Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Het algemene doel van deze procedure is om genetisch gemodificeerde organotypische huidculturen te genereren met behulp van gereactiveerde humane dermis om de impact van veranderde genexpressie op epidermaal groei en differentiatie te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van dermatologie, zoals het bepalen welke genen verantwoordelijk zijn voor epi-groei, differentiatie en progressie naar ziekte. Het grote voordeel van deze techniek is dat genetisch gemodificeerde menselijke huid binnen een paar dagen wordt gegenereerd, wat de studie van menselijke monsters mogelijk maakt die potentieel klinisch relevant zijn.

Het demonstreren van de procedure zal jingly zijn uit mijn laboratorium. Als u bevroren menselijke huid ontvangt, plaatst u het weefsel gedurende drie tot vijf minuten in de weefselkweekkap om het te ontdooien. Eenmaal ontdooid, brengt u het weefsel over in een steriele 50 milliliter conische buis of 125 milliliter fles, afhankelijk van de grootte.

Voeg vervolgens vier x penicilline en streptomycine toe in een XPBS totdat de container 75% vol is. Sluit de container af en schud krachtig gedurende vijf minuten. Verwijder de antibioticaoplossing en herhaal dit.

Stap drie keer meer na de laatste wassing, breng het weefsel over naar een nieuwe container en voeg verse antibioticaoplossing toe. Incubeer dit mengsel in een weefselkweekincubator bij 37 graden Celsius gedurende twee weken om de scheiding van de dermis van de epidermis mogelijk te maken. Nadat twee weken zijn verstreken, gebruikt u een pincet om de epidermis van de dermis te pellen.

Verwijder de epidermis volgens het protocol van de instelling voor het omgaan met menselijk weefsel. Plaats de dermis in een container met antibioticaoplossing en was met krachtig schudden zoals eerder. Na de laatste wassing, brengt u de dermis over naar een nieuwe container met antibioticaoplossing en bewaart u deze bij vier graden Celsius tot u klaar bent om de dag voor transfectie de Phoenix-cellen in compleet medium in een zes-wellplaat te zaaien met een dichtheid van 800.000 cellen per well.

Op de dag van transfectie, meng zes microliters transfectiereagens met 100 microliters dmm. Voor elke well die getransfecteerd moet worden en incubeer bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten, voegt u het mengsel toe aan een buis met drie microgram retroviraal vector voor elke well die getransfecteerd moet worden en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten, voegt u dit gehele mengsel druppelsgewijs toe aan elke well van de Phoenix-cellen en incubeer de cellen 's nachts na de transfectie. Verwijder het medium van de Phoenix-cellen en voeg op dezelfde dag twee milliliter vers compleet medium toe.

Resuspendeer primaire menselijke keratinocyten in keratinocyten serumvrij medium met antibiotica en zaai in zes wandplaten met een dichtheid van 75.000 cellen per well. De volgende dag oogst u het medium dat nu virale deeltjes bevat van de getransfecteerde Phoenix-cellen. Laat het medium door een 0,45 micron filter lopen met behulp van een spuit om eventuele verontreinigende cellen te verwijderen.

Voeg vijf microgram per milliliter hexa dimethylbromide toe aan het gefilterde virus bevattende medium om het infectieproces te helpen mediëren. Pipetteer vervolgens twee milliliter van het virus op de keratinocyten die de vorige dag zijn geplateerd. Draai vervolgens de zes wandplaten een uur lang bij 200 Gs in een centrifuge bij kamertemperatuur.

Na het centrifugeren, verwijdert en gooit u het medium met virus weg. Was de cellen eenmaal met een XPBS en voeg de volgende dag vers K-C-S-F-M toe. Infecteer dezelfde batch keratinocyten met virus volgens de zojuist getoonde procedure.

Om organotypische cassettes te maken. Gebruik een cautery om een vierkant van één centimeter bij één centimeter uit het midden van de deksel van een 3,5 centimeter weefselkweekschaal te verwijderen. Bevestig vierkante pinnen aan de onderkant van de cassette met behulp van doorzichtige nagellak en laat vijf minuten staan om de nagellak te laten drogen.

Keer vervolgens de cassette om en plaats de cassette in een zes centimeter schaal met een cassette die op de pinnen rust. Haal de dermis uit de opslag bij vier graden Celsius en breng het over in een container met keratinocyten groeimedium om te wassen.

Na het herhalen van de wassing, plaats de dermis in vers KGM en incubeer gedurende twee dagen bij 37 graden Celsius. Gebruik na de incubatie een scalpel om de dermis in stukken van 1,5 centimeter bij 1,5 centimeter te snijden. Plaats vervolgens op het vierkante gat van de organotypische set met de bovenkant van de dermis naar boven.

Gebruik een pincet om de volledige organotypische cassette met de dermis om te draaien. Voeg vijf druppels vers ough extracellulair matrix toe aan de onderkant van de dermis en schud lichtjes om een gelijkmatige verdeling over de dermis te garanderen. Laat het extracellulaire matrix vijf minuten stollen, gebruik vervolgens een pincet om de cassette terug om te draaien en voeg vervolgens vier milliliter KGM toe aan de zes centimeter schaal.

Vervolgens, na het oogsten en tellen van de genetisch gemodificeerde keratinocyten, resuspendeer 0,5 tot 1 miljoen cellen in 90 microliter KGM en verdeel de cellen op de dermis. Incubeer de co-cultuur bij 37 graden Celsius. Ververs het medium op de culturen om de dag.

Volledige stratificatie en differentiatie van de epidermis vindt meestal plaats na vijf dagen. Weefsel kan tot 14 dagen na het plateren worden geoogst. Deze afbeelding toont hematine en eosinekleuring van organotypisch.

Huidculturen geregenereerd menselijk weefsel bevat zowel de epidermis als dermis. De epidermis is volledig gelaagd en gedifferentieerd met vier verschillende lagen, waaronder de ongedifferentieerde basale laag en de drie gedifferentieerde lagen inclusief het stratum, spinosum, ranum en cornium. Deze immunofluorescencebeelden laten zien dat overexpressie van SNA i twee zoals rechts getoond, epidermale differentiatie remt in vergelijking met controleweefsel links getoond dat is gekleurd voor de differentiatie.

Eiwitkeratien een of K een wordt getoond in groen en kernen zijn gemarkeerd in blauw. RTQ PCR R analyse om mRNA-niveaus van SNAI twee in controle LAC Z en S NNA I