Omgeschreven Capsular Infarct Modeling Met behulp van een fototrombotisch Techniek
2 juni 2016
Dit manuscript beschrijft een modellering techniek van kapselvorming infarct. Hier hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde fototrombotisch techniek met een lage intensiteit van het licht na de pre-operatie doel mapping. Met behulp van deze techniek, hebben we een omgeschreven kapselvorming infarct model met aanhoudende motorische handicap.
Het algemene doel van deze techniek is om een omschreven capsulaire infarctmodel te creëren met een aanhoudende motorische beperking met behulp van de fototrombotische techniek. Voordat het capsulaire infarct wordt gemaakt, is het noodzakelijk om het voorpootgebied in de interne capsule te identificeren door een adeno-geassocieerd virus dat GFP tot expressie brengt in het voorpootgebied van de motorische cortex te introduceren. Begin met het plaatsen van een geanesthetiseerde rat in een stereotactische frame.
Scheer vervolgens het hoofd van de rat en steriliseer de hoofdhuid met 70%alcohol en een oplossing van povidon en jodium. Injecteer 2%lidocaine hydro chloorchloride onder de hoofdhuid in het gebied van de beoogde hoofdhuidincisie om intra-operatieve pijn te verminderen. Breng oogzalf aan om uitdroging van de ogen te voorkomen.
En plaats een steriele spreien over het dier. Na het maken van een middenlijnincisie van twee centimeter in de hoofdhuid, positioneer de stereotactische arm om het voorpootgebied van de motorische cortex te identificeren volgens de stereotactische coördinaten. Boor een ingangsgat op deze positie.
Verplaats de naald naar het geboorde gat en laat de naald één millimeter zakken door de dunne hersenhuid en de motorische cortex binnen. Gebruik een hoogprecisie micropomp om langzaam één microliter virus te injecteren. Laat de naald gedurende een extra 10 minuten op zijn plaats om terugstroming door het naaldkanaal te voorkomen.
Zodra 10 minuten zijn verstreken, trek de naald langzaam terug. Na het schoonmaken van de operatieve plaats met zoutoplossing, bevestig de wond met een 3-0 nylon hechtdraad. Laat de rat vervolgens los uit het stereotactische frame en breng hem over naar een herstelkamer voor monitoring.
Dien pijnstillers toe voor postoperatieve pijnbestrijding. Na twee tot drie weken, slacht de rat volgens goedgekeurde methoden en snij de gecryoprotecteerde hersenen door. Na het kleuren voor GFP, observeer de AAV-GFP getransduceerde axonen in de interne capsule met een fluorescente microscoop.
Vergelijk de locaties van de getransduceerde axonen zoals te zien op de fluorescente afbeelding met de rattenhersenatlas om nauwkeurig de stereotactische coördinaten van de getransduceerde axonen te bepalen. Om de optische neurale interface voor te bereiden, gebruik eerst een snijboor om ongeveer vier centimeter van een 27 gauge spinale naald met een stylet erin te snijden. Strip vervolgens 10 centimeter van de mantel van een optische vezel.
Plaats het niet-mantelde stuk van de optische vezel in een metalen buis. En klemm de buis rond de vezel. Gebruik vervolgens een pers om de onderste 1/2 van de metalen buis twee keer vast te klemmen.
De metalen buis vult de ruimte tussen de optische vezel en de kern van de spinale naald. Breng hittehardende epoxy aan op de optische vezel. Breng extra epoxy aan op de lege ruimte in de kern.
En plaats de optische vezel in de spinale naald. Laat de epoxy 20 minuten bij 100 graden Celsius uitharden voor stabiele fixatie. Zodra uitgehard, splijt de optische vezel die uit de spinale naald steekt en gebruik vervolgens diamantschuurbladen om de optische vezel aan het uiteinde van de spinale naald te polijsten.
Verbind tenslotte de FCPC-connector van de patchkabel met de koppeling van het groene lasersysteem. Gebruik vervolgens een digitale optische vermogens- en energiemeter om de lichtintensiteit vanaf het uiteinde van de optische vezel te meten om een nauwkeurige lichtemissie te garanderen. Plaats een verwarmingskussen onder het lichaam van het dier om de lichaamstemperatuur op 37,5 graden Celsius te houden tijdens de operatie.
Begin met het anesthetiseren en voorbereiden van de rat voor de operatie zoals eerder. Na het maken van een middenlijnincisie van twee centimeter, pas de hoogte van de neusklemmen aan totdat de Bregma en Lambda op hetzelfde niveau zijn uitgelijnd. De juiste uitlijning is cruciaal om de interne capsule correct te targeten.
Positioneer de stereotactische arm om de site voor fototrombose te lokaliseren. Boor vervolgens een twee millimeter gat op dit punt. Poets en maak vervolgens de optische vezeltip van de ONI schoon en bevestig deze aan het stereotactische frame zonder het te buigen.
Controleer het uiteinde van de ONI om ervoor te zorgen dat het schoon en intact is. Meet de laserintensiteit vanaf het uiteinde van de optische vezel voorafgaand aan de inbrenging van de optische interface in het doelgebied van de rattenhersenen. Pas de laserintensiteit aan tot 3,5 milliwatt op het uiteinde van de optische vezel.
Nu, laat de ONI zakken in het doelgebied van de interne capsule met behulp van de dorsoventrale coördinaat die in het eerste deel van het protocol is bepaald. Injecteer vervolgens twee milligram per kilogram Rose Bengal via de staarvene en start vervolgens een afteltimer ingesteld op één minuut. Wanneer de minuut is verstreken, zet de 532 nanometer groene laser gedurende 90 seconden aan om het infarct te creëren.
Na een bestraling, verwijder voorzichtig de ONI uit de hersenen. Na het schoonmaken van de operatieve plaats, bevestig de wond met een 3-0 nylon hechtdraad. Verwijder vervolgens de rat uit het stereotactische frame en breng hem over naar een herstelkamer.
Deze afbeelding toont de omvang van infarctlaesies bij verschillende intensiteiten van laserlicht van twee milliwatt tot vijf milliwatt twee weken na fototrombotisch laesioneren. Pijlen geven de infarctlaesie aan. De optische lichtintensiteit wordt beschouwd als tussen de drie milliwatt en vier milliwatt in deze experimentele setting.
De volgende twee afbeeldingen tonen het microscopische uiterlijk van het capsulaire infarct drie weken na fototrombose. In deze coronale sectie van de rattenhersenen, geven de pijlpunten het spoor van de naald met de optische vezel in de thalamus en tot aan de interne capsule aan. Deze seriële geneste gekleurde secties tonen de omvang van de infarctlaesie in de interne capsule.
De pijlen geven de infarctlaesie aan.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit manuscript beschrijft een modelleringstechniek van capsulair infarct met behulp van een gemodificeerde fototrombotische techniek. Deze aanpak maakt de creatie van een afgebakend capsulair infarctmodel mogelijk dat resulteert in aanhoudende motorische beperking.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Neurobiologie
- Motorische beperking
Achtergrond
- Capsulaire infarcten worden geassocieerd met motorische tekorten.
- Fototrombotische technieken worden gebruikt om gelokaliseerde hersenletsels te induceren.
- Het begrijpen van mechanismen van motorische beperking is cruciaal voor het ontwikkelen van therapeutische strategieën.
- Doelwitmapping is essentieel voor nauwkeurige modelcreatie.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbaar model van capsulair infarct te ontwikkelen.
- Om de effecten van capsulair infarct op de motorische functie te onderzoeken.
- Om een gemodificeerde fototrombotische techniek te gebruiken voor nauwkeurige targeting.
Gebruikte methoden
- Identificatie van het voorpootgebied in de interne capsule met behulp van adeno-geassocieerd virus dat GFP tot expressie brengt.
- Voorbereiding van de rat door anesthesie en plaatsing van een stereotactische frame.
- Sterilisatie van de hoofdhuid en voorbereiding van de incisie.
- Injectie van lidocaïne om intraoperatieve pijn te minimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle creatie van een afgebakend capsulair infarctmodel.
- Demonstratie van aanhoudende motorische beperking na het infarct.
- Validatie van de gemodificeerde fototrombotische techniek.
- Totstandbrenging van een reproduceerbare methode voor toekomstige studies.
Conclusies
- De gemodificeerde fototrombotische techniek is effectief voor het modelleren van capsulair infarct.
- Dit model kan worden gebruikt om motorische beperkingen en mogelijke interventies te bestuderen.
- Verder onderzoek is nodig om onderliggende mechanismen van motorische tekorten te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This photothrombotic technique enables precise modeling of white matter stroke by selectively targeting the internal capsule while sparing adjacent gray matter. The resulting circumscribed capsular infarct produces persistent motor deficits, providing a disease-relevant system for mechanistic de-risking of neurotherapeutic candidates. The model supports target validation and preclinical assessment of interventions aimed at white matter pathology, addressing a critical gap in stroke research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to white matter stroke pathophysiology.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for functional target validation in motor circuitry.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by linking infarct location to persistent motor impairment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lesion volumes via optical intensity titration for dose-response assessment.
- Operational Value: Delivers highly replicable infarct models with consistent motor deficit readouts.
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream compound screening in neuroprotection or neurorepair.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Models white matter stroke at behavioral, circuit, and cellular levels for preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions based on lesion specificity and functional outcome correlation.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of infarct extent with motor deficit severity for predictive biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target identification through preclinical efficacy testing, enabling iterative refinement of neurotherapeutic strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of white matter vulnerability and circuit-specific motor pathway disruption.
- Screening: Enables assay standardization through precise lesion control and quantitative motor deficit scoring.
- Analytics: Provides volumetric infarct measurements and behavioral readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity via persistent motor deficit phenotyping.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of neuroprotective and rehabilitative compounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target engagement through selective white matter infarct modeling.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via laser intensity calibration and stereotaxic targeting.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk by enabling early mechanistic de-risking of white matter pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on ability to mitigate persistent motor deficits in a validated model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral vector delivery, stereotaxic surgery, and optical neural interface fabrication.
- Depends on precision instrumentation including stereotaxic frames, microinjectors, and calibrated laser systems.
- Necessitates cross-team standardization for viral titer consistency, optical fiber preparation, and postoperative monitoring.
- Adaptation considerations include species-specific stereotaxic coordinates and optical properties of gray versus white matter.
- Practical limitations include surgical complexity and the need for postoperative validation via histology and behavior.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Identification of the Forelimb Area in the Internal Capsule Using AAV-GFP
3:09
Construction of the Optical Neural Interface
4:41
Photothrombotic Infarct of the Internal Capsule
6:44
Results: Microscopic Appearance of Capsular Infarct after Photothrombosis
7:38
Conclusion
