sons. (2011).</li>
<li>Wiley, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+an+alkaline+pH+and+ammonia+for+substrate+oxidation+by+Bacillus+pasteurii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Requirement of an alkaline pH and ammonia for substrate oxidation by Bacillus pasteurii.</a> Journal of Bacteriology. 84, (1962).</li>
<li>Tagliaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+strain+localisation+processes+in+bio-cemented+sand+using+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Granular+Matter%22%5BJournal%5D)">Observing strain localisation processes in bio-cemented sand using x-ray imaging.</a> Granular Matter. 13, 247-250 (2011).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 14, 895-902 (2012).</li>
<li>Valiei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab on a chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>LIVE/DEAD Bacterial Viability kit, Two-color bacterial viability assay. , https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/mp07007.pdf, https://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/live-dead-baclight-bacterial-viability-protocol.html (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kritische Stappen: Dit manuscript beschrijft in detail de protocollen voor het kweken van een levensvatbare steekproef van S. pasteurii. Zodra de kweek werd klaargemaakt, moet geschikt worden verrijkt. Dit is een belangrijke stap essentieel voor het succes van het experiment omdat niet de juiste chemische omgeving bieden leidt hetzij een zeer lange tijdschalen van precipitatie of een volledig ontbreken daarvan. S. pasteurii nogal gevoelig voor verschillende externe instanties en worden...

Sporosarcina pasteurii is een gram-positieve bacterie kunnen overleven in sterk alkalisch milieu (pH ~ 10) 1 en is een van de bacteriële soorten die een verwekker van een fenomeen genaamd Microbiologisch geïnduceerde calciet Neerslag (MICP) 2-4 kan worden. MICP is een werkwijze waarbij precipitatie van calciumcarbonaat wordt geïnduceerd door bepaalde microben onder geschikte omstandigheden. S. pasteurii belang is de laatste jaren aangenomen vanwege de identificatie als een mogelijk middel voor het teweegbrengen van significante hoeveelheden MICP onder bepaalde omstandigheden. Deze mogelijkheid komt voort uit het feit dat S. pasteurii biedt de unieke mogelijkheid om grote hoeveelheden van het enzym urease scheiden. Dit enzym katalyseert, waarmee een versnelde afbraak van ureum (een natuurlijk voorkomend biochemische verbinding met wijdverspreide en overvloedige toevoer) in aanwezigheid van watermoleculen. Via een cascade van reacties, dit proces uiteindelijkly leidt tot de vorming van negatief geladen carbonaationen. Deze ionen op hun beurt reageren met positieve metaalionen zoals calcium om uiteindelijk neerslag vormen van calciumcarbonaat (calciet); vandaar het label MICP 5-9. Het proces van MICP is bekend en onderzocht decennialang 10,11. In de afgelopen jaren heeft MICP onderzocht voor een breed scala van techniek en milieu-toepassingen, inclusief bottom-up groene bouw 12, verhoging van grootschalige structuren 13,14 en koolstofvastlegging en -opslag 15,16. Bijvoorbeeld Cunnigham 17 et. al ontwierp een hoge druk gematigde temperatuur stroming reactor die een Berea zandsteen kern. De reactor was geënt met de bacteriën S. fridgidimarina en onder omstandigheden van hoge druk superkritisch kooldioxide injectie, een enorme accumulatie van biomassa in de poriën vollumes waargenomen, wat leidde tot meer dan 95% vermindering van de permeabiliteit. Jonkers en Schlangen 18 bestudeerde het effect van bepaalde bijzondere stammen van bacteriën op de self-healing proces in beton. getransporteerd naar de poriënnetwerk invoeren via de oppervlakteporiën buitenwater wordt verwacht dat de slapende bacteriën die beurtelings structurele sterkte te activeren via MICP. Tobler 19 et al. de ureolytische activiteit van S. hebben vergeleken pasteurii met een inheemse grondwater ureolytische microkosmos onder omstandigheden grootschalige MCIP en vond dat S. pasteurii heeft een consistente mogelijkheid om calciet neerslag te verbeteren, zelfs wanneer de inheemse gemeenschappen ontbrak voorafgaand urease activiteit. Mortensen 20 et.al hebben de effecten van externe factoren zoals grondsoort, de concentratie van ammoniumchloride, zoutgehalte, zuurstofconcentratie en lysis van cellen op MICP bestudeerd. Hun demonstratie dat de biologische behandeling proces is zeer robuust met respect tot een grote variatie in parameter space onderbouwt de geschiktheid van dit proces voor diverse grootschalige sanering toepassingen die een goede verrijkingsproces om de bacteriën te versterken wordt ondernomen. Phillips 21 et. al experimenten ontworpen om de veranderingen in permeabiliteit en sterkte van een kolom en een zand zandsteen kern na injectie met S. bestuderen pasteurii culturen. Zij vonden dat terwijl de permeabiliteit verlaagd 2-4 keer terwijl de breuksterkte drie maal verhoogd. S. pasteurii en haar rol in MICP zijn onderwerpen van actief onderzoek en een aantal kwesties met betrekking tot het mechanisme van chemische neerslag nog steeds niet volledig begrepen. In het licht van deze, is het zeer belangrijk om een set van samenhangende gestandaardiseerde protocollen om nauwkeurig cultuur een voldoende verrijkte voorraad van S. hebben pasteurii MICP te bereiken. Hier schetsen we een strenge protocol dat zal zorgen voor de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. deze manuscript beschrijft de gedetailleerde protocollen voor het kweken van S. pasteurii en geschikte het verrijken van het kweekmedium om neerslag te induceren. Het proces wordt onderzocht via verschillende microscopische technieken zoals optische en Scanning Electron Microscopy (SEM) en X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS). De focus van het manuscript is het proces van MICP. Procedures zoals SEM en SIMS, die gevestigde standaardprotocollen, worden niet apart beschreven.

<table><tbody><tr><td>Petrischaal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>Petrischalen worden gebruikt als agarplaat</td></tr><tr><td>Pyrex Flessen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63268</td><td>Corning Erlenmeyer</td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Promega</td><td>H5133</td><td>wordt gebruikt om Tris-buffer te maken</td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td>1.0 N, Bioreagens, geschikt voor celkweek</td></tr><tr><td>Agar Poeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>microbiologie getest, plantencelkweek getest, celkweek getest, poeder</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td>voor moleculaire biologie</td></tr><tr><td>Gistextractpoeder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>Maatcilinder</td><td>Cole-Parmer</td><td>CP08559GC</td><td>Cole-Parmer Class A afgemeten cilinder met Certificaat, TC; 1.000 ml, 1/Pk</td></tr><tr><td>Analytische Weegschaal</td><td>OHAUS</td><td>AX124E</td><td>wordt gebruikt om het gewicht van reagentia te meten</td></tr><tr><td>Autoclaaf</td><td>Brinkmann</td><td>58619000</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaaftape</td><td>VWR</td><td>52428864</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z185140</td><td>wordt gebruikt om de fles te verzegelen voordat deze in de autoclaaf wordt geplaatst</td></tr><tr><td>Bacterievoorraad</td><td>Cedarlane</td><td>11859</td><td>-80 &deg;C voorraad van S. pasteurii, ATCC-nr. wordt vermeld tegenover Kat. Nr.</td></tr><tr><td>Mline Enkelkanaals Mechanische Pipetten, Variabel Volume</td><td>Biohit</td><td>725010</td><td>Gecommercialiseerd door VWR onder catalogusnummer 14005976</td></tr><tr><td>Micropipettip</td><td>Fisher Scientific</td><td>212772B</td><td>Wordt gebruikt voor het krabben van agarplaten</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Binder</td><td>80079098</td><td>Microbiologie Incubator, BF Serie</td></tr><tr><td>Schudincubator</td><td>VWR</td><td>14004300</td><td>VWR Signature Benchtop Schudincubators</td></tr><tr><td>Fosfaatbufferoplossing (PBS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7059</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Express Pipet-Aid Pipetapparaat</td><td>BD Biosciences</td><td>357590</td><td>Gecommercialiseerd door VWR onder catalogusnummer 53106220</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Wordt gebruikt om agarplaten te verzegelen</td></tr><tr><td>Ureum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U1250</td><td>Verrijking voor voedingsmedium</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8875</td><td>Verrijking voor voedingsmedium</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>Verrijking voor voedingsmedium</td></tr></tbody></table>

microbiologisch induced calciet neerslag gemedieerd door<em&gt; sporosarcina pasteurii</em

Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii

De bijzondere bacterie in onderzoek hier (S. pasteurii) is uniek in zijn vermogen, onder de juiste omstandigheden, om de hydrolyse van ureum (ureolysis) in de natuur voorkomende omgevingen door middel van uitscheiding van een enzym urease induceren. Dit proces van ureolysis, via een keten van chemische reacties, leidt tot de vorming van calciumcarbonaat precipitaten. Dit staat bekend als Microbiologisch Induced Kalkspaat Neerslag (MICP). De juiste cultuur protocollen voor MICP worden hier beschreven. Tenslotte visualisatie experimenten onder verschillende vormen van microscopie werd uitgevoerd om verschillende aspecten van de precipitatie proces te begrijpen. Technieken zoals optische microscopie, scanning elektronenmicroscopie (SEM) en X-ray foto-elektron spectroscopie (XPS) toegepast voor chemische kenmerken het eindproduct. Verder is het vermogen van deze precipitaten poriën verstoppen in een natuurlijke poreuze medium werd aangetoond met een experiment waarbij kwalitatieve sponsstaven werden gebruikt om een ​​porie-netwerk nabootsen met verschillende lengteschalen. Een spons bar ondergedompeld in het kweekmedium dat de bacteriecellen verhardt door de verstopping van de poriën gevolg van de continue werkwijze van chemisch neerslaan. Deze geharde spons bar vertoont superieure sterkte in vergelijking met een controle spons bar die wordt samengedrukt en geperst onder invloed van een toegepaste externe belasting, terwijl de uitgeharde bar kan hetzelfde gewicht ondersteunen met weinig vervorming.

S. pasteurii zijnde een alkalifiel 24 kan relatief zware omstandigheden te overleven. Bovenvermelde cultuurprotocol gevolgd en S. pasteurii wordt gekweekt in een kamer, de bacteriën leidt tot de precipitatie van calciumcarbonaat in de tijd (Figuur 2A). Figuur 2 (b) toont een fase-contrast microscopische optische beeld van de bacteriële cel populatie in het kweekmedium. Individuele cellen kunnen duidelijk onderscheiden met sta...

Protocollen voor microbiologisch geïnduceerde calcietprecipitatie (MICP) met behulp van de bacterie Sporosarcina pasteurii worden hier gepresenteerd. Het geprecipiteerde calciumcarbonaat werd gekarakteriseerd door middel van optische microscopie en rasterelektronenmicroscopie (SEM). Er wordt ook aangetoond dat blootstelling aan MICP de druksterkte van spons verhoogt.

Microbiologisch Induced calciet Neerslag gemedieerd door<em&gt; Sporosarcina pasteurii</em

The particular bacterium under investigation here (S. pasteurii) is unique in its ability, under the right conditions, to induce the hydrolysis of urea ...

Het algemene doel van dit protocol is om calcietprecipitatie te induceren in een stagnante cultuur van Sporosarcina pasteurii. Deze methode kan ons helpen om belangrijke biofysische vragen te beantwoorden over de door Sporosarcina pasteurii gemedieerde calcietprecipitatie, zoals de relevante lengte- en tijdschalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de complexe stappen standaardiseert die komen kijken bij het geschikt cultiveren en verrijken van Sporosarcina pasteurii, wat een betrouwbare calcietprecipitatie waarborgt.Begin met het verzamelen van petrischalen, kolven, Tris-base, HCl, agar, Millipore-water en een pH-meter. Steriliseer alle containers vóór gebruik door middel van autoclaveren bij 121 graden Celsius. Bereid één liter van een 0,13 molar waterige oplossing van Tris-buffer door 15,75 gram Tris-base te mengen met één liter Millipore-water.Voeg ongeveer 2,8 milliliters 50%HCl toe om de buffer aan te passen naar een pH van negen. Zodra de cultuur gereed is, moet deze op de juiste wijze worden verrijkt met de juiste buffer. Deze stap is cruciaal voor het succes van het experiment, aangezien het uitblijven van de juiste chemische omgeving kan leiden tot zeer lange precipitatietijden of zelfs tot een volledig gebrek daaraan.Verdeel vervolgens de ene liter buffer als volgt in twee delen. Los in één aliquot van 400 milliliter acht gram ammoniumsulfaat op. Los in een tweede aliquot van 400 milliliter 16 gram gistextract op.Meng in 100 milliliters van de buffer twee gram ammoniumsulfaat, en voeg in de laatste 100 milliliters buffer vier gram gistextract en vier gram agar toe. Autoclaveer de vier oplossingen nadat de kolven in aluminiumfolie zijn gewikkeld. Zet de twee 400 milliliter oplossingen direct na het autoclaven apart.Combineer de twee oplossingen van 100 milliliter, meng goed en verdeel deze over 10 tot 12 Petrischalen. Om bacteriële monsters te kweken, haal je de bacteriële stock uit de vriezer van min 80 graden Celsius en laat je deze volledig ontdooien. Plaats deze vervolgens samen met een agarplaat in de biologische veiligheidskast.Selecteer een micropipet met het laagst mogelijke volume en dip een micropipetpunt in de Sporosarcina pasteurii-voorraad voordat de punt wordt gebruikt om een agarplaat uit te strijken. Incubeer de plaat bij 31 °C gedurende 48 uur en inspecteer deze vervolgens visueel op de aanwezigheid van enkelvoudige kolonies. Als er geen kolonies aanwezig zijn, incubeer dan nogmaals 24 uur.Herhaal de controle en incubaties totdat enkelvoudige kolonies worden waargenomen. Om de uiteindelijke bacteriële cultuurmonsters voor te bereiden, mengt u de twee eerder geautoclaveerde oplossingen van 400 milliliter in een gesteriliseerde beker en brengt u 125 milliliter over naar een kolf. Voer een visuele inspectie van de agarplaat uit om gebieden met hoge concentraties enkelvoudige kolonies te identificeren.Breek voorzichtig een van de kolonies met een micropipetpunt. Dip vervolgens dezelfde punt in de fles van 125 milliliter en roer grondig om te zorgen dat een voldoende aantal cellen wordt overgedragen. Plaats de fles gedurende twee tot drie dagen in een schudincubator bij 30 °C en 150 rpm.Om een definitief celgetal te bepalen, trekt u zeven parallelle, gelijke afstandelijke dikke lijnen op de bodem van een van de agarplaatjes, zodanig dat deze van bovenaf zichtbaar zijn. Plaats drie kleine druppels van ongeveer 10 µL onverdunde cultuur in één segment. Voeg één milliliter onverdunde cultuur toe aan negen milliliter gesteriliseerde PBS om een verdunning van 1:10 te verkrijgen.Plaats vervolgens drie kleine druppels van de verdunning op een tweede segment van de plaat. Overbreng de verdunde cultuur naar een nieuwe kolf en gebruik PBS om opnieuw tienvoudig te verdunnen tot 10⁻². Herhaal het uitplaten en het verdunningsproces tot er een verdunning van ten minste 10⁻⁷ is gegenereerd, om ervoor te zorgen dat er enkelvoudige kolonies worden verkregen.Incubeer de plaat bij 31 °C gedurende één tot twee dagen voordat de kolonies in elk gedeelte van de plaat worden geteld. Breng negen milliliter van de bereide vloeibare cultuur over in verschillende gesteriliseerde centrifugebuisjes van tien milliliter. Bereid 100 milliliter van de externe verrijkingsvoorraadoplossing voor door met een analytische balans zorgvuldig twee gram per liter ureum, één gram per liter ammoniumchloride, 212 milligram per liter natriumbicarbonaat en 280 milligram per liter calciumchloride af te wegen.Combine in een bekerglas met vers medium alle ingrediënten behalve de ureum en autoclaveer deze. Meng na het autoclaven het ureum met één milliliter vers medium en breng de oplossing door een spuit voorzien van een 0,2 micrometer filter voordat deze aan het verrijkingsmedium wordt toegevoegd. Voeg één milliliter van het verrijkingsmedium met additieven toe aan de gesteriliseerde centrifugebuizen die negen milliliter van de bereide cultuur bevatten.Vortex elke buis en incubeer in een niet-schuddende incubator bij 30 °C. Controleer alle eenheden regelmatig op het begin van neerslag. Zodra neerslag met het blote oog wordt waargenomen, brengt u een klein volume vloeistof over naar een microscopie-dekglaassysteem met kamer bij hoge vergroting.Bekijk het monster in eerste instantie onder 4X vergroting om een breed gebied te observeren voordat de vergroting stapsgewijs wordt verhoogd. Voer de kleuring en de SEM-experimenten uit volgens het tekstprotocol. Wanneer S.pasteurii wordt gekweekt volgens het in deze video gedemonstreerde protocol, leiden de bacteriën tot de precipitatie van calciumcarbonaat dat na verloop van tijd naar de bodem van de buis zinkt.Deze figuur toont fasecontrastbeelden van een duidelijk onderscheidbare, staafvormige bacteriële populatie in het medium. Hier zijn de scherp gedefinieerde splijvlakken, een kenmerk van kristalliniteit, zichtbaar. Deze röntgenfotoelektronspectroscopie-grafiek voor hetzelfde monster bevat pieken die overeenkomen met carbonaatgroepen, wat wijst op de aanwezigheid van calciumcarbonaat.In dit paneel wordt een onbehandelde spons getoond die gemakkelijk wordt samengedrukt wanneer hij wordt blootgesteld aan een gewicht van één kilogram. Wanneer een spons zeven dagen lang werd ondergedompeld in een calcietprecipitatie-oplossing met S.pasteurii en vervolgens werd gedroogd, werd deze hard en vertoonde deze een verbeterde compressiesterkte door verstopping van de poriën als gevolg van calcietprecipitatie. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele uren worden voltooid als alle stappen correct worden uitgevoerd.Hoewel de individuele stappen elk slechts enkele minuten duren, zijn er tussenliggende perioden van inactiviteit waarin het monster uren of zelfs dagen geïncubeerd moet worden. Na deze procedure kunnen verschillende andere technieken, zoals aanvullende karakterisering, worden uitgevoerd om andere vragen te beantwoorden over, bijvoorbeeld, de statistische verdeling van polymorfe vormen in calciumcarbonaat. Na het bekijken van deze video zou u een correct en duidelijk begrip moeten hebben van hoe Sporosarcina pasteurii op de juiste manier gekweekt kan worden voor een adequate verrijking die calcietprecipitatie garandeert, en hoe dit proces via multi-mode microscopie kan worden geobserveerd.Vergeet niet dat werken met autoclaven onder hoge druk uiterst gevaarlijk kan zijn en dat daarom alle voorzorgsmaatregelen, zoals het volledig ontluchten van de kamer en het dragen van PBM's, moeten worden gewaarborgd voordat deze procedure wordt uitgevoerd.

microbiologically-induced-calcite-precipitation-mediated-sporosarcina

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Bhaduri, S., et al., Microbiologically Induced Calcite Precipitation Mediated by Sporosarcina pasteurii. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the method of enriching Sporosarcina pasteurii with urea and calcium chloride to trigger urease activity, leading to the formation of visible calcite crystals through Microbiologically Induced Calcite Precipitation, or MICP.

Microbiologically Induced Calcite Precipitation by Sporosarcina pasteurii

Er werd een methode ontwikkeld om bacteriële endosporen uit complexe microbiële gemeenschappen te isoleren om op maat gemaakte kweek- of moleculaire studies van deze groep bacteriën uit te voeren.

Fysieke Isolatie van Endospores van milieu monsters door Gerichte Lysis van vegetatieve cellen

Een protocol voor de parallelle productie van geprecipiteerd calciumcarbonaat en zeolitisch materiaal uit hoogovenslakken via respectievelijk minerale carboratie en alkalische hydrothermische conversie wordt gepresenteerd. De prestaties van het zeolitische materiaal ten aanzien van nikkeladsorptie worden getest.

Twee-weg Valorisatie van hoogovenslakken: Synthese van neergeslagen calciumcarbonaat en Zeolitische Heavy Metal Adsorbent

We demonstreren het gebruik van verschillende microscopiemethoden die nuttig zijn bij het observeren van de verkalking van een buisworm, Hydroides elegans, evenals het lokaliseren en karakteriseren van het eerste verkalkte materiaal. Live microscopie en elektronenmicroscopie worden samen gebruikt om functionele en materiaalinformatie te verstrekken die belangrijk zijn bij het bestuderen van biomineralisatie.

Karakterisering van calcificatie Events met Live optische en elektronenmicroscopie technieken in een Marine tubeworm

We beschrijven een protocol voor de precipitatie en karakterisering van calciumcarbonaat kristallen die vormen in de aanwezigheid van biopolymeren.

Vorming van calcium carbonaat in aanwezigheid van Bioolymeer additieven

Hier, microbieel geïnduceerde calciet neerslag (micp) technologie wordt gepresenteerd ter verbetering van de bodemeigenschappen door onderdompeling.

Zandgrond verbetering door microben geïnduceerde calciet precipitatie (MICP) door onderdompeling

De hier beschreven verificatiemethode is aanpasbaar voor het monitoren van pedogene anorganische koolstofvastlegging in verschillende landbouwgronden, gewijzigd met alkalische aardmetaalsilicaathoudende gesteenten, zoals wollastoniet, basalt en olivijn. Dit type validatie is essentieel voor koolstofkredietprogramma's, die ten goede kunnen komen aan boeren die koolstof in hun velden in beslag neemt.

Monitoring pedogene anorganische koolstofaccumulatie als gevolg van verwering van gewijzigde silicaatmineralen in landbouwgronden.

De isolatie van zware metaalresistente microben uit geothermische bronnen is een hot topic voor de ontwikkeling van bioremediatie en milieumonitoring biosystemen. Deze studie biedt een methodologische benadering voor het isoleren en identificeren van zware metaaltolerante bacteriën uit warmwaterbronnen.

Bioprospectie van extremofiele micro-organismen om milieuvervuiling aan te pakken

Sporosarcina pasteurii is een ureolytische bacterie die ureum afbreekt tot carbonaat en ammonium. Het carbonaat combineert met calcium om calciumcarbonaat te vormen, waardoor een kristalrooster ontstaat dat omringende deeltjes aan elkaar verankert om biocement te produceren. Dit is een handig protocol voor het gebruik van 3D-geprinte mallen om biocementstenen te maken die geschikt zijn voor compressietesten.

Productie en analyse van Sporosarcina pasteuri biocement bakstenen met behulp van op maat gemaakte 3D-geprinte mallen voor onbeperkte compressietests

We gesynthetiseerd stervormige gouden nanostars met behulp van een zilveren zaad gemedieerde groei methode. De diameter van de nanostars varieert van 200 tot 300 nm en het aantal tips variëren van 7 tot 10. De nanodeeltjes hebben een brede oppervlakte plasmon resonance-modus in het midden van het nabij-infrarood.

Goud Nanostar Synthese met een Silver Zaad gemedieerde groei Methode

Leer microbiologisch geïnduceerde calcietprecipitatie met Sporosarcina pasteurii voor biomineralisatieonderzoek. Deze gestandaardiseerde methode versterkt de druksterkte van materialen door calciumcarbonaat neerslag.

Microbiologisch Induced calciet Neerslag gemedieerd door

Meer video's verkennen