Name: Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Leer een snelle fluorimetrische methode voor het screenen van eiwit-gerichte kleine molecuul geneesmiddelen met behulp van fluorescerende goudnanoclusters in een eiwitmalplaatje. Deze aanpak versnelt het ontdekken van geneesmiddelen aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Y.N.T. wil de Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore, bedanken voor de financiële ondersteuning in het kader van de JCO CDA-subsidie 13302FG063.

Let op: Gelieve de veiligheidsinformatiebladen (SDS) van alle betrokken chemicaliën te raadplegen voor gebruik. De drug screening experiment omvat de synthese en verwerking van nanomaterialen die aanvullende gevaar kunnen hebben dan hun omvang tegenhanger. Zorg ervoor dat alle nodige controlemaatregelen om te worden beoefend gedurende het experiment, waaronder het gebruik van technische controles (zuurkast) en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM, bijvoorbeeld veiligheid lengte broek, dichte schoenen, chemisch bestendige handschoenen en veiligheidsbril). 1. Voorbereiding van de chemische reagentia voor drugscontrole <ol><li> Voorlopers voor Au NC synthese <ol><li> Los 30 mg van goud (III) chloride-oplossing (99,99% sporenmetalen basis, 30 gew.% In verdund HCl) in 6,9 ml ultrazuiver water te bereiden 15 mM goud (III) chloride-oplossing. Let op: goudchloride oplossing is corrosief en irriterend. Draag de juiste beschermingsmiddelen om direct contact met de ogen en de huid te voorkomen. </li><li> Dissolve 74 mg HSA en BSA in 1 ml ultrazuiver water tot 74 mg / ml eiwit voorraadoplossing te bereiden. </li></ol></li><li> Drug oplossingen <ol><li> Los de gewenste hoeveelheid geneesmiddel, bijvoorbeeld 1,9 mg (a) ibuprofen, 2,8 mg (b) warfarine, 2,3 mg (c) fenytoïne en 1,5 mg (d) sulfanilamide in 20 pl DMSO te bereiden 450 mM drug voorraad oplossingen. Opmerking: DMSO wordt geselecteerd als oplosmiddel, omdat deze geneesmiddelen zijn hydrofoob en hebben een slechte oplosbaarheid in water. </li></ol></li><li> Andere reagentia <ol><li> Los 600 mg NaOH pellets in 10 ml ultrazuiver water voor productie van 1.5 M NaOH-oplossing. Los 2,4 g ureum in 2 ml ultrazuiver water te bereiden van 20 M ureumoplossing. </li></ol></li></ol> 2. Synthese van Protein Templated Au NC <ol><li> HSA-templated Au NC (HSA-Au NC) <ol><li> Plaats twee glazen flesjes, die elk een micro magnetische roerder daarin, op twee afzonderlijke temperatuur regelbare magnetische roerderrers. </li><li> Stel de temperatuur van een magnetische roerder tot 60 ° C, en label het glazen flesje bovenop het als &quot;60 ° C&quot;; terwijl de andere magnetische roerder wordt bewaard bij kamertemperatuur (RT) waarbij het glazen flesje erbovenop is gelabeld als &quot;RT&quot;. </li><li> Voeg 200 ul van HSA-oplossing, 200 ul ultrazuiver water en 200 gl goud (III) chloride-oplossing in elk flesje onder constant roeren (ingesteld op 360 rpm, tenzij anders vermeld) op de inkapseling van Au ionen in het eiwit sjabloon toe. </li><li> 2 min later, voeg 20 ul NaOH aan elk flesje teneinde het reducerende vermogen van HSA in vormen Au NC&#39;s activeren en om de reactietijd te nemen als 0 min. </li><li> Elke 20 min opneming 50 ul van oplossingen van elk monster op een 384 putjes zwarte plaat en meet het emissiespectrum met een microplaat reader. De typische scannen opstelling: λ ex = 370 nm, em λ = 410-850 nm. </li><li> Stop de magneetroerder na 100 min. </li><li> Afkoelen van de glazen flesjes onder stromend water in een gootsteen. Let op: De glazen flesjes zijn hot. Draag hittebestendige handschoenen om branden te voorkomen. </li><li> Plot de foto-emissie spectra te allen tijde voor elk monster om de vorming kinetiek van Au NC verwerven bij verschillende temperaturen. </li></ol></li><li> BSA-templated Au NC (BSA-Au NC) <ol><li> Plaats een glazen flacon met een micro magnetische roerstaaf bovenop een magnetische roerder. Laat de temperatuur kamertemperatuur. </li><li> Meng 200 gl BSA-oplossing, 200 ul van ureum en 200 pl goud (III) chloride-oplossing in het glazen flesje onder constant roeren. </li><li> 2 min later, voeg 20 ul NaOH oplossing voor het verminderen van vermogen van BSA activeren Au NC vormen en beginnen de reactietijd te nemen als 0 min. Meet het foto-emissie-spectrum van het reactiemengsel per uur. Opmerking: De foto-emissie spectrum van de BSA-Au NC wordt gemetenminder vaak omdat de vormingssnelheid van BSA-Au NC langzamer is dan die van HSA-Au bij dezelfde temperatuur door minder doeltreffendheid van ureum aan het eiwit ontvouwen. </li><li> Stop de magneetroerder na 7 uur. Plot de foto-emissie spectra te allen tijde tot de vorming kinetiek van Au NC zien door ureum denaturatie. </li></ol></li></ol> 3. Kleine Moleculaire drugscontrole <ol><li> Scherm relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen aan HSA <ol><li> Leg vijf glazen flesjes, elk met een magnetische roerstaaf erin, op een temperatuur regelbare multipoint magneetroerder. Label deze flesjes als a, b, c en d respectievelijk voor elk geneesmiddel, namelijk ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide. Label degene met zuivere HSA als controle. </li><li> Voeg 200 ul van HSA aan elk flesje. Voeg 1 pl geneesmiddeloplossing de vier overeenkomstige flesjes. Voeg 1 pl van DMSO met de controle. Schakel de roerder en stel de rotatie snelheid 360rpm en incubeer gedurende 1 uur om de drug binding aan HSA te voltooien. </li><li> 1 uur later, voeg 200 ul Milli-Q water en 200 gl van goud (III) chloride-oplossing in elk flesje onder constant roeren. Stel de temperatuur tot 60 ° C onder constant roeren gedurende 10 min. Voeg 20 ul van 1,5 M NaOH aan elk flesje en begint de reactietijd te nemen als 0 min. </li><li> Snel tekenen 50 pi oplossing uit elke flacon tot een 384-wells zwarte plaat en meet de emissiespectrum (resultaten gelabeld als 0 min). Noteer de emissiespectra van elk monster elke 10 min. Vang minimaal vier spectra op vier verschillende tijdstippen, dat wil zeggen 0, 10, 20 en 30 min. </li><li> Herhaal de stappen 3.1.1 - 3.1.4 meerdere malen om de resultaten met een consistente trend te verkrijgen. Stop de magneetroerder. </li><li> Zet de tijdsopgeloste foto-emissie spectra voor elk monster (a - d en controle). Identificeer de piek intensiteit van alle monsters en het complot tegen de tijd om de vorming kinetiek van Au NC vergelijken different-geneesmiddel geladen eiwit sjablonen. </li></ol></li><li> Meet de bindingsconstante van een specifiek geneesmiddel voor HSA <ol><li> Herhaal de stappen 3.1.1 - 3.1.4. Vervang de drug oplossing met ibuprofen oplossingen op vier verschillende concentraties (met inbegrip van een controle-monster met behulp van HSA alleen zonder drugs laden). Label de glazen ampul volgens de geneesmiddelconcentratie dienovereenkomstig. </li><li> 10 minuten later, afkoelen van de glazen flesjes onder stromend water in een gootsteen. Let op: De glazen flesjes zijn hot. Draag hittebestendige handschoenen om branden te voorkomen. </li><li> Teken 50 pl van de bovenstaande oplossingen uit elke flacon een 384 putjes zwarte plaat en meet het emissiespectrum. </li><li> Herhaal stap 3.2.1 - 3.2.3 tweemaal nog twee reeksen resultaten te verkrijgen bij verschillende geneesmiddelconcentraties. </li><li> Stop de magneetroerder. Plot van de foto-emissie spectra en de resultaten te analyseren. <ol><li> Voor het ruwe gegevens uit elke afzonderlijke batch plot de foto-emissie spectra van elkmonster in software zoals OriginPro software en ontdek de piek intensiteit. </li><li> Berekenen en plot van de relatieve fluorescentie-intensiteit [(I 0 - I) / I 0] tegen de concentratie van het geneesmiddel, waar ik en ik 0 verwijzen naar de fluorescentie-intensiteit van Au NC gevormd in-geneesmiddel beladen HSA en zuivere HSA, respectievelijk. </li><li> Bereken de bindingsconstante van de montage van de data op een enkele plaats bindingsmodel met de Michaelis-Menten vergelijking: Y = Rmax x C / (K D + C), waarbij R max wordt de maximaal reactiesignaal, C de concentratie van ligand en KD is de bindingsconstante. Voer deze in software zoals OriginPro. Kies in het menu Analyse Fitting lineaire Curve Fit, selecteer Hill functie van Groei / sigmoïdale categorie. Op de instellingen: Function Selection pagina, klik op Aanpassen aan te tonen van de ingebouwde resultaten. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Solution-Based+Medicinal+Library+Screening+against+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin.</a> Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).</li>
<li>Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Analytical+Strategy+to+Measure+Drug%E2%80%93Plasma+Protein+Interactions%3A+From+High-Throughput+to+In-Depth+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Toda%22%5BJournal%5D)">Global Analytical Strategy to Measure Drug–Plasma Protein Interactions: From High-Throughput to In-Depth Analysis.</a> Drug Discov. Toda. 18, 1030-1034 (2013).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdomain+Ib+Is+The+Third+Major+Drug+Binding+Region+of+Human+Serum+Albumin%3A+Toward+The+Three-Sites+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Subdomain Ib Is The Third Major Drug Binding Region of Human Serum Albumin: Toward The Three-Sites Model.</a> Mol. Pharm. 10, 1668-1682 (2013).</li>
<li>Dalvit, C., Fagerness, P. E., Hadden, D. T. A., Sarver, R. W., Stockman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorine-NMR+Experiments+for+High-Throughput+Screening%3A+Theoretical+Aspects%2C+Practical+Considerations%2C+and+Range+of+Applicability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Fluorine-NMR Experiments for High-Throughput Screening: Theoretical Aspects, Practical Considerations, and Range of Applicability.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7696-7703 (2003).</li>
<li>Ghuman, J., Zunszain, P. A., Petitpas, I., Bhattacharya, A. A., Otagiri, M., Curry, S. Structural Basis of the Drug-binding Specificity of Human Serum. 353, 38-52 (2005).</li>
<li>Mao, H., Hajduk, P. J., Craig, R., Bell, R., Borre, T., Fesik, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+Design+of+Diflunisal+Analogues+with+Reduced+Affinity+for+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Rational Design of Diflunisal Analogues with Reduced Affinity for Human Serum Albumin.</a> J. Am. Chem. Soc. 123, 10429-10435 (2001).</li>
<li>Dalvit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+NMR-Based+Screening+with+Competition+Binding+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">High-Throughput NMR-Based Screening with Competition Binding Experiments.</a> J. Am. Chem. Soc. 124, 7702-7709 (2002).</li>
<li>Krenzel, E. S., Chen, Z., Hamilton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correspondence+of+Fatty+Acid+and+Drug+Binding+Sites+on+Human+Serum+Albumin%3A+A+Two-Dimensional+Nuclear+Magnetic+Resonance+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Correspondence of Fatty Acid and Drug Binding Sites on Human Serum Albumin: A Two-Dimensional Nuclear Magnetic Resonance Study.</a> Biochemistr. 52, 1559-1567 (2013).</li>
<li>Lee, Y., Zeng, H., Ruedisser, S., Gossert, A. D., Hilty, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Magnetic+Resonance+of+Hyperpolarized+Fluorine+for+Characterization+of+Protein%E2%80%93Ligand+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Nuclear Magnetic Resonance of Hyperpolarized Fluorine for Characterization of Protein–Ligand Interactions.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 17448-17451 (2012).</li>
<li>Salvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boosting+the+Sensitivity+of+Ligand%E2%80%93Protein+Screening+by+NMR+of+Long-Lived+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Boosting the Sensitivity of Ligand–Protein Screening by NMR of Long-Lived States.</a> J. Am. Chem. Soc. 134, 11076-11079 (2012).</li>
<li>Zsila, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+Dichroism+Spectroscopic+Detection+of+Ligand+Binding+Induced+Subdomain+IB+Specific+Structural+Adjustment+of+Human+Serum+Albumin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circular Dichroism Spectroscopic Detection of Ligand Binding Induced Subdomain IB Specific Structural Adjustment of Human Serum Albumin.</a> J. Phys. Chem. 117, 10798-10806 (2013).</li>
<li>Navratilova, I., Hopkins, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragment+Screening+by+Surface+Plasmon+Resonance%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fragment Screening by Surface Plasmon Resonance.</a> ACS Med. Chem. Lett. 1, 44-48 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+Phase+SPR+Biosensor+for+Efficient+Targeted+Drug+Screening+with+High+Sensitivity+and+Stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sensor.+Actuat.+B-Che%22%5BJournal%5D)">Investigation of Phase SPR Biosensor for Efficient Targeted Drug Screening with High Sensitivity and Stability.</a> Sensor. Actuat. B-Che. 209, 313-322 (2015).</li>
<li>Lu, Y., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-Nanometre+Sized+Metal+Clusters%3A+From+Synthetic+Challenges+to+The+Unique+Property+Discoveries%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Sub-Nanometre Sized Metal Clusters: From Synthetic Challenges to The Unique Property Discoveries.</a> Chem. Soc. Rev. 41, 3594-3623 (2012).</li>
<li>Yu, Y., Yao, Q., Luo, Z., Yuan, X., Lee, J. Y., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+Engineering+and+Controlled+Conversion+for+The+Synthesis+of+Monodisperse+Thiolate-Protected+Metal+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Precursor Engineering and Controlled Conversion for The Synthesis of Monodisperse Thiolate-Protected Metal Nanoclusters.</a> Nanoscal. 5, 4606-4620 (2013).</li>
<li>Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+Sized%2C+Thiolate-Protected+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Quantum Sized, Thiolate-Protected Gold Nanoclusters.</a> Nanoscal. 2, 343-362 (2010).</li>
<li>Jiang, D. -e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Expanding+Universe+of+Thiolated+Gold+Nanoclusters+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">The Expanding Universe of Thiolated Gold Nanoclusters and Beyond.</a> Nanoscal. 5, 7149-7160 (2013).</li>
<li>Aikens, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+Structure+of+Ligand-Passivated+Gold+and+Silver+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Electronic Structure of Ligand-Passivated Gold and Silver Nanoclusters.</a> J. Phys. Chem. Lett. 2, 99-104 (2010).</li>
<li>Gao, Y., Shao, N., Pei, Y., Chen, Z., Zeng, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+Activities+of+Subnanometer+Gold+Clusters+%28Au16%E2%80%93Au18%2C+Au20%2C+and+Au27%E2%80%93Au35%29+for+CO+Oxidation.+ACS%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nan%22%5BJournal%5D)">Catalytic Activities of Subnanometer Gold Clusters (Au16–Au18, Au20, and Au27–Au35) for CO Oxidation. ACS.</a> ACS Nan. 5, 7818-7829 (2011).</li>
<li>Negishi, Y., Nobusada, K., Tsukuda, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione-Protected+Gold+Clusters+Revisited%3A+Bridging+the+Gap+between+Gold%28I%29%E2%88%92Thiolate+Complexes+and+Thiolate-Protected+Gold+Nanocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Glutathione-Protected Gold Clusters Revisited: Bridging the Gap between Gold(I)−Thiolate Complexes and Thiolate-Protected Gold Nanocrystals.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 5261-5270 (2005).</li>
<li>Zhu, M., Aikens, C. M., Hollander, F. J., Schatz, G. C., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+the+Crystal+Structure+of+A+Thiol-Protected+Au25+Cluster+and+Optical+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Correlating the Crystal Structure of A Thiol-Protected Au25 Cluster and Optical Properties.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 5883-5885 (2008).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Highly+Luminescent+Au22%28SG%2918+Nanocluster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of a Highly Luminescent Au22(SG)18 Nanocluster.</a> J. Am. Chem. Soc. 136, 1246-1249 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+at+the+Core%E2%80%93Ligand+Interface+of+Au+Lipoic+Acid+Nanoclusters+That+Enhances+the+Near-IR+Luminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation at the Core–Ligand Interface of Au Lipoic Acid Nanoclusters That Enhances the Near-IR Luminescence.</a> J. Phys. Chem. 118, 20680-20687 (2014).</li>
<li>Zhu, Y., Qian, H., Jin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Atomic-Level+Strategy+for+Unraveling+Gold+Nanocatalysis+from+the+Perspective+of+Aun%28SR%29m+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Eur.+J%22%5BJournal%5D)">An Atomic-Level Strategy for Unraveling Gold Nanocatalysis from the Perspective of Aun(SR)m Nanoclusters.</a> Chem. Eur. J. 16, 11455-11462 (2010).</li>
<li>Niesen, B., Rand, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+Film+Metal+Nanocluster+Light-Emitting+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Thin Film Metal Nanocluster Light-Emitting Devices.</a> Adv. Mater. 26, 1446-1449 (2014).</li>
<li>Shang, L., Dong, S. J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-Small+Fluorescent+Metal+Nanoclusters%3A+Synthesis+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Toda%22%5BJournal%5D)">Ultra-Small Fluorescent Metal Nanoclusters: Synthesis and Biological Applications.</a> Nano Toda. 6, 401-418 (2011).</li>
<li>Wu, X., He, X., Wang, K., Xie, C., Zhou, B., Qing, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasmall+Near-Infrared+Gold+Nanoclusters+for+Tumor+Fluorescence+Imaging+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Ultrasmall Near-Infrared Gold Nanoclusters for Tumor Fluorescence Imaging in Vivo.</a> Nanoscal. 2, 2244-2249 (2010).</li>
<li>Archana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular-Receptor-Specific%2C+Non-Toxic%2C+Near-Infrared-Emitting+Au+Cluster-Protein+Nanoconjugates+for+Targeted+Cancer+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnolog%22%5BJournal%5D)">Molecular-Receptor-Specific, Non-Toxic, Near-Infrared-Emitting Au Cluster-Protein Nanoconjugates for Targeted Cancer Imaging.</a> Nanotechnolog. 21, 055103(2010).</li>
<li>Yue, Y., Liu, T. Y., Li, H. W., Liu, Z. Y., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-Assisted+Synthesis+of+BSA-Protected+Small+Gold+Nanoclusters+and+Their+Fluorescence-Enhanced+Sensing+of+Silver%28I%29+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscal%22%5BJournal%5D)">Microwave-Assisted Synthesis of BSA-Protected Small Gold Nanoclusters and Their Fluorescence-Enhanced Sensing of Silver(I) Ions.</a> Nanoscal. 4, 2251-2254 (2012).</li>
<li>Liu, Y., Ai, K., Cheng, X., Huo, L., Lu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+Nanocluster+Based+Fluorescent+Sensors+for+Highly+Sensitive+and+Selective+Detection+of+Cyanide+in+Water%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Gold Nanocluster Based Fluorescent Sensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Cyanide in Water.</a> 20, 951-1907 (2010).</li>
<li>Liu, J., Yu, M., Zhou, C., Yang, S., Ning, X., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+Tumor+Targeting+of+Renal-Clearable+Luminescent+Gold+Nanoparticles%3A+Long+Tumor+Retention+and+Fast+Normal+Tissue+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Passive Tumor Targeting of Renal-Clearable Luminescent Gold Nanoparticles: Long Tumor Retention and Fast Normal Tissue Clearance.</a> J. Am. Chem. Soc. 135, 4978-4981 (2013).</li>
<li>Negishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Loading+of+Small+Aun+Clusters+%28n+%3D+10%E2%80%9339%29+onto+BaLa4Ti4O15+Photocatalysts%3A+Toward+an+Understanding+of+Size+Effect+of+Co-Catalyst+on+Water+Splitting+Photocatalytic+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+C%22%5BJournal%5D)">Controlled Loading of Small Aun Clusters (n = 10–39) onto BaLa4Ti4O15 Photocatalysts: Toward an Understanding of Size Effect of Co-Catalyst on Water Splitting Photocatalytic Activity.</a> J. Phys. Chem. C. , (2015).</li>
<li>Xie, J., Zheng, Y., Ying, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Directed+Synthesis+of+Highly+Fluorescent+Gold+Nanoclusters%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Protein-Directed Synthesis of Highly Fluorescent Gold Nanoclusters.</a> J. Am. Chem. Soc. 131, 888-889 (2009).</li>
<li>Celej, M. S., Montich, G. G., Fidelio, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Stability+Induced+by+Ligand+Binding+Correlates+with+Changes+in+Protein+Flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Stability Induced by Ligand Binding Correlates with Changes in Protein Flexibility.</a> Protein Sci. 12, 1496-1506 (2003).</li>
<li>Layton, C. J., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Analysis+of+Ligand-Induced+Changes+in+Protein+Thermal+Unfolding+Applied+to+High-Throughput+Determination+of+Ligand+Affinities+with+Extrinsic+Fluorescent+Dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistr%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Analysis of Ligand-Induced Changes in Protein Thermal Unfolding Applied to High-Throughput Determination of Ligand Affinities with Extrinsic Fluorescent Dyes.</a> Biochemistr. 49, 10831-10841 (2010).</li>
<li>Yu, Y., New, S. Y., Xie, J., Su, X., Tan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Based+Fluorescent+Metal+Nanoclusters+for+Small+Molecular+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Protein-Based Fluorescent Metal Nanoclusters for Small Molecular Drug Screening.</a> Chem. Commun. 50, 13805-13808 (2014).</li>
<li>Shortridge, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Nuclear+Magnetic+Resonance+Affinity+Screening+Methods+for+Functional+Annotation+of+Proteins+and+Drug+Discover%22">Nuclear Magnetic Resonance Affinity Screening Methods for Functional Annotation of Proteins and Drug Discover</a>. , The University of Nebraska - Lincoln. (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn verschillende kritische stappen die moeten worden benadrukt in deze werkwijze. In het protocol van het screenen van de relatieve bindingsaffiniteit van verschillende kleine moleculaire geneesmiddelen, stappen 3.1.2, 3.1.3 en 3.1.4 zijn van cruciaal belang om goede resultaten te tonen consistente trend voor de relatieve bindende kracht te verkrijgen. In deze stappen, moet het optreden van toevoeging van chemicaliën en tekenen reactieoplossingen voor meting zo snel mogelijk op de tijdspanne effect en dezelfde volg...

Serum albuminen zoals menselijk serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) zijn de meest voorkomende eiwitten in plasma en speelt een essentiële rol bij het handhaven van de osmotische druk van het bloedcompartiment. Ze zijn ook bekend als dragereiwitten voor kleine moleculen met lage oplosbaarheid in water, zoals steroïden, vetzuren, schildklierhormonen en diverse geneesmiddelen. De bindingseigenschap (bijvoorbeeld bindingsplaatsen, bindingsaffiniteit of sterkte) van deze moleculen serum albumine een belangrijk onderwerp farmacokinetiek. 1-4 verschillende analysemethoden zijn ontwikkeld voor de studie van de bindingseigenschappen van verschillende geneesmiddelen op albuminen serum, zoals röntgenkristallografie 5,6 kernspinresonantie (NMR), 11/07 en surface plasmon resonance (SPR), 12,13 etc. Echter, deze werkwijzen beperkt door ofwel een vervelend en tijdrovend analyseproces (bijvoorbeeld groei van éénkristal röntgen- Crystallografisch onderzoek), vereiste gespecialiseerde en dure apparatuur (SPR), of behoefte aan dure isotopen (NMR) voor detectie. Het is derhalve zeer gewenst om alternatieve manieren om kleine moleculaire drugonderzoek ontwikkelen snel, straight-forward en kostenefficiënte wijze. Nanoclusters goud (Au NC&#39;s) zijn een speciaal type nanomateriaal, waarvan enkele tot tientallen metaalatomen met afmetingen kleiner dan 2 nm. 14-17 Zij hebben uitgebreid onderzoek belangen aangetrokken bevatten vanwege hun discrete en grootte-afhankelijke elektronische structuur, 18, 19 en moleculair-achtige absorpties en emissies. 20-23 Deze unieke materiaaleigenschappen, in het bijzonder de sterke fluorescentie, hebben diverse toepassingen zoals detectie en beeldvorming in biologische systemen. 24-32 Ultrakleine fluorescent Au NC&#39;s kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van functionele eiwitten, zoals serumalbuminen, als matrijs. 33 In een typische eiwit templated synthese van<html> Au NCs worden een zekere Au zouten eerst ingekapseld binnen het eiwit en vervolgens gereduceerd door het eiwit zelf. Het reducerende vermogen van het eiwit wordt toegeschreven aan functionele aminozuurresiduen (bijvoorbeeld tyrosine) die kunnen worden geactiveerd door verhoging van de pH van de oplossing alkalisch samenstellende. Ontvouwen van eiwitstructuur wordt beschouwd als een kritische stap voor de vorming van Au NC. Dit komt omdat in een ongevouwen eiwit kan verminderen meer functionele groepen worden blootgesteld aan de ingekapselde Au zouten. Eiwitontvouwende kan worden verkregen door warmtebehandeling of blootstelling aan denaturerende agentia. Introductie van kleine moleculaire geneesmiddelen kan ook invloed hebben op de ontplooiing, dwz het modificeren van het middelpunt denaturatietemperatuur en de enthalpie van ontvouwen. 34,35 Het effect van al deze factoren, op zijn beurt kan worden weerspiegeld door de vorming kinetiek van fluorescerende Au NC en gemanifesteerd in de fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC. 36 e_content &quot;&gt; Deze video toont de werkwijze het screenen van geneesmiddelen door het synthetiseren Au NC&#39;s in met geneesmiddel beladen albumine-eiwitten bij een hogere temperatuur (60 ° C) of in de aanwezigheid van denaturerende middelen (bijvoorbeeld ureum). De fluorescentie-intensiteit van de overblijvende Au NC is het signaal uitlezing. Eerst Au NC gesynthetiseerd in HSA en BSA templates behandeld bij 60 ° C of in aanwezigheid van ureum aan hoe eiwitontvouwende (geïnduceerd door hittebehandeling of denatureringsmiddelen) beïnvloedt de vorming kinetiek van Au NC&#39;s. Ten tweede, Au NC worden gesynthetiseerd eiwit templates voorgeladen met andere geneesmiddelen en de geneesmiddelbelading effect op de relatieve fluorescentie-intensiteiten van de overblijvende Au NC bestudeerd, waarbij de mate van relatieve binding sterkte. Tenslotte wordt het au NC-drug discovery protocol gemodificeerd kwantitatieve meting van drug-proteïne-bindingsconstante (K D) door het variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit van een vaste concentratie.

<table><tbody><tr><td>Gold (III) chloride oplossing, 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484385</td><td>Corrosief, irriterend</td></tr><tr><td>Humaine serum albumine, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1887</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine, 96%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Ibuprofen, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4883&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Warfarin, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2250</td><td></td></tr><tr><td>Fenytoine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1139</td><td></td></tr><tr><td>Sulfanilamide, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5128</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td></td></tr><tr><td>Magneetsche roerder</td><td>IKA</td><td>RT5</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td></td></tr><tr><td>384-well plate</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml luchtverplaatsing pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956;l luchtverplaatsing pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956;l luchtverplaatsing pipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5.000 &#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.000 &#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &#956;l Eppendorf tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml microbuis</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 ml glazen flesje met schroefdop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 ml glazen flesje met schroefdop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een snelle en kwantitatieve fluorimetrische methode voor-eiwit targeting small molecule drugscontrole

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We laten een nieuw geneesmiddel screening methode voor het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen met een doeleiwit door de vorming van fluorescerende nanoclusters goud (Au NC) in de met geneesmiddel beladen eiwitten, gebaseerd op de differentiële fluorescentiesignaal uitgestraald door de Au NC&#39;s. Albumine eiwitten zoals humaan serumalbumine (HSA) en runderserumalbumine (BSA) gekozen als model eiwitten. Vier kleine moleculaire geneesmiddelen (bijvoorbeeld ibuprofen, warfarine, fenytoïne en sulfanilamide) van verschillende bindingsaffiniteiten aan het albumine-eiwitten worden getest. Gevonden werd dat de vormingssnelheid van fluorescente Au NC binnen het geneesmiddel geladen albumine-eiwit onder denaturerende omstandigheden (dat wil zeggen 60 ° C of in aanwezigheid van ureum) is trager dan dat gevormd in het oorspronkelijke eiwit (zonder geneesmiddelen). Bovendien wordt de fluorescentie-intensiteit van de zo gevormde NC gevonden invers gecorreleerd aan de bindingsaffiniteiten van deze geneesmiddelen aan de albumine-eiwitten. Bijzonder,hoe hoger de drug-proteïne-bindingsaffiniteit, hoe langzamer de snelheid van Au NC vorming, en dus een lagere fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NC&#39;s waargenomen. De fluorescentie-intensiteit van de resulterende Au NCs verschaft derhalve een eenvoudige maat voor de relatieve sterkte van binding verschillende geneesmiddelen getest. Deze methode is ook uit te breiden tot het specifieke geneesmiddel-eiwitbinding constante (KD) te meten door eenvoudigweg variëren van de hoeveelheid geneesmiddel voorgeladen in het eiwit op een vaste eiwitconcentratie. De gemeten resultaten goed overeenkomen met de verkregen met behulp van andere prestige maar ingewikkelder methoden waarden.

Eiwitontvouwende is een belangrijke procedure voor de vorming van eiwit-templated Au NC omdat meer reactieve functionele groepen (bijvoorbeeld tyrosine residuen) van een eiwit kan worden blootgesteld aan de ingekapselde Au ionen reduceren en dus een snellere vormingssnelheid van Au NC. Verwarming en externe denaturerende middelen zijn twee gebruikelijke middelen om het eiwitontvouwende te bevorderen. Figuur 1 toont het effect van het verwarmen en het toevoegen van externe denaturerende middelen...

Een protocol voor screening van kleine moleculaire geneesmiddelen op basis van in-situ synthese van ultrakleine fluorescerende gouden nanoclusters (Au NC's) met behulp van een door geneesmiddelen geladen eiwit als sjabloon wordt gepresenteerd. Deze methode is eenvoudig om de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit te bepalen door een zichtbaar fluorescerend signaal dat wordt uitgezonden door de eiwit-gesjabloniseerde Au NC's.

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

Het algemene doel van deze nieuwe fluorometrische methode voor drugscreening is het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen aan een doeleiwit door fluorescentie-goudnanoclusters te vormen binnen het met geneesmiddelen geladen eiwitsjabloon. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van protein targeting drug discovery, zoals hoe de bindingssterkte van geneesmiddelmoleculen de stabiliteit van eiwitten tegen ontvouwing kan beïnvloeden, wat leidt tot de vorming van fluorescentie-goudnanoclusters van verschillende intensiteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een doeleiwit kunnen omzetten in een fluorescente biosensor om snelle screening van kleine moleculaire geneesmiddelen mogelijk te maken, zonder dat er geavanceerde instrumenten of tijdrovende labelingsstappen nodig zijn.De combinatie van mijn eigen kennis en die van de co-auteur, zij ontdekte dat het geladen eiwit een duidelijk stabiliserend effect heeft op plasmonische nanodeeltjes, inspireerde het idee voor deze methode. Begin deze procedure met de bereiding van de chemische reagentia voor drugscreening, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol, om de gold nano clusters met menselijk serumalbumine of HSA als template voor te bereiden; plaats twee glazen vials, elk voorzien van een micro-magnetische roerstaf, op twee afzonderlijke temperatuurbestuurbare magnetische roerders.Stel de temperatuur van één magnetische roerder in op 60 °C. Voeg vervolgens, onder constant roeren, 200 µL menselijk serumalbumine-oplossing, 200 µL ultrapuur water en 200 µL goudchloride-oplossing toe aan elk vial om de inkapseling van goudionen in het eiwitsjabloon mogelijk te maken. Voeg twee minuten later 20 µL natriumhydroxide-oplossing toe aan elk vial om de reducerende werking van het menselijk serumalbumine te activeren, wat leidt tot de vorming van goud-nanoclusters. Begin met het registreren van de reactietijd op nul minuten en herhaal dit elke 20 minuten.Pipetteer 50 µL van elk monster en breng deze over naar een zwarte plaat met 384 putjes. Meet het emissiespectrum met een microplate reader. Stop het magnetisch roeren na 100 minuten.Koel de glazen vials af onder stromend water in een gootsteen. Registreer continu de foto-emissiespectra voor elk monster om de vormingskinetiek van goudnanoclusters bij verschillende temperatuuromstandigheden vast te stellen. Om de gold nano clusters met bovine serum albumine of BSA als template te bereiden, plaatst u een glazen vial met een micro-magnetische roervijzel op een magnetische roerder.Laat de temperatuur op kamertemperatuur staan. Meng 200 µL BSA-oplossing, 200 µL ureum en 200 µL goudchloride-oplossing in het glazen vial onder constant roeren. Voeg twee minuten later 20 µL natriumhydroxide-oplossing toe.Om het reducerend vermogen van BSA te activeren voor de vorming van goud-nanoclusters, wordt de reactietijd op nul minuten gezet. Meet elk uur het foto-emissiespectrum van het reactiemengsel. Plaats vijf glazen vials, elk voorzien van een magnetische roerstaaf en vooraf gelabeld met een geneesmiddel of puur HSA, op een temperatuurreguleerbare multi-punt magnetische roerder.Voeg 200 µL HSA toe aan elk vial. Voeg vervolgens één µL van elke eerder bereide drugoplossing toe aan de vier overeenkomstige vials. Voeg daarnaast één µL DMSO toe aan de controle op de roerder.Stel de draaisnelheid in op 360 RPM en incubeer gedurende één uur om de binding van het geneesmiddel aan HSA mogelijk te maken. Voeg vervolgens 200 µL milli Q-water en 200 µL goudchloride-oplossing toe aan elk vial onder constant roeren. Stel de temperatuur in op 60 °C onder constant roeren gedurende 10 minuten. Voeg na 10 minuten 20 µL 1,5 M natriumhydroxide toe aan elk vial en begin met het registreren van de reactietijd op nul minuten.Gezamenlijke reactieoplossingen voor metingen moeten dezelfde volgorde van toevoeging van geneesmiddelen volgen en moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om het effect van tijdsvertraging te minimaliseren. Pipetteer snel 50 µL oplossing uit elk vial. Breng dit over naar een zwarte 384-wells plaat en meet het emissiespectrum. Registreer de emissiespectra van elk monster elke 10 minuten, waarbij ten minste vier spectra op vier verschillende tijdstippen worden verzameld.Herhaal deze stappen meerdere keren om resultaten met een consistente trend te verkrijgen. Zet de tijdopgeloste foto-emissiespectra voor elk monster uit. Bepaal de piekintensiteit van alle monsters en zet deze uit tegen de tijd om de vormingskinetiek van goud-nanoclusters in verschillende met geneesmiddelen geladen eiwittemplates te vergelijken, om zo de bindingsconstante tussen elk geneesmiddel en HSA te meten.Vervang de drugoplossingen door ibuprofenoplossingen in vier verschillende concentraties. Koel de glazen vials 10 minuten later af onder stromend water in een gootsteen. Pipetteer 50 µL van de bovenstaande oplossingen uit elke vial naar een zwarte 384-wells plaat en meet het emissiespectrum.Herhaal deze stappen nog twee keer om nog twee sets resultaten bij verschillende drugconcentraties te verkrijgen voordat u het magnetisch roeren stopt. Zet vervolgens de foto-emissiespectra uit en analyseer de resultaten van de ruwe data die in elke individuele batch zijn verkregen. Zet de foto-emissiespectra van elk monster uit in software zoals Origin Pro en bepaal de piekintensiteit.Bereken en zet de relatieve fluorescentie-intensiteit uit tegen de drugconcentratie. Bereken vervolgens de bindingsconstante door de gegevens te fitten aan een model voor binding op één enkele plaats. Gebruik hiervoor de Mics cementin-vergelijking in software zoals Origin Pro.Selecteer het menu analyse passen niet-lineaire curve fit, en selecteer vervolgens de hail-functie uit de categorie groeisigmoïdaal op de pagina voor functieselectie in de instellingen. Klik op fit om weer te geven. De hier getoonde gefitte resultaten zijn representatieve resultaten van de tijdopgeloste foto-emissiespectra van goud-nanoclusters geproduceerd onder verschillende eiwitdenaturatiecondities.Er kan worden waargenomen dat gouden nanoclusters sneller vormen bij een hogere temperatuur. Urea-denaturerende omstandigheden kunnen ook de directe synthese van gouden nanoclusters faciliteren met BSA-eiwit als template. Typische resultaten van snelle fluorometrische drugscreening, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit van gouden nanoclusters met drug-geladen HSA als template, worden hier getoond.Hoe hoger de fluorescentie-intensiteit, hoe zwakker de bindingssterkte van een drugmolecuul aan HSA. Deze spectra tonen het effect van de drugbeladingsconcentratie op de vormingssnelheid van fluorescerende goud-nanoclusters binnen de met ibuprofen beladen HSA. Hoe hoger de drugconcentratie, hoe lager het fluorescentiesignaal van de resulterende goud-nanoclusters; hier wordt een representatief resultaat van de bepaling van de eiwit-drugbindingsconstante getoond.Dit wordt berekend door de relatieve fluorescentie-intensiteit van goudnanoclusters, gesynthetiseerd in een HSA-template vooraf geladen met ibuprofen in verschillende concentraties, te fitten met de MICUs-cementin-vergelijking. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd voor parallele screening van meerdere geneesmiddelen, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe goudnanoclusters in een met geneesmiddelen geladen eiwit gesynthetiseerd kunnen worden, en hoe de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit bepaald kan worden via het fluorescente signaal dat wordt uitgezonden door de resulterende goudnanoclusters.

a-rapid-quantitative-fluorimetric-method-for-protein-targeting-small

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

In this video, we describe the fluorescence anisotropy technique to study the interactions between the fluorophore-tagged Shwachman-diamond syndrome (SBDS) protein and the elongation factor-like 1 GTPase (EFL1). On incubating SBDS proteins with gradually increasing concentrations of EFL1, a steady increase in anisotropy is observed, indicating a successful interaction between the two proteins.

Fluorescence Anisotropy-Based Detection of Protein-Protein Interactions

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Differentiële scannen fluorimetrie is een veelgebruikt methode voor het screenen van bibliotheken van kleine moleculen op interacties met eiwitten. Hier presenteren we een eenvoudige methode om deze analyses uit te breiden om een schatting te geven van de dissociatieconstante tussen een klein molecuul en zijn eiwitpartner.

Bepaling van proteïne-ligand interacties gebruiken Differential Scanning Fluorimetrie

We presenteren in de huidige studie een nieuwe fluorescentie gebaseerde assay middels lymfocyten afkomstig van een transgene muis. Deze test is geschikt voor high-throughput screening (HTS) van kleine moleculen begiftigd met de hoedanigheid van het remmen of bevorderen van lymfocyt activering.

Een fluorescentie gebaseerde lymfocyt Assay geschikt voor high-throughput screening van kleine moleculen

In deze studie hebben we de mogelijkheden voor gegevensanalyse van het DARTS experiment verbeterd door de veranderingen in de eiwit stabiliteit te monitoren en de affiniteit van eiwit-ligand interacties te schatten. De interacties kunnen in twee krommen worden uitgezet: een Proteolytische curve en een Dosisafhankelijkheid. We hebben mTOR-rapamycine interactie gebruikt als een voorbeeldige zaak.

Een semi-kwantitatieve drug affiniteit responsieve doel stabiliteit (DARTS) assay voor het bestuderen van Rapamycine/mTOR interactie

Deze studie was gericht op het presenteren van een strategie voor het identificeren van drug-peptide interacties. De strategie omvat het biopanning van drug-herkennende korte peptiden op basis van een kwarts-kristal microbalans (QCM) biosensor, gevolgd door bioinformatica analyse voor het kwantitatief beoordelen van de informatie verkregen voor de drugherkenning en annotatie van de drug-bindende sites op eiwitten.

Biosensor-gebaseerde high throughput biopanning en bioinformatica analyse strategie voor de wereldwijde validatie van drug-eiwit interacties

Het monitoren van veranderingen in de smelttemperatuur van een doeleiwit(d.w.z.thermische verschuivingstest, TSA) is een efficiënte methode voor het screenen van fragmentbibliotheken van een paar honderd verbindingen. We presenteren een TSA-protocol dat robotica-ondersteunde nano-Differential Scanning Fluorimetry (nano-DSF) implementeert voor het monitoren van intrinsieke tryptofaanfluorescentie en lichtverstrooiing voor fragmentscreening.

Nanodifferentiële scanningfluormetrie voor screening in fragmentgebaseerde looddetectie

Het huidige protocol beschrijft een procedure voor het uitvoeren van fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie (FSEC) op membraaneiwitten om hun kwaliteit te beoordelen voor downstream functionele en structurele analyse. Representatieve FSEC-resultaten verzameld voor verschillende G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) onder wasmiddel-opgeloste en detergent-vrije omstandigheden worden gepresenteerd.

Snelle beoordeling van de kwaliteit van membraaneiwitten door fluorescerende grootte-uitsluitingschromatografie

Het experiment dat hier wordt gebruikt, toont een methode van moleculaire docking in combinatie met cellulaire thermische verschuivingstest om de interactie tussen kleine moleculen en eiwitdoelen te voorspellen en te valideren.

Voorspelling en validatie van eiwitdoelen van een verbinding met kleine moleculen

De kwantitatieve irreversibele tethering (qIT)-test is een op fluorescentie gebaseerde methode voor het identificeren van covalente fragmenten die selectief een doeleiwit aangaan. Hier wordt een gedetailleerd protocol geschetst om de qIT-test te beschrijven, inclusief voorbeeldresultaten.

Screening van covalente fragmenten met behulp van de kwantitatieve onomkeerbare tethering-assay

Dit protocol introduceert een fluorometrische screeningsmethodologie die geoptimaliseerd is voor het identificeren van natuurlijke product- of kleinmolecuulremmers van eiwitsynthese. De praktische bruikbaarheid maakt het geschikt voor zowel bacheloronderwijs in geneesmiddelenontdekkingstechnieken als voor implementatie in medicinale chemiecampagnes.

Een op fluorescentie gebaseerd protocol voor voorlopige screening van eiwitsyntheseremmers uit natuurlijke bronnen

Leer een snelle fluorimetrische methode voor het screenen van eiwit-gerichte kleine molecuul geneesmiddelen met behulp van fluorescerende goudnanoclusters in een eiwitmalplaatje. Deze aanpak versnelt het ontdekken van geneesmiddelen aanzienlijk.

Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

Meer video's verkennen