Name: Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Leer de immuunmodulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen beoordelen met een co-cultuursysteem en CFSE-markering. Deze methode onthult mechanismen voor therapeutische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van NHRI (CS-104-PP-06 aan B.L.Y.).

Patiënt geïnformeerde toestemming zoals goedgekeurd door de institutionele review board moet worden verkregen voor het gebruik van menselijke cellen. 1. dichtheidsgradiënt Isolatie van humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) <ol><li> Voeg 25 ml gehepariniseerd bloed in een 50 ml buisje met een pipet 25 ml. <ol><li> Verdun cellen met 25 ml met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li></ol></li><li> Voeg 15 ml Ficoll-Paque density in een nieuwe 50 ml buis en terwijl het kantelen van de buis langzaam en voeg voorzichtig in 25 ml van de verdunde celsuspensie via dichtheidsgradiënt zodat er geen menging van het volbloed met de dichtheidsgradiënt, dwz., een verstoring van de bloed-dichtheidsgradiënt interface. </li><li> Centrifugeer de suspensie van stap 1,2 bij 400 xg gedurende 30 tot 40 minuten in een temperatuurgecontroleerde swinging-bucket rotor zonder rem bij 20 ° C. Opmerking: Drie verschillende lagen moet duidelijk zijn na centrifugeren: the bovenlaag wezen plasma; de onderste duidelijke laag die de Ficoll-Paque dichtheid; en een dunne, midden cellaag zijnde de PBMCs </li><li> Zuig en gooi de bovenlaag door afzuigen met een Pasteur pipet voorzichtig de interfase laag van mononucleaire cellen (bijvoorbeeld lymfocyten, monocyten en bloedplaatjes) niet te verstoren. </li><li> Verzamel zorgvuldig deze mononucleaire cellaag met een pipet 10 ml van een nieuwe 50 ml centrifugebuis. </li><li> De buis met 20 ml PBS, meng en centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant volledig na centrifugeren. </li><li> Resuspendeer de celpellet in 20 ml PBS en centrifugeer bij 200 xg gedurende 10-15 min bij 20 ° C. Verwijder het supernatant volledig na centrifugeren. Opmerking: Deze stap verwijdert de plaatjes-die ongewenste-binnen de PBMC zijn; Deze stap kan worden herhaald om volledige verwijdering van de bloedplaatjes te waarborgen. </li><li> Als er geen selectie van specifieke bevolkingsgroepen isgewenst hersuspenderen celpellet in leukocyten volledig medium (10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine in RPMI-1640 medium) te kweken na het uitvoeren van een aantal cellen 16 om 1 ml slaapstandmethoden gemiddeld per 10 7 PBMCs alvorens naar de volgende stap. </li></ol> 2. Magnetische Labeling van Leukocyte populaties (Ga naar stap 4 als er geen selectie van specifieke populaties is vereist) <ol><li> Centrifugeer PBMC suspensie bij 300 x g gedurende 10 min en zuig supernatant volledig. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 80 ul PBS per 10 7 totale cellen. </li><li> Voeg 20 ul van gespecificeerde magnetische korrels (dat wil zeggen, CD14 magnetische korrels voor isolatie van monocyten, CD4 magnetische korrels voor isolatie van T-lymfocyten) per 10 7 totale cellen. </li><li> Meng goed en incubeer gedurende 15 minuten bij 2 tot 8 ° C in de koelkast. </li><li> Voeg 1-2 ml PBS per 10 7 cellen te wassen, en centrifugeerbij 300 xg gedurende 10 min. </li><li> Zuig supernatant en resuspendeer helemaal tot 10 8 cellen in 500 pl PBS. </li></ol> 3. Magnetische Selectie van leukocytsubpopulaties Opmerking: Een verscheidenheid van magnetische bead scheiders en kolommen zijn voor isolatie van specifieke populatie van leukocyten door celoppervlaktemarker van een aantal fabrikanten. Isolatie kan worden door positieve selectie op basis van één of enkele positieve markeringen of negatieve selectie na uitputting van ongewenste populaties. Een algemene benadering van het uitvoeren van positieve selectie met behulp van een marker (dwz CD4 voor T-helper lymfocyten of CD14 voor monocyten) wordt hieronder uiteengezet. <ol><li> Bereiden en prime magnetische separator waaronder separatiekolom volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Breng buis met het monster gelabeld PBMCs. Bieden twee 15 ml centrifugebuizen voor het verzamelen van de positief gelabeld en unlabeled celfracties, volgens de instructies van de fabrikant. </li><li> Celgetal nummer 15 en resuspendeer de positief geselecteerde leukocyten (dwz CD4 + T-lymfocyten of CD14 + cellen) in leukocyten compleet medium, met behulp van 1 ml medium per 10 7 cellen. </li></ol> 4. CFSE kleuring leukocyten voor de Beoordeling van proliferatie Opmerking: CFSE is op grote schaal gebruikt in immunologische onderzoeken, zowel in vivo als in vitro studies. Ons protocol is geoptimaliseerd voor in vitro onderzoek van MSC / PBMC (of andere leukocyt) interacties. De algemene stappen voor het uitvoeren van CFSE in vitro labeling vergelijkbaar zijn, kunnen er verschillen in specifieke dosering en tijdstip van het protocol 14. Dit kan te wijten zijn aan een aantal factoren, dat wil zeggen, de specifieke gebruikte celtype, celaantallen tweedehands die waarschijnlijk invloed hebben op de intensiteit van CFSE fluorescentiesignaal. <ol&gt; <li> Verdun de CFSE voorraadoplossing (10 mM) in PBS met de gewenste werkconcentratie van 10 pM (CFSE-werkoplossing). Bereid 10 7 cellen (dwz PBMC of T-cellen) voor de etikettering met de CFSE-werkende oplossing. </li><li> Centrifugeer bij 300 xg gedurende 10 min om een ​​celpellet te verkrijgen en zuig de supernatant. </li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml voorverwarmde (37 ° C) CFSE-werkende oplossing zachtjes en incubeer de cellen gedurende 10 min bij 37 ° C. </li><li> Te wassen overtollige CFSE Verdun de celsuspensie met 10x (vol) van tevoren gekoeld (4 ° C) RPMI medium met 10% FBS. Sediment de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten en de bovenstaande vloeistof. Was de celpellet op deze wijze tweemaal. </li><li> Re-pellet de cellen door centrifugeren en tel het aantal cellen 15. Resuspendeer 10 7 cellen (PBMC ofwel of T-cellen) in 1 ml vers voorverwarmd leukocyten volledig medium. </li></ol> 5. Co-cultuur van MSC&#39;s met leukocyten en activering van leukocyten <ol><li> Pre-warm MSC compleet medium (10% FBS (gepretest voor een optimale groei MSC), 1% L-glutamine en 1% penicilline / streptomycine in DMEM laag-glucose medium) tot 37 ° C gedurende maximaal 30 min. </li><li> Seed MSCs bij 50.000 cellen in 1 ml van MSC compleet medium in 24-wells platen (MSC dichtheid: 25.000 cellen / cm2) voor bevestiging O / N in een 37 ° C incubator, waardoor de stamcellen tot 80% confluentie bereiken. </li><li> Zuig medium, en op basis van geënte MSC nummers toevoegen CFSE-gelabelde PBMCs (voorheen gemerkte zie protocol stap 4 hierboven) gekweekte MSC&#39;s (gezaaid gisteren in 24-well platen) in 1 ml van leukocyten compleet medium bij een 01:10 (cel ratio) co-cultuur verhouding van MSC&#39;s te PBMCs. </li><li> Voeg het mitogeen fytohemagglutinine (PHA), een niet-specifieke leukocyt activator, tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml in een totaalvolume van 1 ml leukocyt compleet medium per putje. <ol><li> AlternativEly, te stimuleren voor de activering van T-lymfocyten specifiek: Gebruik α-CD3 / 28 microbolletjes en aan de twee-cel co-kweken van een hiel-tot-T-lymfocyt-verhouding van 1 te verkrijgen: 1. </li></ol></li><li> Voor de negatieve controle, plaat 500.000 PBMC / goed (of een specifieke effector leukocyten bevolking; celdichtheid: 250.000 leukocyten / cm2) in een 24-well plaat met 1 ml leukocyten compleet enige medium; positieve controle, naast hetzelfde aantal PBMCs / plating goed, voegen PHA tot een uiteindelijke concentratie van 10 ug / ml. </li><li> Op 3 en 5 dagen van co-kweek experiment evalueren proliferatie van CFSE-gelabelde leukocyten (geplaatst in ronde bodem tubes) door flow cytometrische analyse 17 met 488 nm excitatie en emissiefilters geschikt voor fluoresceïne. Opmerking: Intracellulaire cytokine kleuring voor flowcytometrische analyse kan worden uitgevoerd om deze CFSE-gelabelde leukocyten op dit punt te gaan op veranderingen in leukocyten cytokine expressieprofiel als modulated door MSC. Omdat CFSE wordt geëvalueerd met een filter geschikt voor fluoresceïne, gekozen antilichamen te beoordelen verschillende cytokinen moeten worden geconjugeerd aan andere dan fluoresceïne of soortgelijke spectrum fluorochromen (dwz, fycoerythrine, peridinin chlorofyl eiwitcomplex (PerCP)). </li></ol> 6. Variatie: Effector Onderdrukking Assay Magnetic Bead-geselecteerd, MSC-geïnduceerde Immuunmodulerende leukocyten op geactiveerde CFSE-gelabelde Effector CD4 + T-cellen <ol><li> Seed MSCs bij 250.000 cellen in 3 ml MSC compleet medium in 6-well platen (MSC dichtheid: 25.000 cellen / cm2) voor bevestiging O / N in een 37 ° C incubator, waardoor de stamcellen tot 80% confluentie bereiken. Minstens 3 6-well platen zijn nodig om voldoende MSC-PBMC gekweekt samen voor subpopulatie selectie garanderen. </li><li> Zuig medium en PBMC gescheiden volgens stap 1 maar in 6-well platen bij 2,5 x 10 6 cellen / putje (celdichtheid commentaar: 250.000 leukocytes / cm 2) met 3 ml van leukocyten volledig medium. Co-kweek van 48-72 uur in een 37 ° C incubator. </li><li> Magnetische bead-selecteer specifieke populatie van MSC-geïnduceerde immunomodulerende leukocyten (dwz, CD14 + cellen) als per secties 2-3. Opmerkingen: Intracellulaire cytokine kleuring voor flowcytometrische analyse kan op dit moment worden uitgevoerd om na te gaan voor veranderingen in leukocyten cytokine expressie profiel, dat wil zeggen, de expressie van interleukine-10-as gemoduleerd door MSC. </li><li> Voeg CFSE-gelabelde allogene CD4 + T-cellen geproduceerd volgens secties 2-4 in 24 putjes in 1 ml compleet medium leukocyt (T celdichtheid: 250.000 cellen / cm 2) naar bead geselecteerde MSC geïnduceerde leukocyten in verschillende verhoudingen , dwz 1:10, 1: 5, 1: 2 en 1: 1 (cel naar cel) verhoudingen. </li><li> Om CD4 + T cellen te stimuleren, voeg α-CD3 / 28 geconjugeerd microbolletjes een hiel-tot-cel-verhouding van 1 te verkrijgen: 1. </li><li> Voor een negatieve controle, plaat 500.000 CD4 + T-cellen / putje in een 24-well plaat (T celdichtheid: 250.000 cellen / cm 2) met 1 ml leukocyt pas compleet medium; positieve controle, naast hetzelfde aantal CD4 + T-cellen plating / putje, voeg α-CD3 / 28 geconjugeerd microbolletjes een hiel-tot-cel-verhouding van 1 te verkrijgen: 1. </li><li> Op 3 dagen van co-kweek beoordeelt proliferatie van CFSE-gelabelde CD4 + T-cellen (geplaatst in ronde bodem tubes) door flow cytometrische analyse 16 met 488 nm excitatie en emissiefilters geschikt voor fluoresceïne. </li></ol>

<ol><li>Friedenstein, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precursor+cells+of+mechanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Precursor cells of mechanocytes.</a> Int Rev Cytol. 47, 327-359 (1976).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow+stromal+cells+as+stem+cells+for+nonhematopoietic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues.</a> Science. 276, 71-74 (1997).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+cells+from+human+adipose+tissue%3A+implications+for+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies.</a> Tissue Eng. 7, 211-228 (2001).</li>
<li>Yen, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+multipotent+cells+from+human+term+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Isolation of multipotent cells from human term placenta.</a> Stem Cells. 23, 3-9 (2005).</li>
<li>Erices, A., Conget, P., Minguell, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitor+cells+in+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood.</a> Br J Haematol. 109, 235-242 (2000).</li>
<li>Bartholomew, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+suppress+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+prolong+skin+graft+survival+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo.</a> Exp Hematol. 30, 42-48 (2002).</li>
<li>Chang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placenta-derived+multipotent+cells+exhibit+immunosuppressive+properties+that+are+enhanced+in+the+presence+of+interferon-gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma.</a> Stem Cells. 24, 2466-2477 (2006).</li>
<li>Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in health and disease.</a> Nat Rev Immunol. 8, 726-736 (2008).</li>
<li>Chen, P. M., Yen, M. L., Liu, K. J., Sytwu, H. K., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+human+adult+and+fetal+multipotent+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of human adult and fetal multipotent mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Sci. 18, 49-59 (2011).</li>
<li>Muul, L. M., et al. Measurement of proliferative responses of cultured lymphocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMuul%2C+LM+%22Curr+Protoc+Immunol%22">Curr Protoc Immunol</a>. , Wiley & Sons, Inc. (2011).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2, 2049-2056 (2007).</li>
<li>Chen, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+immunomodulatory+monocytes+by+human+mesenchymal+stem+cell-derived+hepatocyte+growth+factor+through+ERK1%2F2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of immunomodulatory monocytes by human mesenchymal stem cell-derived hepatocyte growth factor through ERK1/2.</a> J Leukoc Biol. 96, 295-303 (2014).</li>
<li>Oughton, J. A., Kerkvliet, N. I. UNIT 18.8 Immune cell phenotyping using flow cytometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOughton%2C+JA+%22Curr+Protoc+Toxicol%22">Curr Protoc Toxicol</a>. Costa, L. G., Davila, J. C., Lawrence, D. A., Reed, D. J., Will, Y. , Wiley & Sons, Inc. 18.8.1-18.8.24 (2005).</li>
<li>Phelan, M. C., Lawler, G. APPENDIX 3A Cell counting. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelan%2C+MC+%22Curr+Protoc+Cytom%22">Curr Protoc Cytom</a>. Robinson, J. P., et al. , Wiley & Sons, Inc. A.3A.1-A.3A.4 (2001).</li>
<li>Gebler, A., Zabel, O., Seliger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+capacity+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory capacity of mesenchymal stem cells.</a> Trends Mol Med. 18, 128-134 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+treatment+of+steroid-resistant%2C+severe%2C+acute+graft-versus-host+disease%3A+a+phase+II+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study.</a> Lancet. 371, 1579-1586 (2008).</li>
<li>Tan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+therapy+with+autologous+mesenchymal+stem+cells+in+living-related+kidney+transplants%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Induction therapy with autologous mesenchymal stem cells in living-related kidney transplants: a randomized controlled trial.</a> JAMA. 307, 1169-1177 (2012).</li>
<li>Le Blanc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+inhibit+and+stimulate+mixed+lymphocyte+cultures+and+mitogenic+responses+independently+of+the+major+histocompatibility+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex.</a> Scand J Immunol. 57, 11-20 (2003).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+in+vitro+impairs+the+immunosuppressive+activity+of+mesenchymal+stem+cells+on+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term culture in vitro impairs the immunosuppressive activity of mesenchymal stem cells on T cells.</a> Mol Med Rep. 6, 1183-1189 (2012).</li>
<li>Moll, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+cryopreserved+mesenchymal+stromal+cells+display+impaired+immunomodulatory+and+therapeutic+properties%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties?</a> Stem Cells. 32, 2430-2442 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Tang, B. C., Chen, C. T., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2O2+accumulation+mediates+differentiation+capacity+alteration%2C+but+not+proliferative+decline%2C+in+senescent+human+fetal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">H2O2 accumulation mediates differentiation capacity alteration, but not proliferative decline, in senescent human fetal mesenchymal stem cells.</a> Antioxid Redox Signal. 18, 1895-1905 (2013).</li>
</ol>

We hebben niets te onthullen.

Steeds vaker worden de immunomodulerende eigenschappen van MSC's sneller naar klinisch gebruik getransleerd dan het multilineaire vermogen van deze stamcellen18-20. Daarom zijn co-cultuurtechnieken van MSC's met leukocyten en testen om immuunfunctie te evalueren belangrijk om de specifieke mechanismen die betrokken zijn bij deze eigenschappen verder te onderscheiden voor het optimaliseren van effectieve therapeutische toepassing.
Een van de meest cruciale technische aspecten voor su...

Menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn somatische voorlopers die kunnen differentiëren tot het paraxiale mesodermale lineages bot, kraakbeen en vetweefsel 1-4, alsmede enkele extramesodermal lineages 5. Eerst geïsoleerd uit volwassen beenmerg, zijn deze multilineage progenitors nu gevonden in talrijke weefsels 6-8 en onverwachts aangetoond sterke immunomodulerende eigenschappen die zeer ontvankelijk zijn voor klinische toepassing 12/09 weergegeven zijn. Gedetailleerde mechanismen betrokken bij de immunomodulerende effecten actief onderzocht voor effectieve uitvoering op bepaalde ziektebeelden. Een van de eenvoudigste manieren om immunomodulatie te beoordelen is door beoordeling van de onderdrukking van effector leukocyt proliferatie 13. De meeste effector leukocyten zoals T-lymfocyten en monocyten prolifereren prodigiously wanneer gestimuleerd of geactiveerd. Immunomodulerende functie kan worden beoordeeld bij de onderdrukking vanproliferatie blijkt. Traditioneel is effector leukocyt proliferatie geëvalueerd door detectie van [3 H] thymidine incorporatie in DNA. Deze methode heeft belangrijke nadelen vanwege de zorgen van bestraling en na gebruik verwijdering, en de complexe apparatuur nodig. Hoewel er niet-radioactieve assays celproliferatie te beoordelen, de succinimidyl ester carboxyfluoresceïne (CFSE) test heeft andere voordelen zoals ter identificatie van specifieke cellulaire populaties, wat vooral nuttig in co-kweek-experimenten waarbij meerdere celtypen. CFSE is een fluorescente kleurstof die cellen kan worden bepaald door flow cytometrische analyse. Als cellen delen, wordt de intensiteit van de cellulaire label proportioneel verminderd; Dit maakt niet alleen de bepaling van de totale celproliferatie maar ook zorgt voor de beoordeling van het aantal celdelingen tot 8 divisies voordat de fluorescentie wordt het moeilijk om detect tegen achtergrond signaal. Bovendien is de stabiliteit van de fluorescerende CFSE maakt in vivo volgen van gemerkte cellen, die cellen kunnen worden gevisualiseerd vele maanden 14. Deze test kan ook worden gevarieerd om bepaalde soorten effector leukocyten of immunomodulerende functie van specifieke populaties van evaluatie MSC-geïnduceerde immunomodulerende leukocyten-zoals interleukine-10 (IL-10) producerende CD14 + monocyten 15 door het uitvoeren van magnetische korrels oppervlaktemerker winkelwagentje celpopulaties van belang voor of na co-cultuur geschikt. Ons protocol beschrijft de basis assay beoordeling van de immunomodulerende effecten van MSCs voor effector leukocyten (stroomdiagram getoond in figuur 1) en een variatie op deze basis assay voor evaluatie van MSC-geïnduceerde leukocyt immunomodulatie bij allogene CD4 + effector T lymfocyten (getoonde stroomschema in figuur 4).

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>71-7167-00 AG</td><td>Dichtheidsgradient voor het isoleren van mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMC's)</td></tr><tr><td>Vibrant CFDA-SE Cell Tracer Kit (CFSE)</td><td>Life Technologies</td><td>V12883</td><td>Cellulair label voor detectie van celdeling</td></tr><tr><td>Phytoagglutinine (PHA)</td><td>Sigma</td><td>L8902</td><td>Activering van humane PBMC's</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/28</td><td>Life Technologies</td><td>111.32D</td><td>Activering van humane T-lymfocyten, bijv. CD4+ T-cellen, CD8+ T-cellen, etc.</td></tr><tr><td>autoMACS&trade; Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>autoMACS&trade; Separator</td><td>Magneetgebaseerde celseparator</td></tr><tr><td>autoMACS&reg; Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td>scheidingskolommen</td></tr><tr><td>CD14 microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td>Voor positieve selectie van CD14+ humane monocyten en macrofagen uit PBMC's</td></tr><tr><td>CD4 microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-101</td><td>Voor positieve selectie van CD4+ humane T-lymfocyten uit PBMC's</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11875</td><td>Humaan PBMC/leukeocyten kweekmedium</td></tr><tr><td>DMEM, lage glucose, pyruvate</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>Humaan mesenchymale stamcel (MSC) kweekmedium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Supplement voor MSC volledig medium</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Supplement voor PBMC/leukeocyten en MSC volledig medium</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>1) Hyclone, voor MSC kweek &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 2) Life Technologies, voor alle andere cellen (dwz PBMC's, specifieke leukocytenpopulaties)</td><td>1) SH30070.03M 2) 10091-148</td><td>Voorgeteste batches voor ondersteuning van MSC in vitro kweek</td></tr><tr><td>24-well kweekplaat</td><td>Corning</td><td>COR3524</td><td>Co-kweekplaat</td></tr><tr><td>50 ml centrifugeerbuis</td><td>Corning</td><td>430291</td><td>Isolatie van PBMC's uit vol bloed met Ficoll-Paque PLUS</td></tr><tr><td>15 ml centrifugeerbuis&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430766</td><td>Verzameling van de gelabelde en niet-gelabelde celfracties</td></tr><tr><td>Rondbodembuizen</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td>352008</td><td>Verzameling van cellen voor flowcytometrische analyse</td></tr></tbody></table>

beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (msc)

Assessment of the Immunomodulatory Properties of Human Mesenchymal Stem Cells (MSCs)

De immunomodulerende eigenschappen van multilineaire humane mesenchymale stamcellen (MSC's) lijken zeer relevant te zijn voor klinisch gebruik voor een breed scala aan immuun-gerelateerde ziekten. De betrokken mechanismen worden steeds beter verklaard en in dit artikel beschrijven we het basisexperiment om MSC-immunomodulatie te beoordelen door de onderdrukking van effectorleukeocyten-proliferatie te meten. Representatief voor activering, kan leukeocyten-proliferatie worden beoordeeld door een aantal technieken, en we beschrijven in dit protocol het gebruik van de fluorescente cellulaire kleurstof carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) om leukocyten te labelen met daaropvolgende flowcytometrische analyses. Deze techniek kan niet alleen proliferatie beoordelen zonder radioactiviteit, maar ook het aantal celdelingen dat heeft plaatsgevonden, evenals het mogelijk maken van identificatie van de specifieke populatie van proliferende cellen en intracellulaire cytokine/factor expressie. Bovendien kan de test worden aangepast om specifieke populaties van effectorleukocyten te evalueren door magnetische kraal-oppervlaktemarker selectie van enkele perifere bloedmononucleaire celpopulaties vóór co-cultuur met MSC's. De flexibiliteit van deze co-cultuurtest is nuttig voor het onderzoeken van cellulaire interacties tussen MSC's en leukocyten.

Figuur 1 geeft het algemene schema van het experiment, en figuur 2 toont het uiterlijk van de verschillende celkweekomstandigheden zoals gevisualiseerd door fase-contrast omgekeerde microscoop. MSC&#39;s zijn hechtende cellen met een fibroblast, spoelvormige morfologie, terwijl PBMC en leukocyten zijn kleine ronde niet-hechtende cellen. Deze twee morfologisch verschillende celtypes is duidelijk te zien in de co-kweek. Aan het einde van de test, als de PBMC&#39;s (of leuckotyes) aangezogen v...

De immuunmodulerende eigenschappen van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) lijken steeds belangrijker voor klinische toepassing. Het gebruik van een co-kweeksysteem van MSCs en perifeer bloed leukocyten vooraf gekleurd met de fluorescerende kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE), beschrijven we de in vitro beoordeling van MSC immunomodulatie bij effector leukocyt proliferatie en specifieke subpopulaties.

Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)

The immunomodulatory properties of multilineage human mesenchymal stem cells (MSCs) appear to be highly relevant for clinical use towards a wide-range of ...

Het algemene doel van dit experiment is om de immunomodulerende eigenschappen van menselijke mesenchymale stamcellen of msc te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van de mechanismen die betrokken zijn bij de immunomodulatie door menselijke mesenchymale stamcellen, een proces dat therapeutische relevantie kan hebben. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel het voorkomen van proliferatie van effectorleukocyten als het aantal celdelingen kan worden beoordeeld, wat aantoont dat de procedure per shoe zal zijn.Een laborant uit mijn laboratorium: om PBMC's te isoleren, begin met het verdunnen van 25 milliliters van een gehepariniseerd volbloedmonster met 25 milliliters PBS in een conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 15 milliliters Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt toe aan een nieuwe buis van 50 milliliter. Houd daarna de buis in een hoek en breng de verdunde celsuspensie langzaam in lagen aan over de dichtheidsgradiënt.Door hier rekening mee te houden, vindt er geen menging van de lagen plaats. Een van de meest kritische stappen in dit experiment is het laagjesgewijs toevoegen van het bloed zonder de dichtheidsgradiënt te verstoren. Dit i

assessment-immunomodulatory-properties-human-mesenchymal-stem-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates an in vitro assay to explore the immunomodulatory influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on effector T cell proliferation. The assay includes co-culturing MSCs with PBMCs to induce the monocyte population to acquire an immunomodulatory phenotype, leading to the secretion of interleukin-10 (IL-10). Following incubation with activated CD4+ T cells, the induced monocytes effectively suppress T cell proliferation.

An In Vitro Assay for Evaluating the Immunomodulatory Impact of Monocytes on Leukocyte Proliferation

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, zeer reproduceerbaar protocol om Mesodermale Voorlopercellen (MPCs) te isoleren uit menselijk beenmerg (hBM). MPCs werden gekenmerkt door middel van flowcytometrie en nestine-expressie. Ze toonden het vermogen om aanleiding te geven tot exponentieel groeiende MSC-achtige celculturen terwijl ze hun angiogenesepotentieel behielden.

Isoleren Mesangiogenic Progenitor Cells (MTR) van Human Bone Marrow

Het therapeutische potentieel van mesenchymale stam-/stromacellen (MSC's) is goed gedocumenteerd, maar de beste methode om de cellen voor patiënten voor te bereiden blijft controversieel. Hierin communiceren we protocollen om efficiënt therapeutische sferische aggregaten of 'sferoïden' van MSC's te genereren en toe te dienen, die onder xeno-vrije omstandigheden zijn voorbereid voor experimentele en klinische toepassingen.

Productie en toediening van therapeutische mesenchymale stamcellen / Stromal Cell (MSC) sferoïden primer in 3-D Cultures Onder Xeno-free Voorwaarden

Lymfkliertest studies in modellen van Colon ontsteking hebben aangetoond dat een klein percentage (1-5%) van mesenchymale stamcellen (MSC) intraveneus geïnjecteerd of intraperitoneally de thuisbasis van de ontstoken dubbele punt1,2. Deze studie toont aan dat echografie-geleide intracardiac injecties van MSCs in verhoogde localization voor de darm resulteren.

Echografie-geleide Intracardiac injectie van menselijke mesenchymale stamcellen toe Homing aan de darm voor gebruik in lymfkliertest modellen van experimentele inflammatoire darmziekten

Hier presenteren we een methode voor het efficiënt benutten van het potentieel van de cardiale differentiatie van jonge bronnen van menselijke mesenchymale stamcellen om te genereren van functionele, aanbestedende, cardiomyocyte-achtige cellen in vitro.

In Vitro Differentiatie van menselijke mesenchymale stamcellen in functionele Cardiomyocyte-achtige cellen

Hier wordt een protocol gepresenteerd om dynamische beelden van mesenchymale stamcel (MSC) gemedieerde regulatie van macrofaag (MΦ) fagocytose van niet-opsonized gist (zymosan) deeltjes die zijn geconjugeerd aan een pH-gevoelig fluorescerend molecuul te kwantificeren en te produceren.

Mesenchymale stamcelregulatie van macrofaagfagocytose; Kwantificering en beeldvorming

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen

De isolatie van BAMBIhogeMFGE8hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBIhogeMFGE8hoge UC-MSC's.

Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

Hier beschrijven we een methode om efficiënt uit te breiden en te zuiveren van grote aantallen menselijke NK-cellen en beoordelen hun functie.

Uitbreiding, zuivering, en functionele beoordeling van de humane perifere bloed NK-cellen

Leer de immuunmodulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen beoordelen met een co-cultuursysteem en CFSE-markering. Deze methode onthult mechanismen voor therapeutische toepassingen.

Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)

Meer video's verkennen