Detectie van intracellulaire genexpressie in levende cellen van muizen, de mens en Porcine Origin Met behulp van fluorescentie-gelabelde Nanodeeltjes

Het algemene doel van deze procedure is om de intracellulaire genexpressie direct in levende cellen te analyseren via de toepassing van genspecifieke fluorescerende nanodeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst de juiste doelsequenties in het gen van belang te definiëren. De tweede stap is het produceren van nanodeeltjes met specifieke capture- en reporterstrengen.

Vervolgens worden de nanodeeltjes direct toegevoegd aan het kweekmedium van de levende cel. De laatste stap is om de cellen gedurende de nacht te incuberen met de nanodeeltjes bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. Ten slotte wordt fluorescentiemicroscopie gebruikt om genspecifieke fluorescentie in levende doelcellen te visualiseren, terwijl flowcytometrie-analyse wordt gebruikt om het aantal fluorescerende cellen te kwantificeren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals immunohistochemie, molecular beacons of PCR-analyse, is dat genexpressie visueel kan worden waargenomen in levende cellen zonder enige manipulatie van de celcultuur. De procedure wordt gedemonstreerd door Martina Teresa, een bioloog en PhD-student uit ons laboratorium, en Lynette Henkel voor de flowcytometrie. Bestel na het bepalen van de doelsequenties gelyofiliseerde goudnanodeeltjes bij commercieel beschikbare leveranciers.

Deze deeltjes bestaan uit een centraal gouddeeltje dat covalent is gekoppeld aan een capture-streng, welke gebonden is aan een reporter-streng. Wanneer het doel-mRNA bindt aan de capture-streng, komen de reporter-streng en de eraan gekoppelde fluorofoor vrij in de oplossing, waardoor de Fluor four fluorescentie kan emitteren. Voorafgaand aan de reconstitutie.

De nanodeeltjes moeten bij vier graden Celsius in het donker in een kartonnen doos worden bewaard. Om de goudnanodeeltjes te reconstitueren, voegt u 20 microliters dubbel gedestilleerd water toe, wat resulteert in een eindconcentratie van 100 nano molars. De gereconstitueerde nanodeeltjes kunnen gedurende ten minste één jaar bij kamertemperatuur in het donker worden bewaard.

Verdun op de dag van applicatie de stockoplossing van goudnanodeeltjes tot een 20 x werkoplossing in PBS. Haal een 24-wells plaat met HEK 2 93-cellen uit de celkweekincubator, aspireer het medium en voeg vervolgens 237,5 µL vers kweekmedium toe. Pipetteer daarna 12,5 µL van de werkoplossing van nanodeeltjes in elke voorbereide well en draai de plaat rond om een gelijkmatige verdeling van de nanodeeltjes te garanderen. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde atmosfeer. De volgende dag.

Analyseer de celculturen op fluorescentie van genspecifieke site drie met een standaard fluorescentiemicroscoop om de cellen voorstroomcytometrie voor te bereiden. Was de HEK 2 9 3 cellen die site drie-geïnduceerde fluorescentie vertonen eenmaal met PBS en voeg één milliliter 0,05%trypsine EDTA toe; incubeer de cellen gedurende drie minuten bij 37 °C en 5%CO2. Voeg na de incubatie 0,5 milliliter CO-medium toe en pipetteer dit op en neer.

Breng de cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Voeg drie milliliter kweekmedium toe en centrifugeer de buis vijf minuten bij 300 ×g. Verwijder daarna het supernatant en resuspendeer de cellen in 200 µL ijskoude fax-buffer. Breng de cellen over naar een buis van 1,5 milliliter en bewaar ze op ijs en in het donker tot aan de analyse.

Haal de cellen vóór de fax-analyse door een filter van 30 micrometer om celaggregatie te voorkomen. Voeg vervolgens propidiumjodide toe aan de cellen tot een eindconcentratie van 2 µg/mL voor ten minste twee minuten, breng de cellen naar de vortex van de flowcytometer en plaats de monsterbuis in het apparaat. Om SI drie positieve cellen te detecteren.

Gebruik onbehandelde controlecellen om de hiërarchische gates in te stellen op de subset van forward scatter of FSC-oppervlakte versus side scatter of SSC-oppervlakte, de FSC-hoogte versus FSC met subset en de SSE-hoogte versus SSE met subset om celdebris en ongesorteerde cellen uit te sluiten. Verwijder de dode cellen uit de analyse op basis van propidiumjodide-kleuring door het PE-kanaal tegenover het PE Texas Red-kanaal weer te geven, en voer vervolgens de definitieve sorteergate uit op site drie PE-positieve cellen. Detectie van GA dh.

Een constitutief tot expressie gebracht housekeeping-gen werd onderzocht in HEK 293-cellen om de experimentele haalbaarheid te valideren. Scrambled negatieve controle-nanodeeltjes vertonen weinig tot geen fluorescentie, terwijl positieve opname een permanente fluorescentie vertoont. Controles vertonen een sterk signaal na een incubatie van één nacht.

Deze nanodeeltjes bleken specifiek de pluripotente stamcelmarkers, nano en GDF drie genexpressie, te detecteren in spiegelende menselijke en porcine geïnduceerde pluripotente stamcellen of IPC's. Belangrijk is dat deze markers alleen werden gedetecteerd in de IPC's en niet in de fibroblastcellen die dienden als feederlaag tijdens de IPS-celkweek. Zowel visuele als kwantitatieve analyse via flowcytometrie werden gebruikt om de labelingsefficiëntie van GA DH nanodeeltjes te beoordelen bij een gradatie van nanodeeltjes van 0 tot 1000.

PICO molar werd uitgevoerd met HEK 2 93-cellen, waarbij een duidelijke concentratieafhankelijke toename van de fluorescentie werd aangetoond. Vervolgens werd een kwantitatieve analyse uitgevoerd in murine embryonale stamcellen, die ongeveer 40% CY drie-positieve cellen vertoonden na toevoeging van 400 PICOMOLAR GA DH-nanodeeltjes. Vergelijkbare waarden werden verkregen voor de pluripotentiemarkers.

Nano en GDF three eenmaal beheerst. Deze techniek kan binnen 16 uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe gen-specifieke nanodeeltjes kunnen worden gebruikt om intracellulaire genexpressie direct in levende cellen aan te tonen met behulp van fluorescentiemicroscopie.