Een snelle en kwantitatieve Fluorimetrische Methode voor-eiwit targeting Small Molecule drugscontrole

Het algemene doel van deze nieuwe fluorometrische methode voor drugscreening is het bepalen van de bindingsaffiniteit van kleine geneesmiddelmoleculen aan een doeleiwit door fluorescentie-goudnanoclusters te vormen binnen het met geneesmiddelen geladen eiwitsjabloon. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen op het gebied van protein targeting drug discovery, zoals hoe de bindingssterkte van geneesmiddelmoleculen de stabiliteit van eiwitten tegen ontvouwing kan beïnvloeden, wat leidt tot de vorming van fluorescentie-goudnanoclusters van verschillende intensiteiten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we een doeleiwit kunnen omzetten in een fluorescente biosensor om snelle screening van kleine moleculaire geneesmiddelen mogelijk te maken, zonder dat er geavanceerde instrumenten of tijdrovende labelingsstappen nodig zijn.

De combinatie van mijn eigen kennis en die van de co-auteur, zij ontdekte dat het geladen eiwit een duidelijk stabiliserend effect heeft op plasmonische nanodeeltjes, inspireerde het idee voor deze methode. Begin deze procedure met de bereiding van de chemische reagentia voor drugscreening, zoals gedetailleerd in het tekstprotocol, om de gold nano clusters met menselijk serumalbumine of HSA als template voor te bereiden; plaats twee glazen vials, elk voorzien van een micro-magnetische roerstaf, op twee afzonderlijke temperatuurbestuurbare magnetische roerders.

Stel de temperatuur van één magnetische roerder in op 60 °C. Voeg vervolgens, onder constant roeren, 200 µL menselijk serumalbumine-oplossing, 200 µL ultrapuur water en 200 µL goudchloride-oplossing toe aan elk vial om de inkapseling van goudionen in het eiwitsjabloon mogelijk te maken. Voeg twee minuten later 20 µL natriumhydroxide-oplossing toe aan elk vial om de reducerende werking van het menselijk serumalbumine te activeren, wat leidt tot de vorming van goud-nanoclusters. Begin met het registreren van de reactietijd op nul minuten en herhaal dit elke 20 minuten.

Pipetteer 50 µL van elk monster en breng deze over naar een zwarte plaat met 384 putjes. Meet het emissiespectrum met een microplate reader. Stop het magnetisch roeren na 100 minuten.

Koel de glazen vials af onder stromend water in een gootsteen. Registreer continu de foto-emissiespectra voor elk monster om de vormingskinetiek van goudnanoclusters bij verschillende temperatuuromstandigheden vast te stellen. Om de gold nano clusters met bovine serum albumine of BSA als template te bereiden, plaatst u een glazen vial met een micro-magnetische roervijzel op een magnetische roerder.

Laat de temperatuur op kamertemperatuur staan. Meng 200 µL BSA-oplossing, 200 µL ureum en 200 µL goudchloride-oplossing in het glazen vial onder constant roeren. Voeg twee minuten later 20 µL natriumhydroxide-oplossing toe.

Om het reducerend vermogen van BSA te activeren voor de vorming van goud-nanoclusters, wordt de reactietijd op nul minuten gezet. Meet elk uur het foto-emissiespectrum van het reactiemengsel. Plaats vijf glazen vials, elk voorzien van een magnetische roerstaaf en vooraf gelabeld met een geneesmiddel of puur HSA, op een temperatuurreguleerbare multi-punt magnetische roerder.

Voeg 200 µL HSA toe aan elk vial. Voeg vervolgens één µL van elke eerder bereide drugoplossing toe aan de vier overeenkomstige vials. Voeg daarnaast één µL DMSO toe aan de controle op de roerder.

Stel de draaisnelheid in op 360 RPM en incubeer gedurende één uur om de binding van het geneesmiddel aan HSA mogelijk te maken. Voeg vervolgens 200 µL milli Q-water en 200 µL goudchloride-oplossing toe aan elk vial onder constant roeren. Stel de temperatuur in op 60 °C onder constant roeren gedurende 10 minuten. Voeg na 10 minuten 20 µL 1,5 M natriumhydroxide toe aan elk vial en begin met het registreren van de reactietijd op nul minuten.

Gezamenlijke reactieoplossingen voor metingen moeten dezelfde volgorde van toevoeging van geneesmiddelen volgen en moeten zo snel mogelijk worden uitgevoerd om het effect van tijdsvertraging te minimaliseren. Pipetteer snel 50 µL oplossing uit elk vial. Breng dit over naar een zwarte 384-wells plaat en meet het emissiespectrum. Registreer de emissiespectra van elk monster elke 10 minuten, waarbij ten minste vier spectra op vier verschillende tijdstippen worden verzameld.

Herhaal deze stappen meerdere keren om resultaten met een consistente trend te verkrijgen. Zet de tijdopgeloste foto-emissiespectra voor elk monster uit. Bepaal de piekintensiteit van alle monsters en zet deze uit tegen de tijd om de vormingskinetiek van goud-nanoclusters in verschillende met geneesmiddelen geladen eiwittemplates te vergelijken, om zo de bindingsconstante tussen elk geneesmiddel en HSA te meten.

Vervang de drugoplossingen door ibuprofenoplossingen in vier verschillende concentraties. Koel de glazen vials 10 minuten later af onder stromend water in een gootsteen. Pipetteer 50 µL van de bovenstaande oplossingen uit elke vial naar een zwarte 384-wells plaat en meet het emissiespectrum.

Herhaal deze stappen nog twee keer om nog twee sets resultaten bij verschillende drugconcentraties te verkrijgen voordat u het magnetisch roeren stopt. Zet vervolgens de foto-emissiespectra uit en analyseer de resultaten van de ruwe data die in elke individuele batch zijn verkregen. Zet de foto-emissiespectra van elk monster uit in software zoals Origin Pro en bepaal de piekintensiteit.

Bereken en zet de relatieve fluorescentie-intensiteit uit tegen de drugconcentratie. Bereken vervolgens de bindingsconstante door de gegevens te fitten aan een model voor binding op één enkele plaats. Gebruik hiervoor de Mics cementin-vergelijking in software zoals Origin Pro.

Selecteer het menu analyse passen niet-lineaire curve fit, en selecteer vervolgens de hail-functie uit de categorie groeisigmoïdaal op de pagina voor functieselectie in de instellingen. Klik op fit om weer te geven. De hier getoonde gefitte resultaten zijn representatieve resultaten van de tijdopgeloste foto-emissiespectra van goud-nanoclusters geproduceerd onder verschillende eiwitdenaturatiecondities.

Er kan worden waargenomen dat gouden nanoclusters sneller vormen bij een hogere temperatuur. Urea-denaturerende omstandigheden kunnen ook de directe synthese van gouden nanoclusters faciliteren met BSA-eiwit als template. Typische resultaten van snelle fluorometrische drugscreening, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit van gouden nanoclusters met drug-geladen HSA als template, worden hier getoond.

Hoe hoger de fluorescentie-intensiteit, hoe zwakker de bindingssterkte van een drugmolecuul aan HSA. Deze spectra tonen het effect van de drugbeladingsconcentratie op de vormingssnelheid van fluorescerende goud-nanoclusters binnen de met ibuprofen beladen HSA. Hoe hoger de drugconcentratie, hoe lager het fluorescentiesignaal van de resulterende goud-nanoclusters; hier wordt een representatief resultaat van de bepaling van de eiwit-drugbindingsconstante getoond.

Dit wordt berekend door de relatieve fluorescentie-intensiteit van goudnanoclusters, gesynthetiseerd in een HSA-template vooraf geladen met ibuprofen in verschillende concentraties, te fitten met de MICUs-cementin-vergelijking. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd voor parallele screening van meerdere geneesmiddelen, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe goudnanoclusters in een met geneesmiddelen geladen eiwit gesynthetiseerd kunnen worden, en hoe de bindingsaffiniteit van geneesmiddelen aan een doeleiwit bepaald kan worden via het fluorescente signaal dat wordt uitgezonden door de resulterende goudnanoclusters.