Epitheelcellen Herbevolking en voorbereiding van knaagdieren extracellulaire matrix Stellingen voor nierweefsel Development

Het algemene doel van deze procedure is om acellulaire driedimensionale nierextracellulaire matrixschalen van knaagdieren opnieuw te bevolken met menselijke nierepitheelcellen. Dit wordt bereikt door eerst het decellulariseren van een haw rat nier met een reeks detergentoplossingen die gedurende een periode van 26 uur via de nierslagader worden geperfundeerd. De nier wordt vervolgens gesteriliseerd en de acellulaire nierextracellulaire matrixschalen worden geïnjecteerd met 40 miljoen menselijke nier corticale tubulaire epitheel of RCTE-cellen onder continue anterograde arteriële perfusie binnen een op maat ontworpen Biore reactor systeem.

Uiteindelijk kan de capaciteit van de RCTE-cellen om het nieronderstel opnieuw te bevolken worden beoordeeld door ER en perfusie assay en immunohistochemische analyse. Deze 3D-celcultuurtechniek stelt onderzoekers in staat om het gehele orgaan extracellulaire matrix opnieuw te bevolken. Schaalcellen worden gedeponeerd in de peritubulaire ruimte binnen de extracellulaire matrix om onderzoek en bindingsfactoren die de celgroei, differentiatie en rijping beïnvloeden, mogelijk te maken.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven alternatieve methoden zoals de fabricage van synthetische polymeerschalen, is dat de nierextracellulaire matrix de adhesie, proliferatie en rijping van de geperfundeerde cellen binnen een ingewikkeld netwerk van natuurlijke structurele eiwitten, groeifactoren en andere biologische componenten faciliteert. Begin de decellularisatieprocedure door de nierslagaderkatheter van elke ontdooid nier aan te sluiten op het uiteinde van de perfusiecircuitbuis downstream van de pomp, ervoor zorgen dat er geen luchtbellen in de katheter vastzitten. Als er luchtbellen in de katheter aanwezig zijn, gebruik dan een 200 microliter micropipet om de bellen eruit te trekken en de katheter met vloeistof te vullen.

Hengende de nier langs de binnenwand van een lege vijf liter beker zodat de nierslagader niet geknikt of opgerold is, en pas de pompaandrijving aan op vijf milliliter per minuut. Druk vervolgens op start na het bevestigen dat elke nier perfundeert door het druppelen van oplossingen vanaf de onderkant van het orgaan plus elke nier met de juiste oplossingen zoals aangegeven in de stroomschema aan het einde van de perfusie, de gedecellulariseerde nieren in PBS in een 50 milliliter conische buis op vier graden Celsius of maximaal twee. Na het samenstellen van het perfusiecircuit, verwijdert u de rode schroefdop op de bioreactorkop en pipet 50 milliliter van een 0,1% per azijnzuur, 4% ethanol oplossing in het medium reservoir via de opening.

Gebruik een mannelijke lure plug om de poort te sluiten. Laat het circuit volledig primen totdat er geen lucht wordt waargenomen in de perfusiecircuitbuis of aan de binnenkant van de inlaat. Lure acceptor verdrijft bellen uit het perfusiecircuit door tijdelijk de stroomsnelheid van de pomp te verhogen.

Wanneer het systeem volledig is geprimed, stopt u de pompaandrijving en steriliseert u zes inch forceps. Om voorzichtig de vrouwelijke lure-eind van de nierslagaderkatheter in de mannelijke inlaat, lure acceptor op het binnenoppervlak van de bioreactorkop, te pluggen, zorg ervoor dat de verbinding strak is en dat er geen lucht in de katheter achterblijft. Laat de nier voorzichtig hangen aan de nierslagaderkatheter zodat de nierslagader niet draait of knik.

Vervolgens draait u de metalen klem die de bioreactorkop en -lichaam samenhoudt vast, zodat het bioreactorreservoir strak gesloten is en sluit u de schroefdop. Steriliseer nu de nieren met een kamertemperatuurperfusie van de per azijnzuur ethanol oplossing bij vijf milliliter per minuut. Na een uur stopt u de pomp en opent u de rode schroefdop.

Gebruik een steriele stamper, pipet zorgvuldig alle oplossing uit het bioreactorreservoir. Pipet vervolgens 50 milliliter verse PBS in het bioreactorreservoir. Sluit de schroefdop en start de pomp voor drie opeenvolgende uur perfusies bij kamertemperatuur bij vijf milliliter per minuut.

Na de laatste PBS-spoeling, aspireert u het zoutoplossing uit het reservoir en voegt u 50 milliliter medium toe aan het reservoir met een gesloten schroefdop. Breng de bioreactor met het bijgevoegde perfusiecircuit over naar een grote capaciteit incubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Verbind vervolgens het bioreactorperfusiecircuit met de pomp en perfundeer de nieren gedurende ten minste één uur voorafgaand aan het zaaien bij vier milliliter per minuut.

Om te cellulariseren, verzamelt u een voldoende aantal kweekflacons voor de gewenste zitconcentratie. Vervolgens, na het aspireren van het kweekmedium uit elke flacon, gebruikt u 10 milliliter van het geschikte celdissociatie-enzym om de nier corticale tubulaire epitheelcellen van de flacon bij 37 graden Celsius te heffen. Begin na 10 minuten de flessen elke twee minuten te controleren op een gezichtscontrastmicroscoop totdat vouwdetachering wordt waargenomen.

Neem vervolgens een kleine aliquot van cellen voor het tellen, verdun de bijbehorende celsuspensie in een gelijk volume premed medium en centrifugeer de cellen resus. Breng het pellet op met een geschikt volume kweekmedium om een ​​eindconcentratie van twee keer 10 tot de zevende cellen per milliliter te verkrijgen. Breng twee milliliter van de zittingssuspensie over in een 35 millimeter kweekschaal en trek vervolgens het twee milliliter volume in een steriele vijf milliliter spuit.

Breng de perfusiebioreactor over naar een biologische veiligheidskast en draai de stopklepklep om de stroom naar de zitpoort te sluiten. Verwijder de mannelijke lure slip plug van de stopklep en sluit de spuit aan. Breng vervolgens snel het perfusiecircuit terug naar de incubator en gebruik de grote pompcartridge om het peristaltiekpompsegment van de buis aan de pompkop te bevestigen om de cellen te plaatsen.

Sluit de stopklepkleppoort die naar de pomp wijst en injecteert u langzaam de cellen in het nieronderstel. Draai vervolgens de stopklepklep om de stroom vanuit de spuit te sluiten en start de pomp bij 25 milliliter per minuut. Na 15 minuten verlaagt u de pompstroomsnelheid tot vier milliliter per minuut, vervangt u het medium de volgende dag en elke twee dagen daarna.

Om de levensvatbaarheid en proliferatie van de cellen te