Beoordeling van de immuno-modulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC)
24 december 2015
De immuunmodulerende eigenschappen van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC) lijken steeds belangrijker voor klinische toepassing. Het gebruik van een co-kweeksysteem van MSCs en perifeer bloed leukocyten vooraf gekleurd met de fluorescerende kleurstof carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE), beschrijven we de in vitro beoordeling van MSC immunomodulatie bij effector leukocyt proliferatie en specifieke subpopulaties.
Het algemene doel van dit experiment is om de immunomodulerende eigenschappen van menselijke mesenchymale stamcellen of msc te beoordelen. Deze methode kan helpen bij het verduidelijken van de mechanismen die betrokken zijn bij de immunomodulatie door menselijke mesenchymale stamcellen, een proces dat therapeutische relevantie kan hebben. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat zowel het voorkomen van proliferatie van effectorleukocyten als het aantal celdelingen kan worden beoordeeld, wat aantoont dat de procedure per shoe zal zijn.
Een laborant uit mijn laboratorium: om PBMC's te isoleren, begin met het verdunnen van 25 milliliters van een gehepariniseerd volbloedmonster met 25 milliliters PBS in een conische buis van 50 milliliter. Voeg vervolgens 15 milliliters Ficoll-Paque dichtheidsgradiënt toe aan een nieuwe buis van 50 milliliter. Houd daarna de buis in een hoek en breng de verdunde celsuspensie langzaam in lagen aan over de dichtheidsgradiënt.
Door hier rekening mee te houden, vindt er geen menging van de lagen plaats. Een van de meest kritische stappen in dit experiment is het laagjesgewijs toevoegen van het bloed zonder de dichtheidsgradiënt te verstoren. Dit is om een hoge zuiverheid en een lage contaminatie met rode bloedcellen van de geïsoleerde pbmc te waarborgen.
Scheid nu de cellen door middel van centrifugatie. Er zouden drie duidelijke lagen zichtbaar moeten zijn: de bovenste plasmalaag, de onderste Ficoll-dichtheidsgradiëntlaag en een dunne middelste PBMC-laag.
Verwijder met een PE-pipet de bovenste laag, waarbij u er goed op let dat u de interfase-laag niet aspireert. Gebruik vervolgens een pipet van 10 milliliter om de pbmc voorzichtig over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter. Meng de cellen met 20 milliliter PBS en centrifugeer ze vervolgens om alle resten van de dichtheidsgradiënt te verwijderen.
Was vervolgens de pellet in nog eens 20 milliliters PBS om de bloedplaatjes te verwijderen. Resuspendeer de tweede pellet in compleet leukocytenmedium tot een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per milliliter. Verwarm voor het opzetten van een MSC-leukocyten-cocultuur compleet MSC-medium voor maximaal 30 minuten voor tot 37 °C.
Zaai vervolgens vijf keer 10⁴ MSC per één milliliter compleet MSC-medium per putje in 24-wells platen voor hechting gedurende de nacht bij 37 °C, zodat de cellen een confluentie van 80% bereiken. Aspireer de volgende ochtend het medium en voeg het juiste aantal CFSE-gelabelde PBMC's toe aan de MSC in één milliliter compleet leukocytenmedium. Activeer de cellen bij een verhouding van 1:10 MSC tot PBMC met 10 µg PHA per milliliter compleet leukocytenmedium.
Overbreng vervolgens op dag drie en vijf van de co-cultuur het juiste aantal co-culturen naar ronde bodem fax-buisjes en beoordeel de proliferatie van de CFSE-gelabelde leukocyten via flowcytometrische analyse om een effector-suppressie-assay uit te voeren. Begin met het opzetten van een MSC-pBMC-cocultuur zoals zojuist gedemonstreerd, met 2,5 × 10⁶ pBMC's in co-cultuur met 250.000 MSC's. Dit is om ervoor te zorgen dat er voldoende MSC-cocultuur pBMC's beschikbaar zijn voor de selectie van subpopulaties.
Na 48 tot 72 uur bij 37 °C selecteert u de gewenste door MSC geïnduceerde immunomodulerende leukocyten met de juiste magnetische beads. Voeg vervolgens CFSE-gelabelde allogene CD4-positieve T-cellen toe in één milliliter compleet leukocytenmedium per well in verschillende experimentele ratio's. Voeg daarna anti-CD3/28-geconjugeerde microbeads toe in een B-celratio van 1:1 om de CD4-positieve T-cel te stimuleren.
Beoordeel op de derde dag van de cocultuur de proliferatie van de CFSE-gelabelde CD4-positieve T-cellen via flowcytometrie. MSC's zijn adherente cellen met een fibroblastische, spoelvormige morfologie. PBMC's en leukocyten zijn kleine, ronde, niet-adherente cellen, wat een duidelijk onderscheid tussen deze twee celpopulaties mogelijk maakt. In een cocultuur, wanneer er geen proliferatie optreedt, worden CFSE-gelabelde cellen waargenomen als één sterk positieve en scherp fluorescerende piek zodra de cellen zijn geactiveerd.
Proliferatie manifesteert zich als meerdere kleinere pieken met een verlies en een verschuiving naar links van de fluorescentie-intensiteit wanneer proliferatiesuppressie heeft plaatsgevonden. In een MSC-cocultuur neemt bijvoorbeeld het aantal kleinere pieken af met een gelijktijdige toename van de fluorescentie-intensiteit, zoals blijkt uit de verschuiving van de pieken naar rechts en de toename in de scherpte van de meest rechtse piek, die de niet-delende cellen in een effector-suppressie-assay vertegenwoordigt. Het suppressieve effect van de MSC op de proliferatie van CD4-positieve T-cellen kan verder op een dosisafhankelijke manier worden beoordeeld.
Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe de immunomodulatie van menselijke mesenchymale stamcellen kan worden beoordeeld. Vergeet niet dat werken met menselijke cellen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt de immunomodulerende eigenschappen van humane mesenchymale stamcellen (MSC's) met behulp van een co-cultuursysteem met leukocyten uit perifeer bloed. De beoordeling richt zich op de proliferatie van effectorleukocyten en specifieke subpopulaties, waarbij de potentiële therapeutische relevantie van MSC's wordt belicht.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Immunologie
- Stamcelonderzoek
- Celproliferatie
Achtergrond
- Humaan mesenchymale stamcellen (MSC's) beschikken over immunomodulerende eigenschappen.
- Het begrijpen van de interacties tussen MSC's en leukocyten is cruciaal voor therapeutische toepassingen.
- De proliferatie van effectorleukocyten is een sleutelaspect van de immuunrespons.
- Co-cultuursystemen kunnen deze interacties in vitro effectief modelleren.
Doel van de studie
- Om de immunomodulerende effecten van MSC's op de proliferatie van leukocyten te beoordelen.
- Om de mechanismen van MSC-immunomodulatie te verduidelijken.
- Om de therapeutische relevantie van MSC's in klinische toepassingen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Co-cultuursysteem van MSC's en leukocyten uit perifeer bloed.
- Gebruik van carboxyfluoresceïne-succinimidylester (CFSE) voor celtracking.
- Beoordeling van de proliferatie van effectorleukocyten.
- Analyse van specifieke leukocytsubpopulaties.
Belangrijkste resultaten
- Aantoonde MSC-geïnduceerde modulatie van leukocytenproliferatie.
- Identificeerde specifieke subpopulaties die beïnvloed werden door MSC's.
- Bood inzicht in de mechanismen van MSC-immunomodulatie.
- Benadrukte het potentieel van MSC's in therapeutische contexten.
Conclusies
- MSC's vertonen significante immunomodulerende effecten op leukocyten.
- De bevindingen ondersteunen het therapeutische gebruik van MSC's in klinische settings.
- Verder onderzoek is nodig om de betrokken mechanismen volledig te begrijpen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het beoordelen van de immunomodulerende functie van MSC's via CFSE-gebaseerde leukocytenproliferatie-assays biedt een kwantitatieve, reproduceerbare methode om het therapeutische potentieel bij immuun-gemedieerde ziekten te evalueren. Deze aanpak ondersteunt doelvalidatie door mechanische risicoreductie van MSC-gemedieerde immunosuppressie mogelijk te maken voorafgaand aan preklinische investeringen. De aanpasbaarheid van de assay aan specifieke leukocyten-subpopulaties vergroot het voorspellende vertrouwen bij de selectie van lead-kandidaten voor immunomodulerende pijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de door MSC-gemedieerde onderdrukking van de proliferatie van effectorleukocyten te onderzoeken als een functionele readout van de immunomodulerende activiteit.
- Operationele waarde: Biedt een gestandaardiseerde, labelgebaseerde methode om de delingsgeschiedenis en proliferatiekinetiek te kwantificeren zonder gebruik van radioactiviteit.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt fenotypische screening van MSC-donoren of pre-conditioneringsstrategieën door de onderdrukking van CFSE-gelabelde leukocytenproliferatie te meten.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Maakt isolatie en tracking van specifieke leukocytsubsets (bijv. CD4+ T-cellen) mogelijk via magnetische bead-selectie voorafgaand aan co-cultuur, waardoor subset-specifieke profilering van immunomodulatie mogelijk wordt.
- Operationele waarde: CFSE-verdunningsprofielen gegenereerd door flowcytometrie leveren kwantitatieve, multiparametrische gegevens over proliferatiesuppressie en delingsgeschiedenis.
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de dosis-responsbeoordeling van MSC-immunomodulatie bij variërende MSC:leukocyt-ratio's en activatiecondities (bijv. PHA-stimulatie).
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt in vitro immunomodulerende potentie aan potentiële klinische effectiviteit bij immuungerelateerde ziekten door MSC-leukocyt-interactie te modelleren.
- Operationele waarde: Maakt longitudinale bemonstering mogelijk (bijv. dag 3 en 5) om de temporele dynamiek van suppressie en herstel te beoordelen.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt evaluatie op basis van biomarkers door proliferatiesuppressie te correleren met intracellulaire cytokuinexpressie in co-gecultiveerde leukocyten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De CFSE-gebaseerde leukocytproliferatie-assay is geïntegreerd in vroege discovery-workflows als een functionele immunomodulerende screeningstool, die de fasen van targetvalidatie en leadoptimalisatie voor MSC-gebaseerde therapeutica verbindt.
- Ontdekkingsbiologie: Test de hypothese dat MSC's de proliferatie van leukocyten onderdrukken, waardoor mechanistisch inzicht in immunosuppressieve pathways wordt verkregen.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve proliferatie-uitlezingen die vergelijking van MSC-lots, donoren of primingcondities mogelijk maken.
- Analytica: Genereert flowcytometriegegevens waarmee proliferatiepieken, divisie-tracking en subset-specifieke responsen in heterogene leukocytenpopulaties kunnen worden onderscheiden.
- Translationeel onderzoek: Modelleert in vitro interacties tussen menselijke immuuncellen en MSC's, wat extrapolatie naar klinische immunomodulerende contexten ondersteunt.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een modulair, aanpasbaar platform dat toepasbaar is op verschillende immuunceltypen en ziekterelateerde stimuleringscondities.
Operationele & Bedrijfseffecten
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door direct, kwantificeerbaar bewijs te leveren van door MSC-gemedieerde suppressie van leukocyten.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie van de assay via gedefinieerde MSC:leukocyten-ratio's, CFSE-labelingsprotocollen en flowcytometrische gatingstrategieën.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door MSC's met potente, reproduceerbare immunomodulatieve activiteit vroeg in de ontwikkeling te identificeren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van MSC-kandidaten mogelijk op basis van functionele immunomodulatieve sterkte in plaats van enkel op fenotypische markers.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in primaire leukocytenisolatie, CFSE-labeling en multicolor flowcytometrie-analyse.
- Afhankelijk van toegang tot flowcytometers die in staat zijn om CFSE-verdunningspieken te scheiden en magnetische bead-separatiesystemen voor subsetisolatie.
- Vereist standaardisatie van leukocytenactivatiecondities (bijv. PHA-concentratie) en MSC-pre-cultuurprotocollen tussen verschillende locaties.
- Vereist optimalisatie van MSC:leukocyten-ratio's en de duur van de co-cultuur om artefacten door overgroei of uitputting van voedingsstoffen te voorkomen.
- Beperkt door donorvariabiliteit in de responsiviteit van leukocyten, waardoor gepoolde of gematchte donorcontroles nodig zijn voor reproduceerbare suppressiemetrieken.
