Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma
15 januari 2016
GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.
Het algemene doel van dit protocol is om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van tumorcel- en intracranieel tumorgroei door middel van in vivo bioluminescentie beeldvorming om de bruikbaarheid van luciferase modificatie van GL261 muis tumorcellen te verifiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de studie van tumor immunologie en immunotherapeutische benadering. Bijvoorbeeld of de stress modificatie de GL261 celproliferatie beïnvloedt en in vivo groeit.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat luciferase modificatie van GL261 tumorcellen niet-invasieve monitoring van hun groei en reactie op behandeling in situ mogelijk maakt. Wanneer de GL261 luciferase celcultuur 70% confluency bereikt in een T75 flacon, verzamel de cellen door trypsinisatie. Tel de cellen en breng ze vervolgens over naar een 24-well plaat met gradiënt dichtheden.
Na drie uur in een celcultuur incubator, open de bioluminescentie beeldvorming software en initialiseer het beeldvormingssysteem. Wanneer de camera is afgekoeld tot min 90 graden Celsius, stel de beeldvormingssoftware in op Luminescent met een belichtingstijd van 10 seconden en een Medium Binning. Bewerk vervolgens de cellen in 25 microliter luciferine per put gedurende één minuut bij kamertemperatuur en plaats de plaat op de beeldvormingsstation.
Selecteer Acquire om de beeldvorming te starten. Wanneer er een afbeelding is verkregen, verschijnen er een afbeeldingsvenster en gereedschapspaletten. Klik op de Regions of Interest Tools en selecteer 6 bij 4 van het spleetpictogram.
Bedek het gebied van het signaal met 6 bij 4 spleetjes, en selecteer het potloodpictogram op het metingen tab. Er verschijnt een venster met een tabel van regio van interesse metingen als eenheden van fotonen per seconde per steradian per vierkante centimeter. Om een in vitro proliferatie assay uit te voeren, verzamel de celculturen zoals net gedemonstreerd wanneer ze 70% confluency bereiken.
En gebruik een multikanaals pipet om de tumorcellen in 20 putten te plaatsen van elk een 96-well plaat bij 1,5 keer 10 tot de 3de cellen per 80 microliters van RPMI medium per put. Om de verdamping van de celculturen te beperken, vul de omringende lege putten met 100 microliters van vers RPMI medium. Vervolgens, om de cellulaire proliferatie te beoordelen, voeg 20 microliters MTS reagens toe aan elke put met cellen.
En incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na drie uur, gebruik een microplaatlezer om de absorptie bij 490 nanometer te meten. Om de absorptiewaarden te normaliseren, deel de waarden van elke dag door de bijbehorende waarden die op dag een zijn verkregen.
Op de dag van implantatie, schors een keer 10 tot de 5de cellen per microliter in HBSS zonder calcium en magnesium van een 70%confluente tumorcelcultuur. Vervolgens, na het bevestigen van het juiste niveau van sedatie door teen knijpen, scheer de bovenkant van het hoofd van elk experimenteel dier. Gebruik een katoenen punt applicator om elke schedel schoon te maken met 2% chloorhexidine.
Vervolgens breng smeermiddel aan op de ogen van elke muis. Gebruik nu een steriele scalpel om een sagittale incisie van ongeveer 1 centimeter lang te maken over het pariëto-occipitale bot van het eerste dier. En maak de schedeloppervlakte opnieuw schoon met 3% waterstofperoxide, waarbij de duidelijke bregma wordt opgemerkt.
Vervolgens, met behulp van een steriele 25-gauge naald, boor een 3-millimeter gat in de schedel rechts van de bregma en net achter de coronale naad. Om de juiste injectiediepte te garanderen, gebruik schaar om 3 millimeter van het puntige uiteinde van een 20-microliter pipettip af te snijden, en schuif een 26-gauge Hamilton spuit in de punt totdat 3 millimeter van de naald uit het uiteinde van de punt steekt. Steek de naald in het gat in de schedel en injecteer langzaam 3 microliters van 3 keer 10 tot de 5de van de tumorcellen gedurende een minuut.
Laat de naald nog een minuut op zijn plaats en trek hem dan langzaam terug. Wissel het blootgestelde bot met 3% waterstofperoxide en 2% chloorhexidine oplossing. Vervolgens, na het drogen van de schedel met een verse katoenen punt applicator, snij een 3 vierkante millimeter stuk steriele botwas uit en bevestig de was aan een kale uiteinden van een katoenen punt applicator.
Bedek de injectieplaats met de botwas. Gebruik vervolgens een pincet om elke kant van de hoofdhuid over de was te trekken. Na het sluiten van de wond en het toedienen van de juiste postoperatieve pijnstilling, herhaal de procedure voor elk experimenteel dier.
Om de groei van de intracraniële tumor te beeldvormen, initialiseer eerst de beeldvormingsstation zoals net gedemonstreerd. Vervolgens, na het bevestigen van het juiste niveau van sedatie door staart knijpen, stel de beeldvormingssysteem parameters in zoals net gedemonstreerd. Met uitzondering van het selecteren van Auto voor de belichtingstijd.
Wanneer het beeldvormingssysteem klaar is, plaats de muizen op de beeldvormingsstation en selecteer Acquire om afbeeldingen van de luciferase expressie te verkrijgen. Wanneer het beeld succesvol is verkregen, selecteer de Region of Interest Tool van het gereedschapspaletten en Auto van het cirkelpictogram. Cirkel de signalen gebieden om de interessegebieden te definiëren en verkrijg vervolgens metingen van de gebieden als eenheden van fotonen per seconde, per steradian per vierkante centimeter.
Verwijder ten slotte de muizen uit de beeldvormingskamer en bewaak de tumordragende dieren totdat ze volledig hersteld zijn. In vitro bioluminescentie beeldvorming van GL261 cellen geïnfecteerd met luciferase-bevattende lentivirus vertoont een robuuste luciferase expressie vergelijkbaar met de luciferase niveaus die worden uitgedrukt door een positieve controle U87MG luciferase-expresserende humane glioblastoomcel lijn. Zoals verwacht, vertonen niet-geïnfecteerde GL261 cellen geen achtergrond luciferase expressie.
Voor intracraniële implantatie, wordt er geen verschil in in vitro groeisnelheden van GL261 luciferase en GL261 cel lijnen waargenomen. Zoals seriële bioluminescentie beeldvorming van intracranieel tumor geïnjecteerde dieren aantoont
Overzicht
Dit protocol demonstreert technieken voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie beeldvorming met GL261 glioomcellen. Het benadrukt het nut van luciferase-gemodificeerde GL261 cellen in het bestuderen van tumor immunologie en immunotherapeutische benaderingen voor glioblastoom.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Immunologie
Achtergrond
- GL261 glioomcellen dienen als een immunocompetent model voor glioblastoom.
- In vivo bioluminescentie beeldvorming maakt niet-invasieve monitoring van tumorgroei mogelijk.
- Luciferase modificatie verbetert het onderzoek naar tumorgedrag en behandelingsreacties.
- Deze methode kan sleutelvragen in tumor immunologie beantwoorden.
Doel van Studie
- Om correcte technieken voor het monitoren van tumorgroei te demonstreren.
- Om het nut van luciferase-gemodificeerde GL261 cellen te verifiëren.
- Om de effecten van stress modificatie op GL261 cellen proliferatie te onderzoeken.
Gebruikte Methoden
- Celcultuur en luciferase modificatie van GL261 cellen.
- In vitro proliferatie assays met behulp van MTS reagens.
- Intracraniële implantatie van tumorcellen in muizen.
- In vivo beeldvorming van tumorgroei met behulp van bioluminescentie beeldvorming software.
Belangrijkste Resultaten
- GL261 luciferase-expresserende cellen tonen robuuste groei in vivo.
- Geen significant verschil in overlevingspercentages tussen tumor-dragende groepen.
- Techniek maakt beeldvorming van meerdere muizen efficiënt mogelijk.
- Luciferase expressie correleert met tumorgroeisnelheden.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare benadering voor het bestuderen van glioblastoom.
- Luciferase-gemodificeerde GL261 cellen zijn effectief voor onderzoek naar tumor immunologie.
- In vivo bioluminescentie beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor het monitoren van behandelingsreacties.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This immunocompetent GL261 glioma model enables biopharma R&D to evaluate immunotherapeutic mechanisms in a syngeneic system with intact immune microenvironment. Bioluminescence imaging provides quantitative, noninvasive monitoring of tumor growth kinetics, supporting go/no-go decisions in preclinical immuno-oncology programs. The luciferase-modified system maintains native tumor-immune interactions, improving translational confidence for immunotherapy candidate assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of immunomodulatory targets within an intact tumor microenvironment.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of immune checkpoint and cytokine-mediated mechanisms using syngeneic challenge.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable bioluminescent readouts correlated with tumor burden for dose-response profiling.
- Operational Value: Standardizes in vitro and in vivo proliferation assays via photon flux measurements.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains histopathological and immunological fidelity to human glioblastoma for mechanistic de-risking.
- Operational Value: Facilitates longitudinal tracking of tumor-immune dynamics during immunotherapeutic intervention.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into immuno-oncology discovery workflows by enabling real-time monitoring of tumor growth and immune cell infiltration in syngeneic models.
- Discovery Biology: Supports target validation through longitudinal imaging of tumor growth in immunocompetent context.
- Screening: Enables high-throughput assessment of immunomodulatory compounds via standardized bioluminescent output.
- Analytics: Provides quantitative tumor growth metrics (photons/sec/steradian/cm²) for comparative efficacy analysis.
- Translational Research: Preserves immune microenvironment continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for iterative immuno-oncology target screening.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in immuno-oncology by preserving native immune-tumor interactions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized luciferin dosing and region-of-interest photon quantification.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early immunotherapeutic efficacy assessment in syngeneic models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immuno-oncology candidates based on longitudinal tumor growth suppression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile intracranial implantation and bioluminescence imaging system calibration.
- Dependent on luciferase-expressing cell line validation and luciferin substrate availability.
- Necessitates cross-functional standardization between oncology and immunology teams for consistent ROI definition.
- Adaptation considerations include immune-competent strain variability and intracranial injection precision.
- Practical limitations include signal attenuation at deep tumor sites and requirement for longitudinal animal monitoring.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Induction of GL261 Firefly Luciferase Reporter Expression
2:31
In Vitro Proliferation Assay
3:40
Tumor Cell Implantation
6:16
Bioluminescence Imaging of GL261 Tumor Growth
7:26
Results: Representative In Vitro and In Vivo GL261 Luciferase Expression
8:31
Conclusion
