Name: Omgeschreven Capsular Infarct Modeling Met behulp van een fototrombotisch Techniek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Leer een fototrombotische techniek om een capsulair infarctmodel met aanhoudende motorische beperking te creëren bij ratten. Deze methode maakt nauwkeurige targeting van de interne capsule mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van het Institute of Medical System Engineering (Imse) &amp; GIST-Caltech Collaborative Fund (K04592) van GIST en door de Basic Science Research Program door de NRF Korea gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT en de toekomst Planning (NRF-2013R1A2A2A01067890).

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van Gwangju Institute of Science and Technology (GIST), en alle procedures werden door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op GIST goedgekeurd. 1. Pre-laesie Stappen <ol><li> Identificatie van de voorpoot in de interne capsule met behulp van AAV-GFP <ol><li> Huis en handvat Sprague Dawley ratten (~ 400 g, 11-13 weken) in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen. </li><li> Steriliseer alle chirurgische instrumenten en de elektroden met behulp van een geschikte sterilisator (Steam of Plasma sterilisator). Gebruik stoomsterilisator bij 121 ° C en instelling van 30 minuten voor sterilisatie en 30 min voor droge. </li><li> Verdoven het dier met een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg / kg) en xylazine (7 mg / kg) via een intramusculaire injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door poot knijpen. Handhaving van de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C door middel van een verwarmingselement onderhet lichaam van het dier. </li><li> Plaats het dier in een stereotactische frame met behulp van een oor bar en mond houder. </li><li> Reinigen en ontsmetten van de chirurgische site met 70% alcohol en povidonjodium oplossing. Infiltreren 2% lidocaïne hydrochloride onder de hoofdhuid in de beoogde schedel incisie gebied om de intra-operatieve pijn te verminderen. </li><li> Toepassen dierenarts oogzalf om uitdroging van de ogen te voorkomen. Plaats een steriel laken over de dieren naar de operationele sites. Handhaaf alle procedures in steriele omstandigheden. </li><li> Voer een middellijn schedel incisie van 2 cm met behulp van een scalpel en trekken de huid bilateraal met draad oprolmechanismen. Droog de schedel met wattenstaafjes en 30% waterstofperoxide. </li><li> Maak een gat met behulp van een hand stuk boor over de voorpoot gebied van de motorische cortex (AP: 2,5 uit bregma, ML: ± 2,5 vanaf de middenlijn) en verwijder het darmkanaal met micro-currette voor virus-injectie. </li><li> Ontdooi de AAV-GFP (2 x 10 12 virus moleculen / ml) op ijs en de belasting 1 ui van hetvirus in een 10 gl spuit. Plaats de spuit op de stereotactische frame. </li><li> Verplaats de naald op de vooraf gemaakte gat en laat de naald 1 mm diep in de dura. </li><li> Injecteer het virus langzaam (0,1 ul / min) met een hoge precisie micropomp en laat de naald op zijn plaats gedurende nog 10 minuten om het virus te diffunderen. </li><li> Na het reinigen van de operatieve plaats met een zoutoplossing irrigatie, zet de wond met 3-0 nylon hechtdraad; laat de rat uit de stereotactische frame en overbrengen naar een herstel kamer. Dien ketoprofen (2 mg / kg) via een intramusculaire injectie voor postoperatieve pijnbestrijding. </li><li> Handhaaf de lichaamstemperatuur (37 ° C) met verwarmingselement en beheren tweede generatie cephems klasse antibiotica (0,1%, 1 ml) via een intramusculaire injectie en 2% lidocaïne hydrochloride subcutaan nodig. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn herwonnen te onderhoudenborstligging. Enkel huis van het dier tot volledig herstel. </li><li> Na 2-3 weken herstel diep verdoven de rat met een overdosis ketamine hydrochloride (300 mg / kg) via een intramusculaire injectie in de kap. Controleer of de dood van de dieren door een gebrek aan teen knijpen respons, hartslag en ademhaling. Plaats de rat rugligging in de kap. </li><li> Open de buikholte via een &#39;Y&#39;-vormige insnijding aan de borstholte geopend. Nauw klem de afdalende aorta met een hemostaat en scheuren de rechter atrium van de rat hart voor het bloed drainage. Initiëren perfusie in de linker hartkamer met koude 1% paraformaldehyde gedurende 5 min (10 ml / min), gevolgd door 4% paraformaldehyde gedurende 30 min (10 ml / min). </li><li> Verwijder de rat hoofd van karkas met behulp van een schaar. Maak een middellijn incisie van de nek tot de neus en verwijder de nekspieren met behulp van schaar of rongeur zodat schedel wordt blootgesteld. Voorzichtig ontleden de schedel botten en Duras uit de hersenen. </li><li>Pak de hersenen en plaats de hersenen van de rat in een 50 ml conische buis &#39;s nachts gevuld met 4% paraformaldehyde. De volgende dag, was de hersenen met 1x PBS 3 keer en plaats deze in een 30% sucrose-oplossing. </li><li> Wanneer de hersenen volledig zinkt naar de bodem van de 30% sucrose oplossing, plaats de hersenen in de cryomold met OCT verbinding bij -20 ° C in cryotoom. Snijd de hersenen frontale vlak bij een dikte van 40 urn en een interval van 200 um. </li><li> Voer GFP immunohistochemie kleuring met behulp van de slide-methode 14. Toepassen primaire antilichaam (1: 200 van anti-Green Fluorescent Protein, konijn IgG-fractie) aan hersencoupes nacht bij 4 ° C. Op Dag 2, wassen met 1% fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (PBST) oplossing 3 maal en toepassen secundair antilichaam (1: 500 van geit-anti-konijn IgG (H + L)) gedurende 1 uur. Spoel de dia met 1% PBST 3 keer. Plaats het deksel glas op de hersenen slice. </li><li> Met behulp van een fluorescentiemicroscoop (excitatiegolflengte470 nm, emissiegolflengte 525 nm, vergroting 5x), acht de AAV-GFP getransduceerde axonen in de interne capsule. Vergelijk de locaties van getransduceerde axons de Rat Brain Atlas 15 de stereotactische coördinaten van het getransduceerde axonen bepalen </li></ol></li><li> Pre-laesie Aanpassing van de lichtintensiteit Geschikt voor Capsular Infarct Modeling <ol><li> De bouw van de Optical Neural Interface <ol><li> Snij een juiste lengte (4 cm) van een 27 gauge spinale naald met een stift in met behulp van een scherpe boor. LET OP: Het snijden kan comprimeren en plet de spinale naald; Verwijder de stilet en poets de spinale naald naar de geplette gedeelte van de spinale naald te verwijderen en de binnenste kaliber van de spinale naald te handhaven. </li><li> Strip een geschikte lengte (10 cm) van de mantel van de optische vezel (125 urn met een 62,5 urn kern) van een zijde patch cord. </li><li> Plaats de unjacked optische fiber in de metalen buis (buitendiameter: 3,8 mm, binnendiameter: 3,3 mm Lengte: 17 mm), dat vervolgens wordt geklemd rond de vezel. De metalen buis is nuttig om de ruimte tussen de optische vezel en de naaf van de spinale naald vullen. Klem de onderste 1/2 van de metalen buis met een perser tweemaal. </li><li> Breng de warmte hardbare epoxy op de optische vezel en steek de optische vezel in de spinale naald. Toepassen extra epoxy om de lege ruimte in de naaf. Hard de epoxy gedurende 20 minuten bij 100 ° C voor stabiele bevestiging. </li><li> Splijten van de optische vezel die uitsteekt uit de spinale naald en poets de optische vezel aan het uiteinde van de spinale naald behulp van diamant geklots (polijsten) vellen. </li><li> Sluit de FC / PC connectordeel uit pleister aan op de koppeling van groene lasersysteem en meet de lichtintensiteit van de punt van de optische vezel via digitale optische vermogen en energiemeter. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. PhotothromBotic Infarct maligne en in de interne Capsule <ol><li> Steriliseer alle chirurgische instrumenten en de elektroden met behulp van een geschikte sterilisator (Steam of Plasma sterilisator). Gebruik stoomsterilisator bij 121 ° C en instelling van 30 minuten voor sterilisatie en 30 min voor droge. </li><li> Verdoven het dier (~ 400 g, 11-13 weken) met een mengsel van ketamine hydrochloride (100 mg / kg) en xylazine (7 mg / kg) via een intramusculaire injectie. Controleer de diepte van de anesthesie door poot knijpen. Handhaaf de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C over een verwarmingselement onder het lichaam van het dier. </li><li> Plaats het dier in een stereotactische frame met behulp van een oor bar en mond houder. </li><li> Reinigen en ontsmetten van de chirurgische site met 70% alcohol en povidonjodium oplossing. Infiltreren 2% lidocaïne hydrochloride onder de hoofdhuid in de beoogde schedel incisie gebied om de intra-operatieve pijn te verminderen. Toepassen dierenarts oogzalf om uitdroging van de ogen te voorkomen. </li><li> Breng een steriel laken over de eeniMAL en bloot de operationele sites. Handhaaf alle procedures in steriele omstandigheden. </li><li> Voer een middellijn schedel incisie van 2 cm en trekken de huid bilateraal met draad oprolmechanismen. Droog de schedel met katoen swaps en waterstofperoxide. </li><li> Stel de hoogte van de neus klem totdat de bregma en lambda zijn afgestemd op hetzelfde niveau. Kritische stap: Deze afstemming is essentieel te kunnen benaderen een diepere structuur, zoals het uitvoeren van een infarct laesie in de inwendige capsule hoofdexperiment. </li><li> Maak een gat (diameter: 2 mm; AP: -2,04 vanaf bregma; ML: ± 3,0 vanaf de middellijn) met behulp van een boor om photothrombosis induceren. </li><li> Polijsten en reinigen van de optische vezel tip van de optische interface. Bevestig de ONI de stereotaxisch frame zonder te buigen. Controleer de punt van de ONI en veeg het duidelijk voor en na het inbrengen van de optische interface. </li><li> Meet de laser intensiteit van de punt van de optische vezel voorafgaand aan het inbrengen van de optical interface naar de doelplaats van de rattenhersenen. Stel de laser intensiteit 3,5 mW, zoals bevestigd door pre-operatie stappen aan het uiteinde van de optische vezel. </li><li> Steek de ONI in het doelgebied van de interne capsule (-7,8 mm bevestigd uit de pre-operatie stap) door het boorgat. </li><li> Handhaving van de lichaamstemperatuur bij 37,5 ± 0,5 ° C tijdens photothrombosis. Een lagere lichaamstemperatuur produceert niet de verwachte omvang van infarct. Injecteren Rose Bengal (2 ml / kg) via de staartader. </li><li> Schakel de 532 nm groene laser gedurende 90 sec 1 min na de Bengaals injectie. Na bestraling, de ONI verwijder voorzichtig uit de hersenen. Na het reinigen van de operatieve site, zet de wond zet de wond met 3-0 nylon hechtdraad; laat de rat uit de stereotactische frame en overbrengen naar een herstel kamer. </li><li> Voor de schijn-geopereerde groep (SOG), het uitvoeren van een identieke-laesie maken procedure, met uitzondering van de injectie van zoutoplossing (0,2 ml / 100 g) in plaats van Rose-Bengalen. </li><li>Handhaaf de lichaamstemperatuur (37 ° C) met verwarmingselement na operatie en beheren antibiotica (tweede generatie cefalosporine, 0,1%, 1 ml) via een intramusculaire injectie. Laat de dieren niet onbeheerd achter te laten tot het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Mis postoperatieve dieren niet naar de kooi bezet door andere dieren tot volledig hersteld. OPMERKING: Voorafgaande proef werd uitgevoerd op dezelfde procedures om de optimale lichtintensiteit van 1 mW vinden tot 5 mW en de procedure kan nodig zijn om een ​​bevredigende mate van letsel verwerven andere conditie. </li></ol> 3. Evaluatie van Capsular Infarct maligne <ol><li> Behavioral Testen en Animal Groepering <ol><li> Voer één pellet bereiken taken zoals beschreven door Whishaw et al. 14 om het tekort motor van de voorpoot dagelijks evalueren 1 week na de beroerte modelleren. Voer een enkele pellet bereiken taak(SPRT) bij voedselproducerende dieren beperkt (90% van de controle lichaamsgewicht) met schoon plexiglas (30 x 15 x 35 cm hoogte) met een 1 cm brede sleuf en een voedselplank in de voorzijde van het midden van de voorwand. </li><li> Plaats een pellet op het voedsel plank schuin contralaterale naar de gewenste voorpoot. Dien 20 pellets per sessie voor 3 weken. LET OP: Een succesvolle aantal SPRT wordt gedefinieerd als een bereik waarin het dier grijpt een levensmiddel pellet en zet het in de mond zonder te laten vallen. </li><li> Bereken de score als een percentage geslaagde bereikt, die wordt gedefinieerd door de volgende formule: <img alt="Equation1" src="/files/ftp_upload/53281/53281equation1.jpg" /> LET OP: Wij verdelen dieren in 3 groepen: de schijn-geopereerde groep (SOG), gematigd herstel groep (MRG), en een slechte herstel groep (PRG). Als een post-stroke SPRT score&gt; 50%, classificeren we de ratten als MRG, die de aanwezigheid van een aanzienlijk letsel aangeeft, maar niet volledige vernietiging van de tarGebruik. Als de post-stroke SPRT score &lt;50% in vergelijking met het pre-takt SPRT score, classificeren we de groep als PRG, die een volledige laesie in het doel aangeeft. </li></ol></li><li> Neurohistological Bevestiging van Infarct maligne <ol><li> Voer cardiale perfusie met 4% paraformaldehyde zoals eerder beschreven. Wanneer de hersenen volledig zinkt de 30% sucrose oplossing uitvoeren coronale coupes met een dikte van 10 urn en een interval van 200 pm met behulp van een microtoom of cryotoom 4. </li><li> Vlek met H &amp; E, Nissl, Luxol snel blauw-PAS, Neurofilament proteïne-L of gliale fibrillaire zuur eiwit kleuring en observeer de histologische bevindingen aan de optimale lichtintensiteit die de volle breedte van de interne capsule in het doelgebied om vlekken te observeren kan dekken bepalen 4,17. </li><li> Behulp ImageJ software, meet het volume van het infarct fototrombotisch gebied van de interne capsule op de hersenen dia.<ol><li> Om het volume van infarct gebied te meten, de lancering van de &#39;ImageJ&#39; software. Om de bestanden te openen te stapelen, selecteert u &#39;Image to Stacks&#39; ( &#39;Image&#39; → &#39;Stacks&#39; → &#39;Image to Stacks&#39;). Bewerk de bestandsnaam en selecteer &#39;Zet de schaal&#39; ( &#39;Analyze&#39; → &#39;Zet de schaal&#39;) op schaal bewerken. </li><li> In &#39;Plugins&#39;, selecteer &#39;Measure Stacks&#39; om het volume of het gebied van foto&#39;s te berekenen. Steek de afstand interval van 2 beelden in &#39;Slice Spacing&#39;. Maak een tekening van de ROI (Region Of Interest) van alle beelden en klik op &#39;Measure&#39;. LET OP: De software &#39;ImageJ&#39; berekent automatisch het gebied en het volume van elk beeld en het totale volume van hen. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2012+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2012 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 125, 2-220 (2012).</li>
<li>Debette, S., Markus, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+importance+of+white+matter+hyperintensities+on+brain+magnetic+resonance+imaging%3A+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bmj%22%5BJournal%5D)">The clinical importance of white matter hyperintensities on brain magnetic resonance imaging: systematic review and meta-analysis.</a> Bmj. 341, 3666(2010).</li>
<li>Zhang, K., Sejnowski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+scaling+law+between+gray+matter+and+white+matter+of+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A universal scaling law between gray matter and white matter of cerebral cortex.</a> PNAS. 97 (10), 5621-5626 (2000).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+photothrombotic+capsular+infarct+with+a+marked+motor+deficit%3A+a+behavioral%2C+histologic%2C+and+microPET+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">A rat model of photothrombotic capsular infarct with a marked motor deficit: a behavioral, histologic, and microPET study.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (4), 683-689 (2014).</li>
<li>Kleim, J. A., Boychuk, J. A., Adkins, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+models+of+upper+extremity+impairment+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Rat models of upper extremity impairment in stroke.</a> ILAR J. 48 (4), 374-384 (2007).</li>
<li>Frost, S. B., Barbay, S., Mumert, M. L., Stowe, A. M., Nudo, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+model+of+capsular+infarct%3A+endothelin-1+injections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">An animal model of capsular infarct: endothelin-1 injections in the rat.</a> Behav Brain Res. 169 (2), 206-211 (2006).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+the+anterior+choroidal+artery+territory+in+rats+using+intraluminal+occluding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Definition of the anterior choroidal artery territory in rats using intraluminal occluding technique.</a> J Neurol Sci. 182 (1), 16-28 (2000).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+model+of+lacunar+infarction+in+the+gyrencephalic+brain+of+the+miniature+pig%3A+neurological+assessment+and+histological%2C+immunohistochemical%2C+and+physiological+evaluation+of+dynamic+corticospinal+tract+deformation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental model of lacunar infarction in the gyrencephalic brain of the miniature pig: neurological assessment and histological, immunohistochemical, and physiological evaluation of dynamic corticospinal tract deformation.</a> Stroke. 39 (1), 205-212 (2008).</li>
<li>Shibata, M., Ohtani, R., Ihara, M., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+matter+lesions+and+glial+activation+in+a+novel+mouse+model+of+chronic+cerebral+hypoperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">White matter lesions and glial activation in a novel mouse model of chronic cerebral hypoperfusion.</a> Stroke. 35 (11), 2598-2603 (2004).</li>
<li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Ann Neurol. 17 (5), 497-504 (1985).</li>
<li>Kuroiwa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rat+model+of+photothrombotic+ischemia+and+infarction+within+the+caudoputamen%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen.</a> Stroke. 40 (1), 248-253 (2009).</li>
<li>Bashkatov, A. N., Genina, E. A., Tuchin, V. V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBashkatov%2C+AN+%22Handbook+of+biomedical+optics%22">Handbook of biomedical optics</a>. 83, CRC Press. Boca Raton, Fl. (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).</li>
<li>Whishaw, I. Q., Whishaw, P., Gorny, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+skilled+forelimb+reaching+in+the+rat%3A+a+movement+rating+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The structure of skilled forelimb reaching in the rat: a movement rating scale.</a> J Vis Exp. (18), e816(2008).</li>
<li>Jang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+corticospinal+tract+location+at+corona+radiata+and+posterior+limb+of+the+internal+capsule+in+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRehabilitation%22%5BJournal%5D)">A review of corticospinal tract location at corona radiata and posterior limb of the internal capsule in human brain.</a> NeuroRehabilitation. 24 (3), 279-283 (2009).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+changes+in+resting-state+brain+activity+in+a+capsular+infarct+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Longitudinal changes in resting-state brain activity in a capsular infarct model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (1), 11-119 (2014).</li>
<li>Blasi, F., Whalen, M. J., Ayata, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lasting+pure-motor+deficits+after+focal+posterior+internal+capsule+white-matter+infarcts+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Lasting pure-motor deficits after focal posterior internal capsule white-matter infarcts in rats.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 35 (6), 977-984 (2015).</li>
<li>Metz, G. A., Antonow-Schlorke, I., Witte, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+improvements+after+focal+cortical+ischemia+in+adult+rats+are+mediated+by+compensatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+brain+research%22%5BJournal%5D)">Motor improvements after focal cortical ischemia in adult rats are mediated by compensatory mechanisms.</a> Behavioural brain research. 162 (1), 71-82 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het kapsel infarct hier gepresenteerde model toont een gerichte laesie met uitgesproken en aanhoudende motorische stoornis in voorpoot functie. Voorgaande modellen van subcorticale kapselvorming beroerte hebben een onvoldoende mate van motorische stoornissen en een snel herstel proces 6,8,9 aangetoond. In deze zin is dit model lijkt op de klinische capsulaire infarct gevallen die langdurige functionele beschadiging vertonen. De meest kritische stappen in het ontwikkelen van een om...

Tot voor kort was de &quot;grijze stof beroerte (GMS) modellen&quot; zijn uitsluitend gebruikt om de pathofysiologie van beroerte te begrijpen en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen leiden. 25% van alle beroertes 1,2 - Er is echter een toenemende prevalentie van beroerte die subcorticale witte stof van invloed op bij oudere personen, waarvan 15 vormt geweest. Talrijke studies zijn uitgevoerd met betrekking tot een beroerte met behulp van GMS-modellen, terwijl er weinig studies die witte stof beroerte (WMS) modellen hebben gebruikt. Witte stof bij knaagdieren is aanzienlijk minder dan de witte stof bij mensen of primaten. Bijgevolg is het moeilijker om selectief te openen en te vernietigen de doelgebieden in de witte stof 3. Bovendien zijn er geen efficiënte instrumenten ontwikkeld tot op heden om selectief vernietigen van de geplande omvang van gerichte witte stof. Daarom is er een gebrek aan geschikte modellen voor studie van witte stof slagen geweest. Animal stroke modellen worden vaak gebruikt om de voortgang van motorisch herstel voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische werkwijzen en revalidatie controleren. Het is ideaal om een diermodel dat een langdurige neurologische uitval overeenstemmend met de anatomische veranderingen aangetoond in menselijke beroerte 4,5 vertoont gebruiken. In dit verband kan snel herstel van het tekort op de motor en brede betrokkenheid van de hersenen na infarct laesie niet realistisch in het nastreven van een beroerte onderzoek. Previous capsulaire infarct modellen zijn door de occlusie van de arteria carotis interna of anterior choroïdale bloedvaten en verspreiding van endotheline-1 (ET-1) in de capsula interna 6-9. Toch slagader occlusie vereist een zorgvuldige dissectie van de slagaders, maar het produceert een breed gebied van infarct letsel, met inbegrip van de interne capsule, zonder blijvende gedrags tekorten. Bovendien, ET-1 was niet diffuus om het achterste been van de interne capsule volledig te vernietigen, en dus minder uitgesproken of aanhoudende behavioral tekort. Een fototrombotisch infarct model is op grote schaal gebruikt om verschillende soorten infarct laesies in de cortex en subcorticale structuren 10 genereren. De techniek omvat intraveneuze toediening gevolgd door focale belichting, wat leidt tot bloedplaatjesaggregatie in de kleine bloedvaten en de vorming van laesies 10 infarct. Fototrombotisch techniek is uitgebreid gebruikt om GMS laesies te creëren, terwijl het is zelden gebruikt voor WMS laesies 5,11 te genereren. Voor deze techniek is een combinatie Bengaals rood en lichtbestraling aangetoond bruikbaar zijn bij de vernietiging van de doelstructuur worden, waardoor overeenkomstige functionele gebreken. Het belangrijkste element van de fototrombotisch techniek bestraling met licht, omdat het de grootte van infarct laesies bepaalt. Bestraling met licht leidt tot verschillende effecten op grijze en witte stof, vanwege de verstrooiing van het licht is meer dan 4 keer hoger in wit matter vergelijking met grijze stof 12; Dienovereenkomstig, als de lichtintensiteit een voldoende lage straling (&lt;1140 mW / mm 2), kan men de uitbreiding te beperken tot die fototrombotisch laesie van invloed op de mate van de witte stof (bijv., Interne capsule). Bijvoorbeeld, kan het licht van de hogere energie infarcten zowel in grijze en witte stof te induceren, maar lagere energie licht mag photothrombosis veroorzaken alleen in witte stof. Bovendien is de penetratie van lichtenergie zeer beperkt. Ongeveer 99% van de lichtenergie verloren dan 1 mm vanaf de lichtbron 13. Daarom wordt verwacht dat nauwkeurig gerichte, onderste energy light induceert photothrombosis alleen in de witte stof met een minimale aantasting van de aangrenzende grijze stof. Hier beschrijven we een nieuwe methode om infarct laesies in de voorpoot gebied van de interne capsule bij knaagdieren. We beschrijven de werkwijze voor identificatie van de voorpoot in de interne capsule, de technologie van lichtbestraling, zoals de aanpassing en toediening van licht, en het genereren van een infarct laesie. We beschrijven ook gedragstesten gebruikt om de volledigheid van de capsulaire modelleren evalueren.

<table><tbody><tr><td>DC Temperatuurregelaar</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC.</td><td>ATC1000</td><td></td></tr><tr><td>Digitale Stereotaxische Instrumenten</td><td>STOELTING CO.</td><td>51900</td><td></td></tr><tr><td>Elektrische Stimulator</td><td>CyberMedic Corp.</td><td>EMGFES 2000</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy&nbsp;</td><td>Precision Fiber Products, INC.</td><td>PFP-353ND1</td><td>Mengverhouding: 10(A):1(B-hardener) per gewicht&nbsp; Uithardingsschema: 1 min @150 &deg;C 2 ~ 5 min @120 &deg;C 5 ~ 10 min @100 &deg;C 15 ~ 30 min @80 &deg;C</td></tr><tr><td>Fiber Optic Scribe&nbsp;</td><td>THORLABS, INC</td><td>S90R</td><td></td></tr><tr><td>Fiber patchkabel</td><td>KOREA OPTRON Corp.</td><td></td><td>Buitendiameter: 3 mm &Oslash;200 &micro;m 0.39 NA FC/PC-FC/PC 1 m</td></tr><tr><td>Laservoeding</td><td>CHANGCHUN NEW INDUSTRIES OPTOELECTRONICS TECH. CO., LTD.</td><td>MGL-FN-532nm-200mW-14010196</td><td></td></tr><tr><td>Crimp ring&nbsp;</td><td>DAWOOTECH CO.,LTD.</td><td></td><td>Lengte: 19 mm Binnendiameter: 3 mm Buitendiameter: 3.8 mm Materiaal: SUS</td></tr><tr><td>Micro4-micro spuitpompcontroller</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>95100</td><td></td></tr><tr><td>Optische Vermogensmeter</td><td>THOLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Diamant polijstblad</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF3D</td><td>Korrel: 3 &micro;m</td></tr><tr><td>Diamant polijstblad</td><td>THORLABS, INC</td><td>LF6D</td><td>Korrel: 6 &micro;m</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>SIGMA-ALDRICH CO. LLC.</td><td>330000</td><td></td></tr><tr><td>Naald voor spinale anesthesie met potloodpunt (Spinale naald)&nbsp;</td><td>B.BRAUN MELSUNGEN AG&nbsp;</td><td>4502027</td><td>Maat: 27 G Lengte: 88 mm Naald: 0.40 mm</td></tr><tr><td>Waterdichte schuurpapier&nbsp;</td><td>DEERFOS CO.,LTD</td><td>CC261</td><td>Korrel: 1.000 &micro;m</td></tr><tr><td>Nanofil 10&nbsp;&micro;l spuit</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil 33&nbsp;G BVLD-naald</td><td>WORLD PRECISION INSTRUMENTS, INC</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>AAV-GFP-virus</td><td>UNC Vector Core</td><td>AAV2-CamKIIa-eYFP</td><td>2 x 1012 virusmoleculen/ml</td></tr><tr><td>Anti-Groen Fluorescent Proteïne, Konijn IgG-fractie</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11122</td><td>primair antilichaam (1:200)</td></tr><tr><td>Gentiaan Anti-Konijn IgG (H + L)</td><td>Life Technologies, INC</td><td>A11034</td><td>secundair antilichaam (1:500)</td></tr><tr><td>Ceftezole</td><td>GUJU Pharma CO.,LTD.</td><td>A27802741</td><td>0.1%, 1 ml</td></tr><tr><td>Lidocaïne hydrochloride injectie</td><td>JEIL PHARMACEUTICAL CO.,LTD.</td><td>A04900271</td><td>2%, 1 ml</td></tr><tr><td>Handstukboor</td><td>Seshin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitaal optisch vermogen en energiemeter</td><td>THORLABS, INC</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>UNIBIOTech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

omgeschreven capsular infarct modeling met behulp van een fototrombotisch techniek

Circumscribed Capsular Infarct Modeling Using a Photothrombotic Technique

De recente toename in de prevalentie van witte stof-beroerte vereist specifiek onderzoek op dit gebied. Echter, het ontbreken van een relevant diermodel voor witte stof-beroerte heeft onderzoeksonderzoeken belemmerd. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor het creëren van een beperkte capsulaire infarct die schade aan aangrenzende grijze stofstructuren minimaliseert. We gebruikten pre-operatieve neurale tracering met adeno-geassocieerd virus-groen fluorescent eiwit (AAV-GFP) om de somatotopische organisatie van het voorpootgebied binnen de interne capsule te identificeren. De aanpassing van de lichtintensiteit op basis van verschillende optische eigenschappen van grijze en witte stof draagt bij aan de selectieve vernietiging van witte stof met relatieve behoud van grijze stof. Nauwkeurige positionering van de optisch-neurale interface maakt vernietiging van het gehele voorpootgebied in de interne capsule mogelijk, wat leidt tot een duidelijk en aanhoudend motorisch deficit. Dus, deze techniek produceert zeer reproduceerbare capsulaire infarct-laesies met een aanhoudend motorisch deficit. Het model zal niet alleen nuttig zijn om witte stof-beroerte (WMS) te bestuderen op gedrags-, circuit- en cellulair niveau, maar ook om de bruikbaarheid ervan te beoordelen voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische en revalidatie-interventies.

De hier gepresenteerde methode is bedoeld om een ​​omschreven kapsel infarct met een aanhoudend tekort op de motor te creëren. Daarom is het essentieel om het doel correct te bepalen binnen de interne capsule pre-operatie stap. De somatotopic in kaart brengen van piramidale vezels in de interne capsule is niet geregeld tot op heden. Om het doel correct te identificeren binnen de interne capsule, moet de voorpoot gebied worden afgebakend. Een injectie van AAV-GFP in de voorpoot gebied van...

Dit manuscript beschrijft een modellering techniek van kapselvorming infarct. Hier hebben we gebruik gemaakt van een gemodificeerde fototrombotisch techniek met een lage intensiteit van het licht na de pre-operatie doel mapping. Met behulp van deze techniek, hebben we een omgeschreven kapselvorming infarct model met aanhoudende motorische handicap.

Omgeschreven Capsular Infarct Modeling Met behulp van een fototrombotisch Techniek

Recent increase in the prevalence rate of white matter stroke demands specific research in the field. However, the lack of a pertinent animal model for ...

Het algemene doel van deze techniek is om een afgebakend capsulair infarctmodel met een blijvende motorische stoornis te creëren met behulp van een fototrombotische techniek. Voordat het capsulaire infarct wordt opgewekt, is het noodzakelijk om het gebied van de voorpoten in de capsula interna te identificeren door een adeno-geassocieerd virus dat GFP tot expressie brengt in het gebied van de voorpoten van de motorische cortex te introduceren. Begin met het plaatsen van een geanestheseerde rat in een stereotaxisch frame.Scheren vervolgens de kop van de rat en steriliseer de hoofdhuid met 70% alcohol en een povidon-jodiumoplossing. Injecteer 2% lidocaïne hydrochloride onder de hoofdhuid in het gebied van de beoogde incisie om intraoperatieve pijn te verminderen. Breng oogsalf aan om uitdroging van de ogen te voorkomen.Plaats vervolgens een steriel afdekdoek over het dier. Maak een midline incisie van twee centimeter in de hoofdhuid en positioneer de stereotaxische arm om het gebied van de voorpoten in de motorische cortex te identificeren aan de hand van de stereotaxische coördinaten. Boor op deze positie een toegangsgat.Verplaats de naald naar het geboorde gat en voer de naald één millimeter door de dura en in de motorische cortex in. Gebruik een precisie-micropomp om langzaam één microliter virus te injecteren. Laat de naald nog 10 minuten op zijn plaats zitten om terugstroom via het naaldtraject te voorkomen.Zodra er 10 minuten zijn verstreken, wordt de naald langzaam teruggetrokken. Na het reinigen van de operatieplaats met spoeling met zoutoplossing, wordt de wond gesloten met 3-0 nylon hechtdraad. Laat de rat vervolgens vrij uit het stereotaxische frame en verplaats deze naar een herstelkamer voor monitoring.Dien een analgeticum toe voor postoperatieve pijnbestrijding. Offer de rat na twee tot drie weken op volgens goedgekeurde methoden en maak coupes van de cryoprotecte hersenen. Observeer na kleuring voor GFP de AAV-GFP-getransduceerde axonen in de capsula interna met een fluorescentiemicroscoop.Vergelijk de locaties van de getransduceerde axonen, zoals te zien op de fluorescentieafbeelding, met de rattenhersenenatlas om de stereotaxische coördinaten van de getransduceerde axonen nauwkeurig te bepalen. Gebruik ter voorbereiding van de optische neurale interface eerst een snijboor om ongeveer vier centimeter van een 27 gauge spinale naald met een stylet erin door te snijden. Strip vervolgens 10 centimeter van de mantel van een optische vezel.Plaats het ongeïsoleerde deel van de optische vezel in een metalen buis. Klem de buis vervolgens rond de vezel. Gebruik daarna een pers om het onderste halve deel van de metalen buis twee keer plat te klemmen.De metalen buis vult de ruimte tussen de optische vezel en de hub van de spinale naald. Breng hitteuithardende epoxy aan op de optische vezel. Breng extra epoxy aan in de lege ruimte in de hub.En voeg de optische vezel in de spinalnaald in. Laat de epoxy 20 minuten uitharden bij 100 °C voor een stabiele fixatie. Zodra de epoxy is uitgehard, wordt de optische vezel die uit de spinalnaald steekt doorgeknipt, waarna diamant-polijlbladen worden gebruikt om de optische vezel aan de punt van de spinalnaald te polijsten.Verbind tot slot het FCPC-connectorgedeelte van de patchkabel met de koppelaar van het groene lasersysteem. Gebruik vervolgens een digitale optische vermogens- en energiemeter om de lichtintensiteit aan de punt van de optische vezel te meten, om een nauwkeurige lichtemissie te garanderen. Plaats een warmtemat onder het lichaam van het dier om de lichaamstemperatuur gedurende de operatie op 37.5 °C te houden.Begin met het anesthetiseren en voorbereiden van de rat voor de chirurgische ingreep zoals voorheen. Maak na het maken van een mediane incisie van twee centimeter de hoogte van de neusklem aan tot de Bregma en Lambda op hetzelfde niveau zijn uitgelijnd. De juiste uitlijning is cruciaal om de capsula interna correct te targeten.Positioneer de stereotaxische arm om de locatie voor fototrombose te bepalen. Boor vervolgens een gat van twee millimeter op dit punt. Polijst en reinig daarna de tip van de optische vezel van de ONI en bevestig deze zonder buiging aan het stereotaxische frame.Controleer de punt van de ONI om er zeker van te zijn dat deze schoon en intact is. Meet de laserintensiteit aan de punt van de optische vezel voordat de optische interface in de doelsite van de rattenhersenen wordt ingebracht. Stel de laserintensiteit in op 3,5 milliwatts aan de punt van de optische vezel.Laat de ONI nu zakken naar het doelgebied van de capsula interna met behulp van de dorsoventrale coördinaat die in het eerste gedeelte van het protocol is bepaald. Injecteer vervolgens twee milligram per kilogram Rose Bengal via de staartvene en start daarna een aftelklok die is ingesteld op één minuut. Wanneer de minuut is verstreken, schakelt u de 532 nano-meter groene laser gedurende 90 seconden in om het infarct te creëren.Verwijder na de bestraling voorzichtig de ONI uit de hersenen. Nadat de operatieplaats is gereinigd, wordt de wond gesloten met een 3-0 nylon hechting. Verwijder vervolgens de rat uit het stereotaxische frame en breng deze over naar een herstelkamer.Deze afbeelding toont de omvang van infarctlaesies bij verschillende laserlichtintensiteiten van twee milliwatt tot vijf milliwatt, twee weken na fototrombotische laesievorming. De pijlen geven de infarctlaesie aan. In deze experimentele opstelling wordt de optische lichtintensiteit beschouwd als zijnde tussen de drie milliwatt en vier milliwatt.De volgende twee afbeeldingen tonen het microscopische aspect van het capsulaire infarct drie weken na fototrombose. In deze coronale doorsnede van de rattenhersenen geven de pijlpunten het traject aan van de naald met de optische vezel in de thalamus en tot aan de capsula interna. Deze opeenvolgende, gekleurde coupes tonen de omvang van de infarctlaesie in de capsula interna.De pijlen geven de infarctlaesie aan.

circumscribed-capsular-infarct-modeling-using-photothrombotic

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates the procedure to generate photothrombotic stroke in a mouse model by laser illumination of an intact skull following administration of photosensitive dye.

Modeling Photothrombotic Stroke in Mouse Model: A Laser Illumination Technique Through Mouse Skull Following Photosensitive Dye Administration to Induce Photothrombosis

Photothrombosis is een snelle, minimaal-invasieve techniek voor het induceren van kleine en goed afgebakende infarct in gebieden die van belang zijn in zeer reproduceerbare wijze. Het is bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.

Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies

Hier beschrijven we een semi-invasieve optische microscopiebenadering voor het induceren van een Rose Bengal fototrombotrotisch stolsel in de somatosensorische cortex van een muis in vivo. De technische aspecten van de beeldvormingsprocedure worden beschreven, van de inductie van een fototrombotrotisch evenement tot de toepassing en gegevensverzameling.

Rose Bengal Photothrombosis door confocale Optical Imaging<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Single Vessel Stroke

Fototrombose is een minimaal invasieve en zeer reproduceerbare procedure om focale ischemie in het ruggenmerg te induceren en dient als een model voor ruggenmergletsel bij muizen.

Photothrombosis-geïnduceerde focale ischemie als een model van Spinal Cord Injury in Muizen

Dit protocol beschrijft de toepassing van gecombineerde nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) beeldvorming en micro-computertomografie (microCT) voor het visualiseren van cerebrale thromboemboli. Deze techniek maakt de kwantificering van trombus last en evolutie. De NIRF beeldvormende techniek visualiseert fluorescent gelabelde trombus in weggesneden hersenen, terwijl de microCT techniek visualiseert trombus in levende dieren met behulp van goud-nanodeeltjes.

Gecombineerde nabij-infrarood Fluorescent Imaging en Micro-computertomografie voor het direct visualiseren Cerebral Thromboemboli

Beroerte is een wereldwijd probleem met minimale behandelingsopties en geen huidige klinische therapie voor het regenereren van het verloren hersenweefsel. Hier beschrijven we methoden voor het creëren van een nauwkeurige fototrombotische beroerte in de motorische cortex van knaagdieren en daaropvolgende injectie van hydrogel-biomaterialen om hun effecten op weefselregeneratie na een beroerte te bestuderen.

Injectie van Hydrogel Biomaterial Steigers naar de hersenen na een beroerte

Traditionele modellen met fototrombotische beroerte (PTS) induceren voornamelijk dichte bloedplaatjesaggregaten met een hoge weerstand tegen weefselplasminogeenactivator (tPA)-lytische behandeling. Hier wordt een gemodificeerd muizen PTS-model geïntroduceerd door trombine en lichtgevoelige kleurstof samen te injecteren voor fotoactivering. Het trombine-versterkte PTS-model produceert gemengde bloedplaatjes:fibrinestolsels en is zeer gevoelig voor tPA-trombolyse.

Een fibrine-verrijkt en tPA-gevoelig fototrombotisch beroertemodel

Hier beschreven is het fototrombotische beroertemodel, waarbij een beroerte wordt geproduceerd door de intacte schedel door permanente microvasculaire occlusie op te wekken met behulp van laserverlichting na toediening van een lichtgevoelige kleurstof.

Modelleerslag bij muizen: focale corticale laesies door fototrombose

Met behulp van een volledig optische benadering wordt een ischemische beroerte geïnduceerd terwijl tegelijkertijd neuronaleCa 2+ -activiteit wordt geregistreerd met behulp van een fluorescerende biosensor in de opkomende beroertekern van een wakkere, zich gedragende muis.

Gelijktijdige fototrombose en vezelfotometrie om ischemische beroerte te induceren en te bewaken bij zich gedragende muizen

Dit protocol biedt een geïntegreerde methode die virale aflevering, implantatie van optroden, fototrombotische inductie, gelijktijdige registratie van astrocyten- en neuronale activiteit, en optogenetische stimulatie van astrocyten omvat. Deze geïntegreerde methode heeft als doel gelijktijdig onderzoek te bieden naar de relatie tussen astrocyten en neuronen over de acute tot chronische stadia van ischemische beroerte.

Een geïntegreerde methode voor fototrombotische beroertemodellering en in vivo optroderegistratie van neuronale en astrocytische activiteit bij zich gedragende muizen

Leer een fototrombotische techniek om een capsulair infarctmodel met aanhoudende motorische beperking te creëren bij ratten. Deze methode maakt nauwkeurige targeting van de interne capsule mogelijk voor neurowetenschappelijk onderzoek.

Omgeschreven Capsular Infarct Modeling Met behulp van een fototrombotisch Techniek

Meer video's verkennen