Aardmagneetveld (Gmf) en Plant Evolutie: Onderzoek naar de effecten van Gmf Reversal op

Het algemene doel van deze procedure is om de omkering van het geomagnetisch veld (GMF) te produceren met behulp van Helmholtz-spoelen die worden aangestuurd door een voeding. Uiteindelijk wordt aangetoond dat de omkering van het GMF de morfologie en genexpressie van planten beïnvloedt. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de plantevolutie, zoals de vraag of de omkering van het aardmagnetisch veld een rol heeft gespeeld in de evolutie en adaptatie van planten.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden gebruikt om te testen op potentiële biologische effecten van zwakke magnetische velden in een eenvoudig modelorganisme dat met veel replica's kan worden gekweekt, allemaal onder nauwkeurig gecontroleerde omstandigheden. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Alberto Bocco en een begeleide student uit mijn laboratorium, en ook door Kiara aa. Zij is een PhD-student in mijn laboratorium en CIA Bertea, die een associate professor is in mijn groep.

Begin met het inschakelen van de drie DC-voedingen die zijn aangesloten op de drie paren Helmholtzkspoelen, en schakel de drie-assige magnetometer in waarvan de probe in de triaxiale spoelen is geplaatst. Start de computer op en open de magnetometer-software waarmee gegevens van de drie-assige magnetometer kunnen worden verzameld. De voedingen zijn voor de besturing tevens via een A-G-P-I-B-verbinding aangesloten op een computer.

Stel de spanningen van de voedingen in om het gewenste magnetische veld te genereren met een omgekeerde magnetische veldvector, zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de zaden van Arabidopsis Aliana ecotype Columbia, zero in een 1,5 milliliter buisje, gesteriliseerd door behandeling met een calciumhypochlorietoplossing gedurende 10 tot 12 minuten bij 25 tot 28 °C met continu schudden. Spoel de zaden vervolgens twee keer af met 80% ethanol, gevolgd door een wasbeurt met honderd procent ethanol.

En tot slot een spoeling met steriel gedestilleerd water. Bereid één liter Murrah Shiga en SCOG gemodificeerd medium voor zoals beschreven in het tekstprotocol vóór de stolling. Giet 80 milliliter medium in elke vierkante Petrischaal, voor 30 steriele zaden per schaal.

Zegel de platen vervolgens af met een wasfolie. Vernaliseer de platen horizontaal in het donker bij vier graden Celsius gedurende twee dagen om de kieming te potentieëren en te synchroniseren. Bereid de natriumdamplampen voor door de spotlamp te bedekken met een blauwe gelatinefolie om het rode component van de lampen na de vernalisatie te verminderen.

Bereid de Petri-schalen voor voor blootstelling aan ofwel een normale of een omgekeerde GMF. Stel de zaden bloot in een klimaatgecontroleerde omgeving bij 22 °C in een verticale positie. Voer parallelle experimenten uit, zowel buiten als binnen de triaxiale spoelen.

Onder een fotoperiode van acht uur duisternis en 16 uur licht. Maak na de blootstelling foto's van de Petrischalen om de wortellengte en het bladoppervlak te berekenen. Meet eerst de zijde van de Petrischaal.

Open vervolgens de afbeelding van de Petrischaal in de ImageJ-software en gebruik de optie 'straight line' om een lijn te trekken die precies de zijkant van de schaal kruist. Selecteer in het menu 'analyze' de optie 'set scale' en voer de werkelijke afstand in het vak 'known distance' in. Voer daarna de lengte-eenheid in.

Klik ten slotte op de globale optie om de instellingen beschikbaar te maken voor alle metingen van de wortellengte. Volg zorgvuldig de vorm van de wortel met behulp van de freehand-tool. Meet de lengte door de meetoptie in het analysemenu te gebruiken.

Ga verder met het meten van alle wortels in de afbeelding en sla het bestand op voor verdere statistische analyse. Gebruik voor het bladoppervlak in het afbeeldingsmenu de optie 'adjust', gevolgd door 'color threshold', selecteer het individuele blad, en selecteer in het analysemenu 'analyze particles'; sla de individuele metingen op voor statistische analyse. Verzamel afzonderlijk 30 scheuten en 30 wortels en vries deze onmiddellijk in vloeibare stikstof in.

Maal het daarna in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper voordat het totaal RNA wordt geïsoleerd zoals beschreven in het tekstprotocol. Voer alle experimenten uit op een real-time systeem met cyber green one en ROX als interne ladingsstandaard. Voer de reactie uit met een mengsel van 25 µL. Gebruik de primers die in het tekstprotocol worden vermeld en neem controles zonder reverse transcriptie mee om genomische DNA-contaminatie te monitoren, evenals controles zonder template. Lees de fluorescentie na elke annealing- en extensiefase af.

De twee vergrootglazen representeren de verzamelde gegevens, waaronder annealing- en dissociatiecurves. Navigeer naar het analyse- en instelscherm en zorg ervoor dat de dataset die tijdens het dissociatiesegment van het experiment is verzameld, is geselecteerd. Voer voor de analyse van alle runs een smeltcurve-analyse uit van 55 tot 95 °C door het dissociatiesegment in het thermische profiel op te nemen.

Gebruik het scherm voor de dissociatiecurve via het tabblad resultaten om het dissociatieprofiel te bekijken. Analyseer alle amplificatieplots met de software van het real-time PCR-instrument.

Om CT-waarden te verkrijgen, moeten de relatieve RNA-niveaus worden gekalibreerd en genormaliseerd aan de hand van het niveau van de beste housekeeping-genen. Ga naar het scherm met de amplificatieplots via het tabblad resultaten. Selecteer de ramp of het plateau waarvan de gegevens geanalyseerd moeten worden via het scherm voor analyse, selectie en instellingen.

Select vervolgens de baseline-gecorrigeerde genormaliseerde fluorescentie uit het fluorescentiemenu op het bedieningspaneel. Open het scherm met monsterwaarden van de plaat via het tabblad resultaten om de CT-waarden van de geselecteerde wells weer te geven.

Gebruik vier verschillende referentiegenen om de resultaten van de real-time PCR te normaliseren. Selecteer het hoogst gerangschikte gen met behulp van de analysesoftware en gebruik het meest stabiele gen voor de normalisatie. Organiseer de inputgegevens kort in een Excel-blad waarbij de eerste kolom de gennamen bevat en de eerste rij de namen van de monsters.

Select vervolgens de analysesoftware in de menubalk. Gebruik het dialoogvenster om de inputgegevens te selecteren. Vink daarna de velden voor monsternamen, gennamen en enkel eenvoudige output aan.

Klik op de go-knop om de analyse uit te voeren; selecteer het gen met de hoogste ranking als het kandidaatgen dat het meest stabiel tot expressie komt. Na 10 dagen blootstelling vertonen controleplanten een significant grotere wortellengte en meer uitgebreide deelblaadjes in vergelijking met planten die gedurende 10 dagen werden blootgesteld aan omgekeerde GMF-omstandigheden. Het effect van de omkering van de GMF was een drastische verandering in de genexpressie van alle geteste genen, waaronder crucifer in three copper transport protein one en redox responsive transcription factor one; balken geven de standaardfout aan en asterisken duiden op significante verschillen tussen planten die werden blootgesteld aan omgekeerde en normale GMF-omstandigheden.

Het effect van de omkering van het GMF veroorzaakte geen significante veranderingen in de genexpressie van de scheut. Er werd echter een drastische neerwaartse regulatie waargenomen in de genexpressie van de wortels van de gekweekte planten. Onder omgekeerde GMF-condities omvatten deze genen thal, aate peroxidase, aate peroxidase, één ijzer-superoxidedismutase, één N-A-D-P-H, respiratory burst oxidase-proteïne en katalase drie.

Zodra men deze techniek beheerst, kan de uitvoering variëren van enkele minuten tot meerdere dagen, afhankelijk van het vereiste experiment, mits deze correct wordt uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed beeld moeten hebben van hoe u het geomagnetisch veld kunt omkeren of wijzigen en hoe u morfologische en genetische studies uitvoert op de blootgestelde planten. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om alle bronnen van magnetische velden te verwijderen uit het gebied dat wordt omringd door de helmspoelen.

Het is belangrijk dat de helmspoelen en hun generatoren geen warmte of trillingen produceren. De onderzoeker moet geblindeerd blijven voor de conditie van de blootstelling aan het magnetische veld totdat de definitieve gegevens zijn geregistreerd. Deze techniek heeft onderzoekers op het gebied van magnetoreceptie in staat gesteld om het effect van magnetische velden op de evolutie van planten, diergedrag en navigatie, en op menselijke cellijnen te onderzoeken.

In de toekomst hopen we soortgelijke studies in microzwaartekracht uit te voeren om te evalueren hoe de wijziging van het magnetisch veld onder ruimtecondities de plantengroei zal beïnvloeden. Er wordt aangenomen dat het werken met systemen die zwakke magnetische velden genereren niet gevaarlijk is. U dient echter de normale voorzorgsmaatregelen te treffen en het advies van een bekwame elektricien in te winnen voordat u werkt met apparatuur zoals de voedingen voor de helmholtz-spoelenparen.