Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole
16 oktober 2015
Een protocol voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen op basis van in-situ synthese van ultrakleine fluorescerende gouden nanoclusters (Au NC's) met behulp van een door geneesmiddelen geladen eiwit als sjabloon wordt gepresenteerd. Deze methode is eenvoudig om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit te bepalen door een zichtbaar fluorescerend signaal dat wordt uitgezonden door de eiwit-gesjabloniseerde Au NC's.
Het algemene doel van deze nieuwe fluorometrische geneesmiddelenscreeningmethode is om de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmolecuuls tot een doelwit-eiwit te bepalen door fluorescerende goudnaanoclusters te vormen binnen het met geneesmiddel beladen eiwitsjabloon. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden op het gebied van eiwitgerichte geneesmiddelontdekking, zoals hoe de bindingskracht van geneesmiddelmoleculen de stabiliteit van eiwitten kan beïnvloeden, wat leidt tot de vorming van fluorescerende goudnaanoclusters met verschillende intensiteiten. Het grote voordeel van deze techniek is dat we een eiwitdoelwit kunnen omzetten in een fluorescerende biosensor om snel screening van kleine moleculaire geneesmiddelen mogelijk te maken zonder de noodzaak van geavanceerde instrumenten en vervelende labelprocesstappen.
De combinatie van mijn eigen kennis en de ontdekking van de co-auteur, die het eiwit belaadde, heeft een duidelijk stabiliserend effect op plasmonische. Nanodeeltjes inspireerden het idee voor deze methode. Begin deze procedure met de bereiding van de chemische reagentia voor geneesmiddelenscreening zoals gedetailleerd in het tekstprotocol om de goudnaanoclusters van humaan serumalbumine of HSA-sjabloon voor te bereiden, plaats twee glazen flesjes, elk met een micromagnetische roerstaaf, op twee afzonderlijke temperatuurcontroleerbare magnetische roerders.
Stel de temperatuur van één magnetische roerder in op 60 graden Celsius. Voeg vervolgens 200 microliter oplossing van humaan serumalbumine, 200 microliter ultrapuur water en 200 microliter goudchloride-oplossing toe aan elk flesje onder constant roeren om de inkapsling van goudionen in het eiwitsjabloon mogelijk te maken. Twee minuten later voegt u 20 microliter natriumhydroxide-oplossing toe aan elk flesje om de reducerende capaciteit van humaan serumalbumine te activeren die goudnaanoclusters vormt. Begin de reactietijd bij nul minuten om de 20 minuten te registreren.
Trek 50 microliter van elk monster en breng over naar een zwarte plaat met 384 putjes. Meet het emissiespectrum met een microplaatlezer. Stop de magnetische roerder na 100 minuten.
Koel de glazen flesjes af onder stromend water in een wasbak. Plot de foto-emissiespectra te allen tijde voor elk monster om de vormingskinetiek van goudnaanoclusters onder verschillende temperatuuromstandigheden te verkrijgen. Om de goudnaanoclusters van bovien serumalbumine of BSA-sjabloon voor te bereiden, plaats een glazen flesje met een micromagnetische roerstaaf bovenop een magnetische roerder.
Laat de temperatuur op kamertemperatuur staan. Meng 200 microliter BSA-oplossing, 200 microliter ureum en 200 microliter goudchloride-oplossing in het glazen flesje onder constant roeren. Twee minuten later 20 microliter natriumhydroxide-oplossing.
Om de reducerende capaciteit van BSA te activeren om goudnaanoclusters te vormen en begin de reactietijd bij nul minuten te registreren. Meet uurlijks het foto-emissiespectrum van het reactiemengsel. Plaats vijf glazen flesjes, elk met een magnetische roerstaaf en vooraf gelabeld met een geneesmiddel of zuiver HSA, op een temperatuurregelbare multipuntsmagneetstomer.
Voeg 200 microliter HSA toe aan elk flesje. Voeg vervolgens één microliter van elke eerder bereide geneesmiddeloplossing toe aan de vier bijbehorende bestanden. Voeg ook één microliter DMSO toe aan de controleschakelaar op de roerder.
Stel de snelheid van de spin in op 360 RPM en incubeer gedurende één uur om de binding van het geneesmiddel aan HSA mogelijk te maken. Eén uur later voegt u 200 microliter milli Q-water en 200 microliter goudchloride-oplossing toe aan elk flesje onder constant roeren. Stel de temperatuur in op 60 graden Celsius onder constant roeren gedurende 10 minuten. Na 10 minuten voegt u 20 microliter 1,5 molaire natriumhydroxide toe aan elk flesje en begint u de reactietijd bij nul minuten te registreren.
De gemeenschappelijke reactie-oplossingen voor meting moeten dezelfde volgorde van het toevoegen van geneesmiddelen volgen en moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om het tijdsvertragingseffect te minimaliseren. Trek snel 50 microliter oplossing uit elk flesje. Breng over naar een zwarte plaat met 384 putjes en meet het emissiespectrum. Registreer het emissiespectrum van elk monster om de 10 minuten, waarbij u ten minste vier spectra op vier verschillende tijdstippen verzamelt.
Herhaal deze stappen meerdere keren om resultaten met een consistente trend te verkrijgen. Plot de tijdsopgeloste foto-emissiespectra voor elk monster. Identificeer de piekintensiviteit van alle monsters en plot tegen de tijd om de vormingskinetiek van goudnaanoclusters in verschillende met geneesmiddel beladen eiwitsjablonen te vergelijken om de bindingsconstante tussen elk geneesmiddel en de HSA te meten.
Vervang de geneesmiddeloplossingen door ibuprofenoplossingen in vier verschillende concentraties. Koel de glazen flesjes 10 minuten later af onder stromend water in een wasbak. Trek 50 microliter van de bovenstaande oplossingen uit elk flesje naar een zwarte plaat met 384 putjes en meet het emissiespectrum.
Herhaal deze stappen nog twee keer om nog twee sets resultaten te verkrijgen bij verschillende geneesmiddelconcentraties voordat u de magnetische roerder stopt. Plot vervolgens de foto-emissiespectra en analyseer de resultaten voor de grond verkregen in elke individuele batch. Plot de foto-emissiespectra van elk monster in software zoals Origin Pro en bepaal de piekintensiviteit.
Bereken en plot de relatieve fluorescentie-intensiteit tegen de geneesmiddelconcentratie. Bereken vervolgens de bindingsconstante door de gegevens aan te passen aan een bindingsmodel met één site. Gebruik de Mics cementin-vergelijking om dit te doen in software zoals Origin Pro.
Selecteer het menu-analyse-aanpassing niet-lineaire curve-aanpassing, selecteer vervolgens de functie hagel uit de categorie groeisigmoidal op de functieselectiepagina van de instellingen. Klik op aanpassen om weer te geven. De aangepaste resultaten die hier worden getoond, zijn representatieve resultaten van de tijdsopgeloste foto-emissiespectra van goudnaanoclusters geproduceerd onder verschillende eiwitdenaturatieomstandigh
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een nieuwe methode voor medicijnscreening die gebruik maakt van in-situ synthese van fluorescente gouden nanoclusters (Au NC's) binnen een met geneesmiddel beladen eiwitsjabloon. De benadering maakt het mogelijk om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan doeleiwitten te bepalen door middel van zichtbare fluorescentie, waardoor het screeningproces wordt vereenvoudigd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Geneesmiddelontdekking
- Eiwitchemie
- Nanotechnologie
Achtergrond
- Het begrijpen van interacties tussen geneesmiddelen en eiwitten is cruciaal voor effectief geneesmiddelontwerp.
- Traditionele methoden voor het screenen van geneesmiddelbinding kunnen complex en tijdrovend zijn.
- Fluorescente biosensoren kunnen snelle inzichten geven in moleculaire interacties.
- Goudnanoclusters hebben unieke optische eigenschappen die kunnen worden benut voor detectie.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudige en efficiënte methode te ontwikkelen voor het screenen van kleine moleculaire geneesmiddelen.
- Om eiwitsijabloons te gebruiken voor de synthese van fluorescente gouden nanoclusters.
- Om het begrip van geneesmiddelbindingsaffiniteiten en hun effecten op eiwitstabiliteit te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van chemische reagentia voor geneesmiddelscreening.
- Gebruik van humaan serumalbumine (HSA) als sjabloon voor de synthese van gouden nanoclusters.
- Implementatie van magnetisch roeren voor reactiecontrole.
- Meting van fluorescentie-intensiteit om geneesmiddelbinding te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- De methode produceerde met succes fluorescente gouden nanoclusters binnen de eiwitsjabloon.
- Fluorescentie-intensiteit correleerde met de bindingsaffiniteit van geneesmiddelmoleculen.
- De benadering toonde potentieel voor snelle geneesmiddelscreening zonder complexe instrumentatie.
- Stabiliseringseffecten van met geneesmiddel beladen eiwitten werden waargenomen.
Conclusies
- Deze nieuwe screeningmethode biedt een eenvoudige aanpak om geneesmiddel-eiwitinteracties te evalueren.
- Het kan sneller geneesmiddelontdekkingsprocessen in het gebied van biomedische wetenschap vergemakkelijken.
- Het gebruik van fluorescente biosensoren vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in geneesmiddelscreeningmethodologieën.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables rapid, label-free assessment of small molecule binding to target proteins using fluorescence readout from in situ synthesized gold nanoclusters. It supports early-stage target validation by providing quantitative, reproducible binding affinity data without sophisticated instrumentation. The approach improves screening throughput and reduces mechanistic ambiguity in lead identification workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures relative binding strength of drug candidates to albumin proteins via inverse correlation of fluorescence intensity with binding affinity.
- Operational Value: Enables parallel screening of multiple compounds in 384-well format with results obtainable in approximately 30 minutes.
- Predictive Value: Supports go/no-go decisions by identifying compounds with higher binding affinity through lower fluorescent signal output.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence intensity outputs that correlate with drug-protein binding constants (KD) when drug concentration is varied.
- Reproducibility: Uses standardized denaturing conditions (60°C or urea) to ensure consistent nanocluster formation kinetics across replicates.
- Scalability: Compatible with high-density microplate formats for parallel compound evaluation in screening cascades.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides binding affinity data that can inform preclinical dose selection and target engagement studies.
- Mechanistic De-risking: Links drug-induced protein stabilization to reduced nanocluster formation, offering insight into binding effects on protein conformation.
- Platform Reuse: Adaptable to other serum albumin models (e.g., BSA) and extensible to additional drug-target systems beyond the validated ibuprofen-HSA model.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting lead identification by delivering binding affinity measurements that precede functional assays and medicinal chemistry optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of drug-target interactions through direct fluorescence readout of binding-induced changes in protein nanocluster templating.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs suitable for primary screening campaigns requiring affinity ranking of compound libraries.
- Analytics: Produces time-resolved fluorescence emission spectra and peak intensity measurements that allow kinetic and equilibrium binding analysis.
- Translational Research: Supports advancement decisions by providing KD estimates alignable with orthogonal biophysical methods.
- Enterprise Reuse: Represents a portable, low-infrastructure capability for binding affinity assessment across multiple projects and protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by correlating fluorescence signal with binding affinity through a physical transduction mechanism.
- Operational Value: Eliminates need for fluorescent labeling or complex detection systems, reducing assay development time and reagent costs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of compounds based on binding strength before investing in downstream characterization.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by delivering early, quantitative binding data that inform lead optimization paths.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, fluorescence spectroscopy, and nonlinear regression for binding constant calculation.
- Dependent on access to temperature-controlled magnetic stirrers, microplate readers with emission scanning capability, and 384-well black plates.
- Necessitates standardization of denaturing conditions (temperature or urea concentration) across laboratories to ensure reproducible nanocluster formation.
- Adaptation to non-albumin proteins may require optimization of reducing conditions and nanocluster templating efficiency.
- Practical limitation: Method assumes drug binding alters protein’s reducing microenvironment; may not apply to targets where binding does not affect nanocluster nucleation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Synthesis of Protein-templated Gold Nanoclusters (Au NCs)
3:17
Screen Relative Binding Affinity of Different Small Molecular Drugs to HSA
5:19
Measure the Binding Constant of a Specific Drug to HSA
6:41
Results: Studying Protein-drug Binding by Forming Fluorescent Gold Nanoclusters (Au NCs) using Drug-loaded Serum Albumen as Template
7:53
Conclusion
