Genuitschakelen met Morpholino's
Gene-silencingtechnieken worden veel gebruikt op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. Morfolino-gebaseerde knockdown-benaderingen stellen onderzoekers routinematig in staat om zowel genen die betrokken zijn bij belangrijke cellulaire processen te identificeren als te karakteriseren. Antisense-morfolino's zijn nu wijdverbreid populair in veel modelsystemen, waaronder muizen, kuikens en zebravissen, vanwege hun hoge werkzaamheid, hoge specificiteit en lage kosten.
Deze video geeft een overzicht van morfolinomechanismen en micro-injectiestrategieën, belangrijke experimentele controles en hoe morfolino's vandaag de dag in laboratoria worden gebruikt om de ontwikkeling van gewervelde dieren te onderzoeken.
Morfolino's werden oorspronkelijk ontwikkeld als een manier om de translatie van RNA-transcripten in levende cellen en organismen te remmen. Over het algemeen zijn morfolino's synthetische moleculen die bestaan uit 25 oligonucleotiden verbonden door een neutraal geladen ruggengraat.
Maar hoewel morfolino's er veel uitzien als DNA, bevatten ze morfolineringen in plaats van de suikergroepen in de fosfaat-suikerruggengraat. Deze eenvoudige omzetting verhoogt de stabiliteit van morfolino's in cellen en verlaagt hun productiekosten.
In cellen worden morfolino's gericht op het RNA van belang door complementaire basenparing. De locatie op het RNA waar de morfolino hybridiseert, bepaalt het specifieke werkingsmechanisme.
Splice-blokkerende morfolino's binden zich aan specifieke knooppunten en remmen de juiste transcriptverwerking, terwijl translatie-blokkerende morfolino's zich binnen de 5' onvertaalde regio van het gen in de buurt van de translationele startplaats binden en de assemblage van ribosomen voorkomen. Beide soorten morfolino's verminderen de expressie van functionele doeleiwitten.
Bij het plannen van een experiment met morfolino's zijn er enkele belangrijke overwegingen die in gedachten moeten worden gehouden. Morfolino's kunnen in verschillende modelsystemen worden gebruikt, dus het is belangrijk om een model te selecteren dat in staat is om de biologische vraag die ter sprake komt aan te pakken.
Morfolino's worden commercieel gesynthetiseerd en professionele ontwerpondersteuning is kosteloos beschikbaar voor onderzoekers, maar omdat ze sequentiespecifiek zijn, moet de geninformatie voor alle specifieke morfolinodoelwitten worden verkregen vóór het ontwerp.
In het zebravismodelsysteem zijn er vaak twee kopieën van enkele genen die in andere gewervelde dieren worden aangetroffen, vanwege een volledige genoomduplicatie die plaatsvond in een evolutionair voorouder van de zebravis. Daarom kan het knockdown van beide zebravisgenen noodzakelijk zijn om succesvol eiwitdeficiënties in de menselijke ontwikkeling te modelleren.
Het ontwerpen van goede experimentele controles is net zo belangrijk als het ontwerpen van je gerichte morfolino's. Elke morfolino kan zich binden aan specifieke sequenties op verschillende genen. Het is raadzaam om onafhankelijke, niet-overlappende morfolino's te gebruiken die complementair zijn aan hetzelfde gen, om ervoor te zorgen dat een waargenomen fenotypische verandering het gevolg is van knockdown van je gen van belang.
Nu we het hebben gehad over de experimentele opzet van morfolino's, laten we eens kijken hoe morfolino's in zebravissen worden geïntroduceerd.
Hier zullen we de micro-injectie van morfolino in zebravissen beschrijven. Voor meer inzicht en instructie over de details van micro-injectie, verwijzen we naar de JoVE Science Education-video getiteld "Zebravis Micro-injectie Technieken."
Morfolino's worden meestal geïnjecteerd in zebravis-embryo's tussen de een- en viercelfase, in het dooier of celcytoplasma. Cytoplasmatische verbindingen tussen embryonale cellen maken een snelle diffusie en universele afgifte van wateroplosbare morfolino's mogelijk in het hele organisme. Morfolino's zijn stabiel in cellen, omdat het zebravis-embryo op 28,5°C wordt gekweekt.
Optimale injectieconcentraties en -volumes moeten empirisch worden getest voor elke morfolino. Typisch wordt de laagste dosis waarbij er een gedefinieerd betrouwbaar fenotype is in ten minste 50-75% van de geïnjecteerde embryo's gebruikt om embryonale letaliteit of ongewenste off-targeteffecten te voorkomen.
De meeste morfolino-zebravisfenotypen worden geïdentificeerd in de eerste drie dagen na bevruchting, en gen-silencing is over het algemeen effectief tot vijf dagen. In het geval van splice-blokkerende morfolino's kan RT-PCR worden gebruikt om relatieve hoeveelheden van native en gewijzigde transcripten te identificeren. Voor translatie-blokkerende morfolino's kunnen niveaus van gen-knockdown worden beoordeeld door Western blot.
De snelle externe ontwikkeling en transparantie van zebravis-embryo's maakt eenvoudige observatie van veel vroege biologische processen mogelijk. Morfolino-fenotypen kunnen vaak worden gescored door morfologie te analyseren met behulp van lichtveld- of fluorescentiemicroscopie, evenals door gedrag te beoordelen.
Nadat het morfolino-fenotype is gedefinieerd, kan RNA-redding worden uitgevoerd om de doelspecificiteit aan te tonen. Na knockdown van het endogene mRNA door morfolino wordt synthetisch mRNA geïnjecteerd, dat hetzelfde eiwit codeert, maar niet de morfolino-doelsequentie bevat. Als dit geïnjecteerde RNA in staat is om het wildtype-fenotype van het organisme te herstellen, kunnen we concluderen dat het waargenomen morfolino-fenotype specifiek te wijten is aan het doelgen dat is geknocked down.
Nu je een idee hebt van wat morfolino's zijn en hoe gecontroleerde morfolino-experimenten kunnen worden uitgevoerd, laten we eens kijken hoe morfolino's vandaag de dag worden toegepast in biologische laboratoria.
In de celbiologie worden morfolino's gebruikt om vroege ontwikkelingsprocessen te begrijpen. De door cilia gegenereerde vloeistofstroom in de buis van Kupffer is een voorbeeld, die links-rechts patroonvorming in zebravissen regelt. De v
Morpholino-gemedieerde gen-silencing is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt om de rol van specifieke genen tijdens de ontwikkeling te bestud…
Gene-silencingtechnieken worden veel gebruikt op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. Morfolino-gebaseerde knockdown-benaderingen stellen onderzoekers routinematig in staat om zowel genen die betrokken zijn bij belangrijke cellulaire processen te identificeren als te karakteriseren. Antisense-morfolino's zijn nu wijdverbreid populair in veel modelsystemen, waaronder muizen, kuikens en zebravissen, vanwege hun hoge werkzaamheid, hoge specificiteit en lage kosten.
Deze video geeft een overzicht van morfolinomechanismen en micro-injectiestrategieën, belangrijke experimentele controles en hoe morfolino's vandaag de dag in laboratoria worden gebruikt om de ontwikkeling van gewervelde dieren te onderzoeken.
Morfolino's werden oorspronkelijk ontwikkeld als een manier om de translatie van RNA-transcripten in levende cellen en organismen te remmen. Over het algemeen zijn morfolino's synthetische moleculen die bestaan uit 25 oligonucleotiden verbonden door een neutraal geladen ruggengraat.
Maar hoewel morfolino's er veel uitzien als DNA, bevatten ze morfolineringen in plaats van de suikergroepen in de fosfaat-suikerruggengraat. Deze eenvoudige omzetting verhoogt de stabiliteit van morfolino's in cellen en verlaagt hun productiekosten.
In cellen worden morfolino's gericht op het RNA van belang door complementaire basenparing. De locatie op het RNA waar de morfolino hybridiseert, bepaalt het specifieke werkingsmechanisme.
Splice-blokkerende morfolino's binden zich aan specifieke knooppunten en remmen de juiste transcriptverwerking, terwijl translatie-blokkerende morfolino's zich binnen de 5' onvertaalde regio van het gen in de buurt van de translationele startplaats binden en de assemblage van ribosomen voorkomen. Beide soorten morfolino's verminderen de expressie van functionele doeleiwitten.
Bij het plannen van een experiment met morfolino's zijn er enkele belangrijke overwegingen die in gedachten moeten worden gehouden. Morfolino's kunnen in verschillende modelsystemen worden gebruikt, dus het is belangrijk om een model te selecteren dat in staat is om de biologische vraag die ter sprake komt aan te pakken.
Morfolino's worden commercieel gesynthetiseerd en professionele ontwerpondersteuning is kosteloos beschikbaar voor onderzoekers, maar omdat ze sequentiespecifiek zijn, moet de geninformatie voor alle specifieke morfolinodoelwitten worden verkregen vóór het ontwerp.
In het zebravismodelsysteem zijn er vaak twee kopieën van enkele genen die in andere gewervelde dieren worden aangetroffen, vanwege een volledige genoomduplicatie die plaatsvond in een evolutionair voorouder van de zebravis. Daarom kan het knockdown van beide zebravisgenen noodzakelijk zijn om succesvol eiwitdeficiënties in de menselijke ontwikkeling te modelleren.
Het ontwerpen van goede experimentele controles is net zo belangrijk als het ontwerpen van je gerichte morfolino's. Elke morfolino kan zich binden aan specifieke sequenties op verschillende genen. Het is raadzaam om onafhankelijke, niet-overlappende morfolino's te gebruiken die complementair zijn aan hetzelfde gen, om ervoor te zorgen dat een waargenomen fenotypische verandering het gevolg is van knockdown van je gen van belang.
Nu we het hebben gehad over de experimentele opzet van morfolino's, laten we eens kijken hoe morfolino's in zebravissen worden geïntroduceerd.
Hier zullen we de micro-injectie van morfolino in zebravissen beschrijven. Voor meer inzicht en instructie over de details van micro-injectie, verwijzen we naar de JoVE Science Education-video getiteld "Zebravis Micro-injectie Technieken."
Morfolino's worden meestal geïnjecteerd in zebravis-embryo's tussen de een- en viercelfase, in het dooier of celcytoplasma. Cytoplasmatische verbindingen tussen embryonale cellen maken een snelle diffusie en universele afgifte van wateroplosbare morfolino's mogelijk in het hele organisme. Morfolino's zijn stabiel in cellen, omdat het zebravis-embryo op 28,5°C wordt gekweekt.
Optimale injectieconcentraties en -volumes moeten empirisch worden getest voor elke morfolino. Typisch wordt de laagste dosis waarbij er een gedefinieerd betrouwbaar fenotype is in ten minste 50-75% van de geïnjecteerde embryo's gebruikt om embryonale letaliteit of ongewenste off-targeteffecten te voorkomen.
De meeste morfolino-zebravisfenotypen worden geïdentificeerd in de eerste drie dagen na bevruchting, en gen-silencing is over het algemeen effectief tot vijf dagen. In het geval van splice-blokkerende morfolino's kan RT-PCR worden gebruikt om relatieve hoeveelheden van native en gewijzigde transcripten te identificeren. Voor translatie-blokkerende morfolino's kunnen niveaus van gen-knockdown worden beoordeeld door Western blot.
De snelle externe ontwikkeling en transparantie van zebravis-embryo's maakt eenvoudige observatie van veel vroege biologische processen mogelijk. Morfolino-fenotypen kunnen vaak worden gescored door morfologie te analyseren met behulp van lichtveld- of fluorescentiemicroscopie, evenals door gedrag te beoordelen.
Nadat het morfolino-fenotype is gedefinieerd, kan RNA-redding worden uitgevoerd om de doelspecificiteit aan te tonen. Na knockdown van het endogene mRNA door morfolino wordt synthetisch mRNA geïnjecteerd, dat hetzelfde eiwit codeert, maar niet de morfolino-doelsequentie bevat. Als dit geïnjecteerde RNA in staat is om het wildtype-fenotype van het organisme te herstellen, kunnen we concluderen dat het waargenomen morfolino-fenotype specifiek te wijten is aan het doelgen dat is geknocked down.
Nu je een idee hebt van wat morfolino's zijn en hoe gecontroleerde morfolino-experimenten kunnen worden uitgevoerd, laten we eens kijken hoe morfolino's vandaag de dag worden toegepast in biologische laboratoria.
In de celbiologie worden morfolino's gebruikt om vroege ontwikkelingsprocessen te begrijpen. De door cilia gegenereerde vloeistofstroom in de buis van Kupffer is een voorbeeld, die links-rechts patroonvorming in zebravissen regelt. De v
Gene-silencingtechnieken worden veel gebruikt op het gebied van de ontwikkelingsbiologie. Morfolino-gebaseerde knockdown-benaderingen stellen onderzoekers routinematig in staat om zowel genen die betrokken zijn bij belangrijke cellulaire processen te identificeren als te karakteriseren. Antisense-morfolino's zijn nu wijdverbreid populair in veel modelsystemen, waaronder muizen, kuikens en zebravissen, vanwege hun hoge werkzaamheid, hoge specificiteit en lage kosten.
Deze video geeft een overzicht van morfolinomechanismen en micro-injectiestrategieën, belangrijke experimentele controles en hoe morfolino's vandaag de dag in laboratoria worden gebruikt om de ontwikkeling van gewervelde dieren te onderzoeken.
Morfolino's werden oorspronkelijk ontwikkeld als een manier om de translatie van RNA-transcripten in levende cellen en organismen te remmen. Over het algemeen zijn morfolino's synthetische moleculen die bestaan uit 25 oligonucleotiden verbonden door een neutraal geladen ruggengraat.
Maar hoewel morfolino's er veel uitzien als DNA, bevatten ze morfolineringen in plaats van de suikergroepen in de fosfaat-suikerruggengraat. Deze eenvoudige omzetting verhoogt de stabiliteit van morfolino's in cellen en verlaagt hun productiekosten.
In cellen worden morfolino's gericht op het RNA van belang door complementaire basenparing. De locatie op het RNA waar de morfolino hybridiseert, bepaalt het specifieke werkingsmechanisme.
Splice-blokkerende morfolino's binden zich aan specifieke knooppunten en remmen de juiste transcriptverwerking, terwijl translatie-blokkerende morfolino's zich binnen de 5' onvertaalde regio van het gen in de buurt van de translationele startplaats binden en de assemblage van ribosomen voorkomen. Beide soorten morfolino's verminderen de expressie van functionele doeleiwitten.
Bij het plannen van een experiment met morfolino's zijn er enkele belangrijke overwegingen die in gedachten moeten worden gehouden. Morfolino's kunnen in verschillende modelsystemen worden gebruikt, dus het is belangrijk om een model te selecteren dat in staat is om de biologische vraag die ter sprake komt aan te pakken.
Morfolino's worden commercieel gesynthetiseerd en professionele ontwerpondersteuning is kosteloos beschikbaar voor onderzoekers, maar omdat ze sequentiespecifiek zijn, moet de geninformatie voor alle specifieke morfolinodoelwitten worden verkregen vóór het ontwerp.
In het zebravismodelsysteem zijn er vaak twee kopieën van enkele genen die in andere gewervelde dieren worden aangetroffen, vanwege een volledige genoomduplicatie die plaatsvond in een evolutionair voorouder van de zebravis. Daarom kan het knockdown van beide zebravisgenen noodzakelijk zijn om succesvol eiwitdeficiënties in de menselijke ontwikkeling te modelleren.
Het ontwerpen van goede experimentele controles is net zo belangrijk als het ontwerpen van je gerichte morfolino's. Elke morfolino kan zich binden aan specifieke sequenties op verschillende genen. Het is raadzaam om onafhankelijke, niet-overlappende morfolino's te gebruiken die complementair zijn aan hetzelfde gen, om ervoor te zorgen dat een waargenomen fenotypische verandering het gevolg is van knockdown van je gen van belang.
Nu we het hebben gehad over de experimentele opzet van morfolino's, laten we eens kijken hoe morfolino's in zebravissen worden geïntroduceerd.
Hier zullen we de micro-injectie van morfolino in zebravissen beschrijven. Voor meer inzicht en instructie over de details van micro-injectie, verwijzen we naar de JoVE Science Education-video getiteld "Zebravis Micro-injectie Technieken."
Morfolino's worden meestal geïnjecteerd in zebravis-embryo's tussen de een- en viercelfase, in het dooier of celcytoplasma. Cytoplasmatische verbindingen tussen embryonale cellen maken een snelle diffusie en universele afgifte van wateroplosbare morfolino's mogelijk in het hele organisme. Morfolino's zijn stabiel in cellen, omdat het zebravis-embryo op 28,5°C wordt gekweekt.
Optimale injectieconcentraties en -volumes moeten empirisch worden getest voor elke morfolino. Typisch wordt de laagste dosis waarbij er een gedefinieerd betrouwbaar fenotype is in ten minste 50-75% van de geïnjecteerde embryo's gebruikt om embryonale letaliteit of ongewenste off-targeteffecten te voorkomen.
De meeste morfolino-zebravisfenotypen worden geïdentificeerd in de eerste drie dagen na bevruchting, en gen-silencing is over het algemeen effectief tot vijf dagen. In het geval van splice-blokkerende morfolino's kan RT-PCR worden gebruikt om relatieve hoeveelheden van native en gewijzigde transcripten te identificeren. Voor translatie-blokkerende morfolino's kunnen niveaus van gen-knockdown worden beoordeeld door Western blot.
De snelle externe ontwikkeling en transparantie van zebravis-embryo's maakt eenvoudige observatie van veel vroege biologische processen mogelijk. Morfolino-fenotypen kunnen vaak worden gescored door morfologie te analyseren met behulp van lichtveld- of fluorescentiemicroscopie, evenals door gedrag te beoordelen.
Nadat het morfolino-fenotype is gedefinieerd, kan RNA-redding worden uitgevoerd om de doelspecificiteit aan te tonen. Na knockdown van het endogene mRNA door morfolino wordt synthetisch mRNA geïnjecteerd, dat hetzelfde eiwit codeert, maar niet de morfolino-doelsequentie bevat. Als dit geïnjecteerde RNA in staat is om het wildtype-fenotype van het organisme te herstellen, kunnen we concluderen dat het waargenomen morfolino-fenotype specifiek te wijten is aan het doelgen dat is geknocked down.
Nu je een idee hebt van wat morfolino's zijn en hoe gecontroleerde morfolino-experimenten kunnen worden uitgevoerd, laten we eens kijken hoe morfolino's vandaag de dag worden toegepast in biologische laboratoria.
In de celbiologie worden morfolino's gebruikt om vroege ontwikkelingsprocessen te begrijpen. De door cilia gegenereerde vloeistofstroom in de buis van Kupffer is een voorbeeld, die links-rechts patroonvorming in zebravissen regelt. De v
Q1: What are morpholinos and how do they differ from DNA?
Morpholinos are synthetic molecules made up of 25 oligonucleotides connected by a neutrally charged backbone. Unlike DNA, morpholinos contain morpholine rings in place of sugar groups found in the phosphate sugar backbone. This structural difference increases morpholino stability in cells and lowers their production cost, making them cost-effective tools for gene silencing in developmental research.
Q2: How do splice-blocking and translation-blocking morpholinos work differently?
Splice-blocking morpholinos bind to specific junctions and inhibit proper transcript processing, while translation-blocking morpholinos bind within the 5' untranslated region near the translational start site and prevent ribosome assembly. Both types reduce expression of functional target proteins, but they achieve gene silencing through distinct molecular mechanisms targeting different stages of gene expression.
Q3: Why is using independent morpholinos important for experimental design?
Independent, non-overlapping morpholinos complementary to the same gene ensure that observed phenotypic changes are due to knockdown of your target gene, not off-target effects. Since any given morpholino can bind to specific sequences on different genes, using multiple morpholinos confirms specificity and strengthens the validity of your developmental genetics techniques and applications.
Q4: When and where are morpholinos typically injected into zebrafish embryos?
Morpholinos are typically injected into zebrafish embryos between the one- and four-cell stage, into the yolk or cell cytoplasm. Cytoplasmic connections between embryonic cells allow for rapid diffusion and ubiquitous delivery of water-soluble morpholinos throughout the organism. The lowest dose producing a defined reliable phenotype in 50-75% of injected embryos is used to avoid lethality or unwanted off-target effects.
Q5: How is RNA rescue used to confirm morpholino target specificity?
Following morpholino knockdown of endogenous mRNA, synthetic mRNA encoding the same protein but lacking the morpholino target sequence is injected. If this injected RNA restores the wild-type phenotype, the observed morpholino phenotype is specifically due to target gene knockdown. This validation step confirms that the gene silencing effect is genuine and not caused by off-target interactions.
Q6: What are practical applications of morpholinos in studying vertebrate development?
Morpholinos are used to study early developmental processes like cilia-generated fluid flow in Kupffer's vesicle, which controls left-right patterning in zebrafish. They also model human genetic diseases by reproducing loss-of-function phenotypes and rapidly assaying pathogenic mutations. Additionally, microinjection of morpholinos into specific tissues enables researchers to study tissue regeneration with somatic stem cells and organ formation in adult zebrafish.
Q7: Why are zebrafish particularly suitable for morpholino-based gene silencing studies?
Zebrafish are ideal for morpholino research due to their rapid external development, transparency, and ease of observation using brightfield or fluorescence microscopy. Morpholino phenotypes are typically identified within the first three days post-fertilization and remain effective through day five. Additionally, zebrafish often have two gene copies from a whole-genome duplication event, requiring knockdown of both genes to model human protein deficiencies.