Name: Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer bioluminescentiebeeldvorming voor het monitoren van intracraniale tumorgroei met luciferase-gemodificeerde GL261-cellen in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorimmunologie en immunotherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen Rajwant Kaur bedanken voor technische assistentie. We willen Maxwell Tom bedanken voor assistentie bij de bereiding van het lentivirus. Dit werk werd ondersteund door de Reza and Georgianna Khatib Endowed Chair in Skull Base Tumor Surgery aan UCSF, en de Michael J. Marchese Professor and Chair aan Northwestern University.

Alle procedures hieronder beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Northwestern University goedgekeurd en uitgevoerd onder gesteriliseerde omstandigheden. 1. Wijziging van de GL261 cellen met vuurvliegluciferase Uiting Reporter OPMERKING: HIV-1-gebaseerde lentivirale vectoren tot expressie vuurvlieg luciferase (Fluc) onder controle van de milt focus vormende virus (SFFV) promoter. De optische reporter gen is gekloneerd in de vector plasmide pHRSIN-CSGW-dlNotI. <ol><li> Handhaaf 293-T-cellen in Dulbecco&#39;s gemodificeerd Eagle&#39;s medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en GL261 cellen in RPMI medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 95 % lucht en 5% kooldioxide (CO 2). </li><li> Wanneer de 293-T celkweek bereikt 80% confluentie in een T-75 kolf, was de cellen eenmaal met phosphate buffer zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 3 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins schuin en verzamel alle cellen van de bodem van kolf. Breng de 3 ml trypsine celsuspensie in een 15 ml conische buis en voeg 7 ml vlees RPMI medium (in totaal 10 ml van de celsuspensie). </li><li> Meng de celsuspensie goed met een pipet 5 ml. Neem 100 ul van de celsuspensie uit de buis en tel het aantal cellen met behulp hemocytometer. Hiervoor mix 100 ul van de celsuspensie met 300 pi trypan blauwe oplossing en voeg 2 pl van het mengsel in een hemocytometer. Tel het aantal cellen zonder blauwkleuring vier verschillende weergaven onder een microscoop. Het gemiddelde aantal cellen van elke weergave, omdat dit getal vertegenwoordigt 10 4 cellen / ml. </li><li> Ondertussen, centrifugeer de buis met de celsuspensie bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 1,0 x 10 6 / ml. Seed 2,5 x 10 6 GL261 cellen met 2,5 ml RPMI-medium in een T-175 kolf met 27,5 ml DMEM (dag 1). </li><li> Na 24 uur, vervang het medium met 20 ml vers DMEM (dag 2). </li><li> Om de lentivirale vector produceren, meng 54 pl transfectie reagens met 2 ml serumvrij DMEM gedurende 5 min. Voeg 3 ug gag-pol, 3 ug van vesiculaire stomatitis G envelope (VSV-G), en 4,5 ug Fluc (pSIN-Fluc) in de DMEM met transfectie reagens en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Laat de gehele DNA-mengsel in 293-T kolf (T-175) en incubeer bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 48 uur (dag 2). </li><li> Voeg 10 ml vers DMEM bij 24 uur na transfectie (totaal volume van 293-T celkweekmedium moet ongeveer 30 ml) (dag 3). </li><li> Om GL261 cellen gesplitst in een24-wells plaat, was de cellen eenmaal met PBS zonder Ca2 + en Mg2 +, Incubeer de cellen met 5 ml trypsine (0,05%) bij 37 ° C gedurende 5 min, fijnstampen met een pipet 5 ml van met de kolf enigszins gehelde Verzamel de cellen van de bodem van de kolf, en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2. Ondertussen, centrifugeer de buis bij 300 xg gedurende 7 min. Zuigen de media en resuspendeer de cel pellets met verse RPMI medium om een GL261 celsuspensie te maken op de dichtheid van 2,5 x 10 4 / ml. Seed 2,5 x 10 4 GL261 cellen met 1 ml RPMI medium in een 24-well plaat (dag 3). </li><li> Verzamel 30 ml van de lentivirale supernatant met 10 ml pipet uit de 293-kolf T (T-175) en 48 uur na transfectie en overdracht van de supernatant in 50 ml conische buis. Zuig het lentivirale 30 ml bovenstaande vloeistof via een injectiespuit 50 ml, door een 0,22 urn spuitfilter en aliquot het virale supernatant in 1 ml aliquots (dag 4). </li><li> Vervang 1 ml RPMI middelmatige GL261 celplaatelektrode (24 putjes) met 1 ml van het supernatant lentivirale en incubeer bij 37 ° C in een bevochtigde kamer (dag 4). </li><li> Na 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 6). </li><li> Na 24 uur, herhaal de lentivirale infectie van de GL261 cellen (dag 7). </li><li> Na de 2 e 48 h lentivirale infectie, vervang het medium met 1 ml vers RPMI (dag 9). </li><li> Blijf de luciferase gemodificeerde GL261 cellen groeien (hierna aangeduid als GL261.luc cellen) en vergroten de celkweek aan een T-75 kolf. </li><li> Wanneer de GL261.luc celkweek bereikt 70% confluentie in een T-75 kolf oogst van de cellen door behandeling met trypsine en tellen met een hemocytometer zoals in stap 1,2. Plate de GL261.luc cel in een 24-wells plaat bij afstuderen dichtheden (1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4, 2,5 x 10 4 cellen / putje) en incuberen bij 37 ° C in een luchtbevochtigerfied kamer die 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. </li><li> Meet cellulaire luciferase activiteit ten opzichte Luciferase gemodificeerde U-87 MG (U87.luc) cellen met behulp bioluminescentie (figuur 1). <ol><li> Start de afbeelding software (klik op het pictogram op het bureaublad) en initialiseer de imaging-systeem (klik op &quot;Initialize&quot; knop). Initialisatie begint automatisch en kan enkele minuten duren voordat het systeem check-up en de camera afkoelen tot -90 ° C. </li><li> Voeg 25 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) in elk putje. </li><li> Incubeer de cellen met luciferine gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en de plaat voor 10 sec. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer &quot;Lichtende&quot;, &quot;10 sec&quot; belichtingstijd, en &quot;Medium&quot; binning. Plaats de 24-well plaat op de imaging-station en klik op de &quot;Acquire&quot; knop om de afbeelding te starten. </li><li> Nadat het beeld met succes is overgenomen, zal u een beeld venster en het gereedschap pa zienlette op het scherm. Klik op &quot;ROI (regio&#39;s van belang) Tools&quot; en selecteer 6 x 4 van het pictogram spleet. Maak 6 x 4 spleten aan de oppervlakte van het signaal op het imago van de 24-well plaat bedekken en klik op het tabblad metingen (potloodje). Observeren een venster met een lijst van ROI metingen eenheid van fotonen per seconde per steradiaal per vierkante cm (fotonen / sec / sr / cm2). </li><li> Gebruik U87.luc cellen, eerder bewerkt met dezelfde lentivirus hier gebruikt voor GL261 modificatie 11, als een controle voor de beoordeling van luciferaseactiviteit in getransduceerde GL261.luc cellen. </li></ol></li></ol> 2. In vitro Proliferatie assay <ol><li> Wanneer de GL261 en GL261.luc celculturen 70% confluentie bereiken in een T-75 kolf oogsten beide cellijnen door behandeling met trypsine en tellen als in stap 1,2, en plaat cellen in een 96-putjesplaat met een dichtheid van 1500 cellen in 80 ul van RPMI medium per putje met behulp van een multichannel pipet om tijd en pipetteren fouten te minimaliseren. Seed elke cellijn in 20 putten totaal. De verdamping in de putjes bevolkt door cellen te beperken, vul lege putjes met 100 pl vers RPMI medium. </li><li> Beoordeel de cellulaire proliferatie met behulp van een colorimetrische celproliferatie assay. Hier gebruiken we de MTS-celproliferatie assay. Een multi-kanaal pipet wordt 20 pl MTS reagens in elk putje van de 96-well plaat die de cellen bevat. </li><li> Incubeer de plaat bij 37 ° C in een vochtige kamer met 95% lucht en 5% CO2 gedurende 3 uur. Meet absorptie bij 490 nm met behulp van een microplaat reader. Dit wordt herhaald op dag 1, 2, 4 en 7 na plating. Om absorptiewaarden normaliseren, worden de waarden van elke dag gedeeld door de overeenkomstige waarden verkregen op dag 1 (Figuur 2). </li></ol> 3. Tumor Cell Implantatie Opmerking: Autoclaaf alle apparatuur. Bereid chirurgische gebied door het sproeien van een ontsmettingsmiddel (2% chloorhexidine oplossing) en bedek met absorbent gordijnen. Om steriele omstandigheden te handhaven, dragen steriele chirurgische handschoenen tijdens de operatie, en verdeel de chirurgische gebied in twee gebieden door kleur tape. Area 1 wordt het label &quot;schoon&quot; en bevat gesteriliseerd leveringen; Area 2 is gelabeld &quot;vuile&quot; en bevat gebruikte materialen. <ol><li> Voorafgaand aan chirurgie dier, bereiden een celsuspensie voor intracraniale injectie. Oogst cellen uit een 70% confluente T-75 kolf door behandeling met trypsine en tel cellen via hemocytometer zoals in stap 1,2, en een celsuspensie bij een dichtheid van 1,0 x 10 5 cellen / gl in Hanks &#39;uitgebalanceerde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg 2+ (HBSS). </li><li> Verdoven muizen met intraperitoneale injectie van 200 pi mengsel dat 100 mg / kg ketamine en 10 mg / kg xylazine in 0,9% zoutoplossing. Om een ​​goede verdoving te bevestigen, knijp de teen van de muis. Als de muis volledig onder narcose moet de muis niet reageert op de stimulus. </li><li> Toedienen van 0,1 mg / kg buprenorfine via subcutane injectie aan de postoperatieve pijn te verlichten. </li><li> Scheren de bovenkant van het hoofd van de dieren met behulp van klippers en schoon met een katoenen tip applicator gedoopt in 2% chloorhexidine-oplossing. Gelden oogzalf om adequate smering tijdens de operatie te behouden. </li><li> Maak een sagittale incisie ongeveer 1 cm lang over de parietooccipitalis bot met een steriele scalpel. Om de bregma visualiseren, veeg het oppervlak van de schedel met een katoen-tip applicator gedrenkt in een 3% waterstofperoxide-oplossing. </li><li> Boor de schedel met een steriele 25-G naald een klein gat 3 mm rechts van de bregma en net achter het coronale hechtdraad maken. </li><li> Opdat intracraniële injectie is tot een diepte van 3 mm van de schedel, cut 3 mm van de punt van een 20 ul pipetpunt met een schaar en plaats een injectiespuit in de pipetpunt. </li><li> Steek de spuit loodrecht op het gat eerder gemaakte, en injecteer langzaam de tumorcel suspensioen met 3,0 x 10 5 cellen in 3 ul HBSS, over een periode van 1 min. Laat de naald in de plaats voor nog een minuut, en dan langzaam trek de naald. </li><li> Zwabberen de schedel met katoen-tip applicator gedoopt in 3% waterstofperoxide en de 2% chloorhexidine-oplossing. Droog het oppervlak van de schedel met de katoen-tip applicator. Knip de steriele bot was ongeveer 3 mm 3 in grootte en bevestig het bot was op het einde van het katoen-tip applicator. Breng de been was om het gat met de katoen-tip applicator dekken. </li><li> Teken de beide zijden van de hoofdhuid elkaar via schedel behulp van een tang en nieten om de wond te sluiten. Reinig de wond met een katoen-tip ondergedompeld in 2% chloorhexidine-oplossing. </li><li> Monitor alle muizen post-operatief totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Gewoonlijk hersteltijd bedraagt ​​ongeveer 30 minuten. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. </li></ol><ol><li> Spray een ruime hoeveelheid ontsmettingsmiddel (0,05% dimethyl ammoniumchloride-oplossing) op een schone papieren handdoek. Gebruik de-desinfectiemiddel gedrenkte papieren handdoek grondig vegen de zwarte plaat, neus kegels en verdeler in de beeldvorming kamer waar de dieren in contact komen met het apparaat. Grondig veeg alle oppervlakken met een schone, droge papieren handdoek. Herhaal dit nog een keer en wacht 5 min. </li><li> Initialiseren van de imaging station in stap 1.14.1. </li><li> Verdoven de muis met een 300 pi mengsel dat 200 pl ketamine / xylazine en 100 pl luciferine (D-luciferine kaliumzout, 150 mg / kg) door intraperitoneale injectie. </li><li> Wacht 10 minuten na de injectie en bevestigen als de muizen volledig onder narcose door knijpen de staart. Het opzetten van de imaging-systeem, selecteer &quot;Lichtende&quot;, &quot;Auto&quot; belichtingstijd, en &quot;Medium&quot; binning. Plaats de muizen op de beeldvorming statiop en klik op de &quot;Acquire&quot; knop om de afbeelding te starten. Zorg ervoor dat de tijd na de injectie is consistent met elke opnamesessie. </li><li> Nadat het beeld met succes is overgenomen, moet een beeld raam en palet verschijnen. Klik op &quot;ROI Tools&quot; en selecteer &quot;auto&quot; van het icoon cirkel. Om ROI te definiëren, omringen het gebied van het signaal op de afbeelding, en neem dan de metingen van de ROI als eenheid van fotonen / sec / sr / cm2. </li><li> Neem de muizen uit de beeldvorming kamer en het toezicht op de muizen totdat ze ambulante en behouden normale activiteit. Typisch hersteltijd is ongeveer 15 min. Laat de muizen niet terug naar de kooi met andere dieren totdat deze volledig hersteld van anesthesie. </li><li> Monitor tumorgroei door bioluminescentie tweemaal per week totdat aanwezige dieren de volgende symptomen: gewichtsverlies (verlies van meer dan 20% van het gewicht vóór de implantatie), gebrek aan eetlust (complete anorexie voor 24 uur), en een gebrek aan duurzame purposeful respons op zachte stimuli (weak poging om omhoog), waarna ze moeten worden gedood. Euthanaseren dieren met deze symptomen met een CO 2 kamer, gevolgd door cervicale dislocatie. <ol><li> Plaats muizen in de euthanasie kamer (niet overvol de kamer) en de instroom samengeperst CO 2 voor 5-6 min. Merk op dat alle dieren zijn bewusteloosheid en niet na ongeveer 5 min ademhalen. </li><li> Neem de muizen uit de kamer. Zorg ervoor dat het hart niet klopt door het gevoel van de borst tussen duim en wijsvinger en controleer of er geen blink reflex. </li><li> Weerhouden de muis in een buikligging op een vlakke ondergrond en het grijpen van de achterkant van de nek aan de basis van de schedel met de ene hand en de basis van de staart met uw duim en wijsvinger van de andere hand. </li><li> Restrain het hoofd en snel de staart te trekken naar achteren. Zorg ervoor dat de schedel is gescheiden van de eerste halswervel met duim en wijsvinger. </li></ol></li><li> Normalize luminescentie waarden voor elke dag tegen corresponderende metingen verkregen bij de eerste dag van bioluminescentie als in stap 2,3 (Figuur 3A). </li><li> Voor statistische analyse, het genereren van overlevingscurven met behulp van de Kaplan-Meier schatter 12 en vergelijk de verschillen tussen overlevingscurven met behulp van een log-rank test 13. </li></ol>

<ol><li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgical+management+and+prognosis+of+patients+with+glioblastoma+that+progresses+during+bevacizumab+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Neurosurgical management and prognosis of patients with glioblastoma that progresses during bevacizumab treatment.</a> Neurosurgery. 70 (2), 361-370 (2012).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Grossman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+treated+with+radiation+and+temozolomide+in+research+studies+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with newly diagnosed glioblastoma treated with radiation and temozolomide in research studies in the United States.</a> Clin Cancer Res. 16 (8), 2443-2449 (2010).</li>
<li>Sughrue, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+considerations+of+modern+animal+models+of+malignant+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Immunological considerations of modern animal models of malignant primary brain tumors.</a> J Transl Med. 7 (84), (2009).</li>
<li>Ausman, J. I., Shapiro, W. R., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+chemotherapy+of+experimental+brain+tumors%3A+development+of+an+experimental+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on the chemotherapy of experimental brain tumors: development of an experimental model.</a> Cancer Res. 30 (9), 2394-2400 (1970).</li>
<li>Zagzag, D., Zhong, H., Scalzitti, J. M., Laughner, E., Simons, J. W., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+hypoxia-inducible+factor+1alpha+in+brain+tumors%3A+association+with+angiogenesis%2C+invasion%2C+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of hypoxia-inducible factor 1alpha in brain tumors: association with angiogenesis, invasion, and progression.</a> Cancer. 88 (11), 2606-2618 (2000).</li>
<li>Cha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic%2C+contrast-enhanced+perfusion+MRI+in+mouse+gliomas%3A+correlation+with+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic, contrast-enhanced perfusion MRI in mouse gliomas: correlation with histopathology.</a> Magn Reson Med. 49 (5), 848-855 (2003).</li>
<li>Ksendzovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+immunosuppressive+mechanisms+in+a+mouse+glioma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Investigation of immunosuppressive mechanisms in a mouse glioma model.</a> J Neurooncol. 93 (1), 107-114 (2009).</li>
<li>Biollaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+anti-tumor+immunity%3A+differences+in+DC+function%2C+TGF-beta+production+and+numbers+of+intratumoral+Foxp3%2B+Treg%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Site-specific anti-tumor immunity: differences in DC function, TGF-beta production and numbers of intratumoral Foxp3+ Treg.</a> Eur J Immunol. 39 (5), 1323-1333 (2009).</li>
<li>El Andaloussi, A., Han, Y., Lesniak, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolongation+of+survival+following+depletion+of+CD4+%2B+CD25%2B+regulatory+T+cells+in+mice+with+experimental+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Prolongation of survival following depletion of CD4 + CD25+ regulatory T cells in mice with experimental brain tumors.</a> J Neurosurg. 105 (3), 430-437 (2006).</li>
<li>Dinca, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107 (3), 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185207(1972).</li>
<li>Armitage, P., Berry, G., Matthews, J. N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArmitage%2C+P+%22Statistical+Methods+in+Medical+Research%22">Statistical Methods in Medical Research</a>. , 4th ed, Blackwell Science. Oxford. (2001).</li>
<li>Newcomb, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combination+of+ionizing+radiation+and+peripheral+vaccination+produces+long-term+survival+of+mice+bearing+established+invasive+GL261+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The combination of ionizing radiation and peripheral vaccination produces long-term survival of mice bearing established invasive GL261 gliomas.</a> Clin Cancer Res. 12 (15), 4730-4737 (2006).</li>
<li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurospheres+enriched+in+cancer+stem-like+cells+are+highly+effective+in+eliciting+a+dendritic+cell-mediated+immune+response+against+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Neurospheres enriched in cancer stem-like cells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune response against malignant gliomas.</a> Cancer Res. 66 (21), 10247-10252 (2006).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+luciferase+expression+does+not+alter+immunologic+or+in+vivo+growth+properties+of+GL261+murine+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Stable luciferase expression does not alter immunologic or in vivo growth properties of GL261 murine glioma cells.</a> J Transl Med. 12, 345-34 (2014).</li>
<li>Abdelwahab, M. G., Sankar, T., Preul, M. C., Scheck, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+implantation+with+subsequent+3D+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+murine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intracranial implantation with subsequent 3D in vivo bioluminescent imaging of murine gliomas.</a> J Vis Exp. (57), e3403(2011).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+intracranial+brain+tumor+xenografts+with+subsequent+analysis+of+tumor+growth+and+response+to+therapy+using+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Baumann, B. C., Dorsey, J. F., Benci, J. L., Joh, D. Y., Kao, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten die bekend moeten worden gemaakt.

GL261 muizen glioomcellen, wanneer intracraniaal geïmplanteerde syngene immuuncompetente in C57BL / 6-muizen, bieden een aantal voordelen in vergelijking met humane glioma xenograft diermodellen. Veel van xenogetransplanteerde tumoren groeien als ingekapselde letsels die niet nauwkeurig niet herhalen de invasieve ziekte bij de mens. Daarentegen GL261 tumor toont niet alleen invasie in aangrenzende hersenen, maar ook neovascularisatie, mitotische figuren en diepe necrose 7. Het belangrijkste is het bestuderen tumorimmunologie of immunotherapeutische strategieën 15, 16, de C57BL / 6 muis behoudt een intact immuunsysteem 8. Eerdere studies hebben aangetoond robuuste expressie van het immuunonderdrukkende cytokine TGF-β en intracraniale tumoren bevatten immunosuppressieve T-regulerende cellen vergelijkbaar met humane glioblastoma 9, 10. De eenvoudige techniek beschreven maakt stabiele expressie van luciferase door GL261 cellen. We hebben onlangs gemeld Similar in vitro en in vivo groei van cellen GL261.luc opzichte GL261 cellen naast soortgelijke tumor histologische kenmerken en immuuncel 17 infiltreren. GL261.luc cellen stabiel tot expressie luciferase die de oxidatie van het substraat luciferine omzetten van chemische energie fotonen en dus detecteerbaar licht katalyseert. Luciferine kan veilig worden toegediend aan dieren en passeert de bloed-hersenbarrière na intraperitoneale of intraveneuze injectie. In kleine proefdieren, zoals muizen, kan de bioluminescentie extern worden gedetecteerd in een niet-invasieve manier 11. Daarom kan tumorgroei serieel worden geëvalueerd zonder dat dierenoffer of dure MRI of CT-beeldvorming. De kritische stappen in het protocol omvatten, niet alleen de lentivirale transductie, maar ook de controle van de stabiele expressie van luciferase in vitro alvorens te beginnen met in vivo experimenten. Verlies van transductie kan buitere herhalen lentivirus infectie. Invoering van een antibioticum resistentiegen in de expressievector kan ook worden gebruikt om te selecteren op luciferase-expressie. Zorgvuldige techniek vereist intracraniale implantatie reproduceerbaar plaats een substantieel aantal cellen in een exacte anatomische locatie aan vergelijking van verschillende behandelingsgroepen toelaten. Een belangrijk verschil tussen de huidige studie en eerdere studies van luciferase expressie GL261 cellen is het gebruik van een vrije hand techniek voor het implanteren van cellen in vergelijking met het gebruik van een stereotactische kader 18. We hebben eerder aangetoond consistente implantatie resultaten met de vrije hand techniek 19. Het voordeel van de vrije hand techniek is het vermogen om hoge doorvoer analyse van verschillende behandelingsmiddelen voeren. In onze handen, kunnen we ongeveer 60 dieren geïmplanteerd in 1 uur. Na het beheersen van de techniek, de toekomstige toepassingen van de techniek zijn eindeloos. Zoals GL261 demonstrates verhoogde mitose en snelle tumorgroei vergelijkbaar met humane glioblastoma, kunnen antiproliferatieve behandeling geëvalueerd. Evenzo kunnen anti-invasieve en anti-angiogene therapieën worden gebruikt als GL261 tumoren invasief en angiogene. Voorzichtigheid moet worden gebruikt bij het beoordelen van het effect van chemotherapeutische middelen die gericht zijn op de menselijke doelen. In vergelijking met eerdere studies gebruik te maken van de menselijke glioblastoma xenograften uiten luciferase 20, zou dit worden beschouwd als een beperking van ons model. Ook kan het effect van immunotherapeutische strategieën tumorgroei bestudeerd in de GL261 xenotransplantatie model.

Maligne glioom is de meest voorkomende en dodelijkste hersentumor bij mensen. Zelfs bij behandeling met maximale chirurgische resectie, radiotherapie en chemotherapie, blijft de mediaanoverleving 15-20 maanden in grote hersentumorverwijscentra1, 2, 3. De meest agressieve vorm van kwaadaardig glioom, glioblastoma, wordt gekenmerkt door mitotische figuren, nieuwe vaatvorming, invasie in aangrenzende hersenen en pseudopalisaderende necrose. Orthotopische hersentumor xenografts met behulp van menselijke hersentumorcellen hebben een essentiële functie vervuld in neuro-oncologisch onderzoek en de preklinische translatie vergemakkelijkt voor het testen van nieuwe middelen, voordat ze worden toegelaten tot klinische onderzoeken bij mensen. Hoewel de meeste humane xenograftmodellen veel kenmerken van de menselijke ziekte nabootsen, is een fundamentele beperking van alle humane gebaseerde xenograftmodelsystemen het gebruik van immuungecompromitteerde dieren4.
De afwezigheid van een intacte gastheerrespons wijzigt duidelijk de tumorgroei, zowel in termen van tumormorfologie als efficiëntie van implantatie. Hoewel bepaalde aannames acceptabel zijn in de interpretatie van resultaten uit xenograftmodellen, is het bereiken van relevante conclusies op het gebied van therapeutische beoordeling een uitdaging. Bepaalde fundamentele biologische kenmerken zijn waarschijnlijk vergelijkbaar in immuungecompromitteerde en immuuncompetente dieren, maar andere zoals tumorgeassocieerde ontsteking, weefselinvasie, respons op letsel zijn waarschijnlijk heel verschillend. In tegenstelling daarmee is GL261 een chemisch geïnduceerde muisglioomcellijn die nauwkeurig glioom nabootst wanneer geïmplanteerd in de hersenen van immuuncompetente syngene C57BL/6 muizen5. Net als bij de menselijke ziekte, leidt intracranieel tumorgroei snel en reproduceerbaar tot neurologische symptomen en de dood van het dier6-10.
Subcutane tumorgroei kan direct worden gemeten. Intracraniële tumorgroei kan alleen worden gemeten met dierenoffer of met dure beeldvormingsstudies. Stabiele expressie van het enzym luciferase maakt non-invasieve en kosteneffectieve intracranieel bioluminiscentiebeeldvorming mogelijk11. Bioluminiscentie van luciferase getransfecteerde GL261 cellen correleert goed met intracranieel tumorgroei. We hebben onlangs GL261 rechtstreeks vergeleken met luciferase gemodificeerde GL261 cellen en hebben geen verschil aangetoond in in vitro groei en invasie, immunologisch cytokineprofiel, in vivo overleving van intracranieel tumordragende C57BL/6 muizen of immuuncelinfiltraat. Deze techniek is toepasbaar op preklinische glioblastoomstudies die non-invasieve monitoring van tumorgroei omvatten.

<table><tbody><tr><td>D-Luciferin, Potassium Salt</td><td>Gold Biotechonology</td><td>LUCK-100</td><td>Bewaar uit de buurt van licht</td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact op voor prijsopgave</td><td>geen</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Contact op voor prijsopgave</td><td>geen</td></tr><tr><td>24-well; Standaard weefselcultuur; platte bodem</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Celproliferatie Assay&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>geen</td></tr><tr><td>Synergy 2 Multi-Mode Reader</td><td>BioTek</td><td>Contact op voor prijsopgave</td><td>geen</td></tr><tr><td>96 wel Assay Plate, Zwarte Plaat, Heldere bodem met Deksel, Weefselcultuur Tretaed</td><td>Coster</td><td>3603</td><td>geen</td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0856-2013-01</td><td>Controlestof</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>23076-35-9</td><td>geen</td></tr><tr><td>28G Naald (met spuit)&nbsp;</td><td>Fisher&nbsp;&nbsp;</td><td>22-004-270</td><td>Ook bekend als Insuline Spuit</td></tr><tr><td>2% Chlorhexidine</td><td>Fisher</td><td>NC9756995</td><td>Ook bekend als &ldquo;Nolvasan&rdquo;</td></tr><tr><td>3% Waterstofperoxide</td><td>Fisher</td><td>H312P-4</td><td>Bewaar uit de buurt van licht</td></tr><tr><td>Oftalmische Zalf</td><td>Cardinal Health</td><td>1272830</td><td>Ook bekend als &ldquo;Akwa Tears&rdquo;</td></tr><tr><td>25G 1 1/2 naald</td><td>BD Becton Dickinson</td><td>305127</td><td>geen</td></tr><tr><td>Wegwerp Scalpels</td><td>Feather</td><td>2975</td><td>Nr. 21</td></tr><tr><td>Gaas</td><td>Fisher</td><td>22028563</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Verwarmingskussentjes</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td>geen</td></tr><tr><td>Huid Stapler, Haakjes, Verwijderaar</td><td>Stoelting</td><td>59020</td><td>geen</td></tr><tr><td>PDI Alcohol Prep Pads</td><td>Fisher</td><td>23-501-711</td><td>geen</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wondclips 100 verpakking</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>203 1000</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wondclip Applier</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>204 1000</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm Wondclip Verwijderaar</td><td>Brain Tree Scientific, INC</td><td>205 1000</td><td>geen</td></tr><tr><td>Single Ended Ronde Tip Swab met Hout handvat</td><td>Qosmedix</td><td>10107</td><td>Autoclaveer voor gebruik</td></tr><tr><td>Hanks' Gebalanceerde Zout Oplossing zonder Ca2+ en Mg2+ (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>geen</td></tr><tr><td>Hamilton Spuit</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>geen</td></tr><tr><td>FuGENE 6 Transfectie Reagens</td><td>Promega</td><td>E2961</td><td>geen</td></tr><tr><td>Beenwas</td><td>Harvard Apparatus</td><td>599864</td><td>geen</td></tr></tbody></table>

bioluminescentie beeldvorming van een immunocompetente diermodel voor glioblastoma

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In tegenstelling tot vaak gerapporteerde humane glioma xenograft-diermodellen, recapituleren GL261 muis glioma xenografts bijna alle relevante klinische en histopathologische kenmerken van de humane ziekte. Wanneer GL261 cellen intracranieel worden geïmplanteerd in syngene C57BL/6 muizen, heeft het model het extra voordeel van het behoud van een intact immuun micro-omgeving. Stabiele expressie van luciferase in GL261 cellen maakt niet-invasieve, kosteneffectieve bioluminiscentie monitoring van intracranieel tumorgroei mogelijk. We hebben recent aangetoond dat luciferase expressie in GL261 cellen de tumorgroei eigenschappen, immunomodulerende cytokine expressie van tumorcellen, infiltratie van immuuncellen in de tumor, of de algehele overleving van dieren met de intracraniale tumor niet beïnvloedt. Daarom lijkt het erop dat het GL261 luciferase glioma model nuttig kan zijn in de studie van nieuwe chemotherapeutische en immunotherapeutische modaliteiten. Hier rapporteren we de techniek voor het genereren van stabiele luciferase expressie in GL261 cellen en hoe de in vitro en in vivo groei van de tumorcellen te bestuderen door bioluminiscentie beeldvorming.

GL261 cellen werden geïnfecteerd met luciferase bevattende lentivirus zoals hierboven beschreven in stap 1. In vitro bioluminescentie illustratie robuuste luciferase-expressie vergelijkbaar met niveaus in de positieve controle U87.luc humane glioblastoma cellijn (Figuur 1). Zoals verwacht, niet-geïnfecteerde GL261 cellen tonen geen achtergrond luciferase expressie. Deze stap is eenvoudig cruciaal te voeren voordat verdere studies op de geïnfecteerde cellijn stabiele luciferase expressie te bevestigen. Luciferase-expressie na intracraniale implantatie. Voor intracraniale implantatie we lieten geen verschil in vitro groeisnelheid van GL261.luc opzichte GL261 cellen (Figuur 2). Voor intracraniële groei en overleving analyse werden cellen geïnjecteerd in de brAins van C57BL / 6 muizen per protocol stap 3. tumorgroei in muizen die tumoren GL261.luc werd serieel geanalyseerd op bioluminescentie beeldvorming met behulp protocol stap 4 en toonde detecteerbare tumorgroei (Figuur 3A). Muizen snel en consequent lager GL261.luc tumoren werd stervende en werden gedood. Belangrijk is er geen verschil in overall overleving tussen GL261.luc en GL261 tumordragende dieren (figuur 3B). In vivo bioluminescentie kan derhalve worden gebruikt om de respons op experimentele glioblastoma behandelingen volgen. Snelle betrouwbare tumorgroei en korte overleving kunnen grote hoeveelheden data op in een relatief korte tijd. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig1.jpg" /> Figuur 1. Luciferaseactiviteit in GL261.luc cellen. U87.luc, GL261.luc en GL261 (negatieve controle) cellen werden bij dichtheden van1,0 x 10 6, 5,0 x 10 5, 2,5 x 10 5, 1,0 x 10 5, 5,0 x 10 4 en 2,5 x 10 4 cellen / putje van links naar rechts. Luminescentie (foton / sec / sr / cm2) werd gemeten door het Lumina imaging station. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig2.jpg" /> Figuur 2. Luciferase-expressie geen invloed GL261 celproliferatie. GL261.luc cellen niet veroorzaken verschil in proliferatie zoals aangetoond door MTS celproliferatie assay. De grafiek laat voudige toename ten opzichte van dag 1, zoals bepaald door de gemiddelde absorptiewaarde vergelijking (gemiddelde ± SEM) en thespecified tijdstip de gemiddelde waarde op dag 1 (ongepaarde t-test-waarden vergelijkingentussen elke cellijn: P = 0,7796) 14. Fout balken geven de gemiddelde waarden (gemiddelde ± SEM) van viervoud monsters op elke dag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53287/53287fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/53287/53287fig3.jpg" /> Figuur 3. Luciferase-expressie dosis geen effect op in vivo tumorgroei en overleving van dieren. (A) Bioluminescence bewaking toont progressieve groei van intracraniële GL261.luc tumor in C57BL / 6 muizen. (B) Kaplan-Meier survival analyse toont geen verschil in de totale overleving voor muizen intracraniaal geïmplanteerde met ofwel GL261 (vaste lijn) of GL261.luc cellen (stippellijn).Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

Het algemene doel van dit protocol is om de juiste technieken aan te tonen voor het monitoren van tumorcel- en intracraniale tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-imaging om het nut van luciferase-modificatie van GL261 murine tumorcellen te verifiëren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de studie van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen, zoals de vraag of de stressmodificatie de proliferatie en de in vivo groei van GL261-cellen beïnvloedt.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de luciferase-modificatie van GL261-tumorcellen een niet-invasieve monitoring van hun groei en respons op behandeling in situ mogelijk maakt. Wanneer de GL261-luciferase-celcultuur een confluentie van 70% bereikt in een T75-fles, worden de cellen geoogst door trypsinisatie. Tel de cellen en breng ze vervolgens over naar een 24-wells plaat met graduerende dichtheden.Na drie uur in een celkweekincubator opent u de software voor bioluminescentie-imaging en initialiseert u het imagingsysteem. Wanneer de camera is afgekoeld tot -90 °C, stelt u de imaging-software in op Luminescent met een belichtingstijd van 10 seconden en een Medium Binning. Incubeer vervolgens de cellen in 25 µL luciferine per put gedurende één minuut bij kamertemperatuur en plaats de plaat op het imagingstation.Selecteer Acquire om te starten met het imagen. Wanneer er succesvol een afbeelding is verkregen, verschijnen een afbeeldingsvenster en een pallet met hulpmiddelen. Klik op de Regions of Interest Tools en selecteer 6 by 4 via het sleufpictogram.Dek het signaalgebied af met 6 bij 4 slits en selecteer het potloodicoon op het tabblad Measurements. Er verschijnt een venster met een tabel van metingen van het interessegebied in eenheden van fotonen per seconde per steradiaan per vierkante centimeter. Om een in vitro proliferatie-assay uit te voeren, oogst u de celculturen zoals zojuist gedemonstreerd zodra ze een confluentie van 70% bereiken.Gebruik een multikanalspipet om de tumorcellen in 20 putjes van een 96-wellsplaat te plaatsen, met 1,5 × 10³ cellen per 80 µL RPMI-medium per putje. Om verdamping van de celculturen te beperken, vult u de omringende lege putjes met 100 µL vers RPMI-medium. Voeg vervolgens 20 µL MTS-reagens toe aan elk putje met cellen om de cellulaire proliferatie te beoordelen.Incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2. Gebruik na drie uur een microplaatlezer om de absorptie bij 490 nm te meten. Om de absorptiewaarden te normaliseren, worden de waarden van elke dag gedeeld door de overeenkomstige metingen die op dag één zijn verkregen.Op de dag van de implantatie worden 1 x 10⁵ cellen per µL uit een 70% confluente tumorcelcultuur gesuspendeerd in HBSS zonder calcium en magnesium. Vervolgens, na het bevestigen van het juiste sedatieniveau via een klemtest van de teen, wordt de bovenkant van de kop van elk experimenteel dier geschoren. Reinig vervolgens elke schedel met 2% chloorhexidine met behulp van een wattenstaafje.Breng vervolgens glijmiddel aan in de ogen van elke muis. Gebruik nu een steriel scalpel om een sagittale incisie van ongeveer 1 centimeter te maken over het pariëtaal-occipitaal bot van het eerste dier. Reinig het oppervlak van de schedel opnieuw met 3% waterstofperoxide en noteer de positie van het zichtbare bregma.Boor vervolgens met een steriele naald van 25-gauge een gat van 3 millimeter in de schedel, rechts van het bregma en net achter de coronale naad. Om de juiste injectiediepte te garanderen, knipt u met een schaar 3 millimeter van het puntige uiteinde van een 20-microliter pipetpunt af en schuift u een 26-gauge Hamilton-spuit in de punt totdat er 3 millimeter van de naald uit het uiteinde van de punt steekt. Voer de naald in het gat in de schedel in en injecteer langzaam 3 µL van 3 × 10⁵ tumorcellen gedurende een periode van één minuut.Laat de naald nog een minuut op zijn plaats zitten en trek deze vervolgens langzaam terug. Spoel het blootgelegde bot met 3% waterstofperoxide en een 2% chlohexidine-oplossing. Droog daarna de schedel met een nieuwe wattenstaaf en snijd een steriel stukje botwas van 3 vierkante millimeter uit en bevestig de was aan het uiteinde van een wattenstaaf.Bedek de injectieplaats met de botwas. Gebruik vervolgens een pincet om beide zijden van de hoofdhuid over de was te trekken. Nadat de wond is gesloten en de passende postoperatieve analgesie is toegediend, wordt de procedure voor elk experimenteel dier herhaald.Om de groei van de intracraniale tumor in beeld te brengen, moet u eerst het beeldvormingsstation initialiseren zoals zojuist gedemonstreerd. Stel vervolgens, nadat u het passende sedatieniveau via een staartknijpreflex heeft bevestigd, de parameters van het beeldvormingssysteem in zoals zojuist gedemonstreerd, met uitzondering van de belichtingstijd, waarbij u Auto selecteert.Wanneer het beeldvormingssysteem gereed is, plaatst u de muizen op het beeldvormingsstation en selecteert u 'Acquire' om beelden van de luciferase-expressie te verkrijgen. Wanneer het beeld succesvol is verkregen, selecteert u de 'Region of Interest Tool' uit het gereedschapspallet en 'Auto' via het cirkelicoon. Omcirkel de signaalgebieden om de regio's van belang te definiëren en verkrijg vervolgens metingen van deze regio's in eenheden van fotonen per seconde, per steradiaan per vierkante centimeter.Verwijder ten slotte de muizen uit de beeldvormingskamer en monitor de tumor dragende dieren totdat ze volledig hersteld zijn. In vitro bioluminescentie-imaging van GL261-cellen die geïnfecteerd zijn met een luciferase-bevattend lentivirus vertoont een robuuste luciferase-expressie die vergelijkbaar is met de luciferaseniveaus tot expressie gebracht door een positieve controle U87MG luciferase-expresserende menselijke glioblastoom-cellijn. Zoals verwacht vertonen niet-geïnfecteerde GL261-cellen geen achtergrondexpressie van luciferase.Vóór de intracraniële implantatie wordt geen verschil waargenomen in de in vitro groeisnelheden van de GL261 luciferase- en GL261-cellijnen. Zoals seriële bioluminescentie-imaging van dieren met intracraniële tumorinjecties aantoont, vertonen GL261 luciferase-exprimerende tumorcellen ook een snelle en consistente groeisnelheid in vivo, waarbij geen significant verschil in overlevingstijden tussen de experimentele tumorgroepen is waargenomen. Zodra deze techniek onder de knie is, kunnen er tot 25 muizen per uur worden geïmaget, mits deze correct wordt uitgevoerd.Na de ontwikkeling van deze techniek wordt de bruikbaarheid van bioluminescentie-imaging voor het monitoren van GL261-tumorgroei in vivo verbeterd, wat het onderzoek naar immunotherapeutische responsen in immuuncompetente muismodellen verder bevordert.

bioluminescence-imaging-an-immunocompetent-animal-model-for

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Luciferase-gemodificeerd menselijk brein tumor xenotransplantaten kan intracranially worden vastgesteld athymische muizen, met de daaropvolgende controle van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie beeldvorming. In combinatie met survival analyse, bioluminescentie monitoring is een essentieel onderzoeksinstrument voor pre-klinisch testen van therapieën worden overwogen voor de behandeling van hersentumoren.

Tot vaststelling van Intracraniële hersentumor xenotransplantaten Met verdere analyse van de tumorgroei en de respons op de therapie met behulp van bioluminescentie Imaging

Bioluminescentie beeldvorming van hypoxie induceerbare factor-1α-activiteit wordt toegepast op intracraniale tumor hypoxie ontwikkeling in een borstkanker hersenmetastasen muismodel te controleren.

In vivo bioluminescentie van Tumor Hypoxie Dynamiek van Borstkanker hersenmetastasen in een muismodel

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

In this video, we describe fluorescence molecular tomography or FMT for in vivo imaging of fluorescent protein-tagged glioblastoma xenografts in mouse models. The technique is useful for elucidating the effects of anti-tumor therapeutics at the molecular level.

Fluorescence Molecular Tomography: An Imaging Technique for In Vivo Imaging of Fluorescent Protein-tagged Glioblastoma Xenografts in Mouse Model

Source: Clark, A.J., et al. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates bioluminescence imaging to track glioblastoma progression in an immunocompetent mouse model, using luciferase-expressing tumor cells and luciferin to quantify tumor growth non-invasively.

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Mouse Model for Glioblastoma

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Glioblastoom is een verwoestende vorm van primaire hersenkanker en interstitiële thermische lasertherapie is in opkomst als een veelbelovend alternatief voor conventionele chirurgische resectie voor inoperabel glioblastoom. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerd preklinisch muismodel dat kan worden gebruikt om behandelingseffecten of adjuvante en combinatorische behandelingen te bestuderen.

Een immunocompetent muizenmodel voor laser interstitiële thermische therapie van glioblastoom

Leer bioluminescentiebeeldvorming voor het monitoren van intracraniale tumorgroei met luciferase-gemodificeerde GL261-cellen in muizen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar tumorimmunologie en immunotherapie.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Meer video's verkennen