Name: Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Ontdek een endotheliaal planair celmodel voor beeldvorming van immunologische synapsdynamica met hoge resolutie. Deze methode onthult T-celactiveringsmechanismen in adaptieve immuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We danken Dr. Peter T. Sage voor zijn hulp bij het genereren van enkele van de representatieve afbeeldingen. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01-subsidie aan C.V.C. (HL104006).

<ol><li>von Andrian, U. H., Mackay, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+function+and+migration.+Two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell function and migration. Two sides of the same coin.</a> N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).</li>
<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+receptors+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion receptors of the immune system.</a> Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).</li>
<li>Shaw, A. S., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+T+cell+receptor+go+the+distance%3A+a+topological+view+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Making the T cell receptor go the distance: a topological view of T cell activation.</a> Immunity. 6 (4), 361-369 (1997).</li>
<li>Monks, C. R., Freiberg, B. A., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+segregation+of+supramolecular+activation+clusters+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells.</a> Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).</li>
<li>Delon, J., Stoll, S., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+T-cell+interactions+with+antigen+presenting+cells+in+culture+and+in+intact+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Imaging of T-cell interactions with antigen presenting cells in culture and in intact lymphoid tissue.</a> Immunol Rev. 189, 51-63 (2002).</li>
<li>Brossard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifocal+structure+of+the+T+cell+-+dendritic+cell+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multifocal structure of the T cell - dendritic cell synapse.</a> Eur J Immunol. 35 (6), 1741-1753 (2005).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+context+of+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cellular context of T cell signaling.</a> Immunity. 30 (4), 482-492 (2009).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).</li>
<li>Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+complexes+and+clusters%3A+functional+advantages+and+methodological+hurdles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles.</a> J Cell Sci. 123, 309-320 (2010).</li>
<li>Oddos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+high-resolution+imaging+of+intercellular+immune+synapses+using+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">High-speed high-resolution imaging of intercellular immune synapses using optical tweezers.</a> Biophys J. 95 (10), L66-L68 (2008).</li>
<li>Grakoui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse%3A+a+molecular+machine+controlling+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation.</a> Science. 285 (5425), 221-227 (1999).</li>
<li>Bunnell, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+ligation+induces+the+formation+of+dynamically+regulated+signaling+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies.</a> J Cell Biol. 158 (7), 1263-1275 (2002).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).</li>
<li>Seminario, M. C., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+T-cell+receptor+microclusters%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in T-cell receptor microclusters.</a> Immunol Rev. 221, 90-106 (2008).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+bilayers+at+the+vanguard+of+immune+cell+activation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Supported bilayers at the vanguard of immune cell activation studies.</a> J Struct Biol. 168 (1), 152-160 (2009).</li>
<li>Martinelli, R., Carman, C. V. Lymphocyte Endothelilal Interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartinelli%2C+R+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. Bradshaw, R. A., Stahl, P. , Elsevier. London. (2015).</li>
<li>Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T lymphocyte-endothelial cell interactions.</a> Annu Rev Immunol. 22, 683-709 (2004).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Jarmin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+presentation+by+the+endothelium%3A+a+green+light+for+antigen-specific+T+cell+trafficking%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Antigen presentation by the endothelium: a green light for antigen-specific T cell trafficking?</a> Immunol Lett. 93 (2-3), 109-113 (2004).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+recognition+is+facilitated+by+invadosome-like+protrusions+formed+by+memory%2Feffector+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen recognition is facilitated by invadosome-like protrusions formed by memory/effector T cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3686-3699 (2012).</li>
<li>Kumari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+foci+facilitate+activation+of+the+phospholipase+C-gama+in+primary+T+lymphocytes+via+the+WASP+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Actin foci facilitate activation of the phospholipase C-gama in primary T lymphocytes via the WASP pathway .</a> eLife. , (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+histocompatibility+complex+class+II-expressing+endothelial+cells+induce+allospecific+nonresponsiveness+in+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Major histocompatibility complex class II-expressing endothelial cells induce allospecific nonresponsiveness in naive T cells.</a> J Exp Med. 183 (4), 1603-1612 (1996).</li>
<li>Ma, W., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells+effectively+costimulate+cytokine+production+by%2C+but+not+differentiation+of%2C+naive+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells effectively costimulate cytokine production by, but not differentiation of, naive CD4+ T cells.</a> J Immunol. 161 (5), 2158-2167 (1998).</li>
<li>Perez, V. L., Henault, L., Lichtman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+antigen+presentation%3A+stimulation+of+previously+activated+but+not+naive+TCR-transgenic+mouse+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">Endothelial antigen presentation: stimulation of previously activated but not naive TCR-transgenic mouse T cells.</a> Cell Immunol. 189 (1), 31-40 (1998).</li>
<li>Epperson, D. E., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+human+endothelial+cells.+Direct+activation+of+resting+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of human endothelial cells. Direct activation of resting CD8 T cells.</a> J Immunol. 153 (12), 5402-5412 (1994).</li>
<li>Shiao, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+memory+CD4%2B+T+cells+directly+recognize+allogeneic+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human effector memory CD4+ T cells directly recognize allogeneic endothelial cells in vitro and in vivo.</a> J Immunol. 179 (7), 4397-4404 (2007).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Okkenhaug, K., Mirenda, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-signal+model+for+T+cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">A two-signal model for T cell trafficking.</a> Trends Immunol. 28 (6), 267-273 (2007).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+diapedesis+is+initiated+by+invasive+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular diapedesis is initiated by invasive podosomes.</a> Immunity. 26 (6), 784-797 (2007).</li>
<li>Carman, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+for+transcellular+diapedesis%3A+probing+and+pathfinding+by+%27invadosome-like+protrusions%27%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms for transcellular diapedesis: probing and pathfinding by 'invadosome-like protrusions'.</a> J Cell Sci. 122 ((Pt 17)), 3025-3035 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Tseng, S. Y., Varma, R., Campi, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+immunological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell immunological synapses.</a> Curr Opin Immunol. 18 (4), 512-516 (2006).</li>
<li>Saito, T., Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+synapse+and+microclusters%3A+the+site+for+recognition+and+activation+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological synapse and microclusters: the site for recognition and activation of T cells.</a> Curr Opin Immunol. 18 (3), 305-313 (2006).</li>
<li>Gomez, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HS1+functions+as+an+essential+actin-regulatory+adaptor+protein+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">HS1 functions as an essential actin-regulatory adaptor protein at the immune synapse.</a> Immunity. 24 (6), 741-752 (2006).</li>
<li>Burbach, B. J., Medeiros, R. B., Mueller, K. L., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+signaling+to+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor signaling to integrins.</a> Immunol Rev. 218, 65-81 (2007).</li>
<li>Vicente-Manzanares, M., Sanchez-Madrid, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+during+leukocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton during leukocyte responses.</a> Nat Rev Immunol. 4 (2), 110-122 (2004).</li>
<li>Ma, Z., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+receptor+deformation+model+of+TCR+triggering%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">The receptor deformation model of TCR triggering.</a> Faseb J. 22 (4), 1002-1008 (2008).</li>
<li>Ma, Z., Sharp, K. A., Janmey, P. A., Finkel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface-anchored+monomeric+agonist+pMHCs+alone+trigger+TCR+with+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface-anchored monomeric agonist pMHCs alone trigger TCR with high sensitivity.</a> PLoS Biol. 6 (2), e43(2008).</li>
<li>Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bending+mechanics+and+molecular+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">Bending mechanics and molecular organization in biological membranes.</a> Annu Rev Phys Chem. 58, 697-717 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cell+receptor+activation+by+dynamic+membrane+binding+of+the+CD3epsilon+cytoplasmic+tyrosine-based+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cell receptor activation by dynamic membrane binding of the CD3epsilon cytoplasmic tyrosine-based motif.</a> Cell. 135 (4), 702-713 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kortom, dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen als i) weinig bestudeerd fysiologische APC&#39;s en ii) als een nieuw type &#39;vlakke cellulaire APC model&#39;. Wat het eerstgenoemde is geworden steeds duidelijk zijn dat niet-hematopoietische perifere (of &quot;stromale&quot;) APCs spelen cruciale, niet-redundante functies (bijv tegenover hematopoietische APCs) de vormgeving adaptieve immuunreacties 16-18. Onder dergelijke &#39;semi-professioneel &quot;APC&#39;s, va...

T lymfocyten een tak van het adaptieve immuunsysteem gekenmerkt door het vermogen om efficiënt te herkennen peptide-antigeen (Ag) gebonden aan major histocompatibility complex (MHC) moleculen door hun T-celreceptoren (TCR&#39;s) 1. Naïeve lymfocyten constitutief migreren en scannen &#39;professionele Ag presenterende cellen (APC&#39;s, bijvoorbeeld, dendritische cellen) in lymfeklieren, terwijl het geheugen / effector-T-cellen nodig hebben om effectief te overzien een zeer breed scala van APC&#39;s en potentieel doelwit cellen in perifere weefsels. In de min na de eerste opname van verwante Ag op een APC, lymfocyten arresteren hun migratie en beginnen aan een gespecialiseerde intieme cel-cel-interface genaamd &#39;immunologische synaps&#39; vormen (IS). Aanhoudende (dwz 30-60 min) IS contacten nodig zijn om te versterken en te ondersteunen signalering 2-7. Opkomende studies identificeren die binnen de IS, is de continue vorming en snelle remodeling van discrete sub-cellulaire signalering micro-clusters (dwz bevattende MHC / Ag-TCR, F-actine, adhesie en signaalmoleculen) de sterkte en de kwaliteit van de verkregen immuunreacties 07/02 bepalen. Echter, dynamische details en regulerend mechanisme van dit proces onvolledig begrepen 8,9. Dit vloeit grotendeels voort uit de technische uitdagingen in verband met onregelmatige topologieën van APC oppervlakken en slecht gecontroleerde oriëntatie van de cel-cel interactie vliegtuigen, kwesties die diep beperken de vereiste spatiotemporele imaging benaderingen 8-10 (Figure1A). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/53288/53288fig1.jpg" /> Figuur 1. Een Fysiologische Planar Cell APC Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics. Het schema illustreert traditionele beeldvorming van immunologische synaps tussen een T-cel en een professio<html> nal APC (A) en T-cel en een traditionele vlakke lipide dubbellaag APC model (B) in relatie tot deze nieuwe endotheliale vlakke APC model (C). Professionele APCs bieden fysiologische immunologische synapsen maar bieden weinig georiënteerde cel-interface (dat wil zeggen ten opzichte van de optimale xy beeldvlak; resolutie ~ 0,2 pm), die dramatisch compromissen ruimtelijke (z beeldvlak resolutie ~ 1 micrometer) en tijd (dat wil zeggen, vanwege de noodzaak om herhaaldelijk gescand door alle z beeldvlakken) oplossing van beeldvorming. Bilaag modellen hebben een vlakke topologie die optimale spatiotemporele beeldvorming resolutie voorziet, maar ook sterk vereenvoudigd, niet-fysiologische en rigide. Deze endotheelcellen model combineert de vlakke topologie van lipidendubbellagen met de fysiologische substraat van een klassieke APC om een ​​optimale ruimtelijke en temporele beeldvorming resolutie leveren in een fysiologische omgeving.m / files / ftp_upload / 53.288 / 53288fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken. Vorige werk is gedeeltelijk omzeild deze obstakels door het ontwikkelen vlakke ondergrond modellen (dwz lipidendubbellagen en antilichaam-gecoate oppervlakken) die optimale spatiotemporele resolutie (dwz bieden, via de vaststelling van de T-cel activatie oppervlak in een enkel plan dat parallel aan de optimale xy beeldvorming vliegtuig) 11-15 (Figuur 1B). Deze modellen hebben belangrijke inzichten vergemakkelijkt in de subcellulaire / moleculaire dynamica dat antigene signalering in T-cellen, met inbegrip van de ontdekking van dynamische actine / TCR signalering micro-clusters 7,11-14 controleren. Echter, dergelijke modellen inherent oversimplified, evenals stijve (evenwel de ontwikkeling / studie van 3-dimensionale topologische kenmerken) (Figuur 1B). Daarom blijft het onzeker hoe dergelijke bevindingen aan phy betreffensiologic cel-cel immune surveillance. Hoewel nog weinig bestudeerd, vasculaire en lymfatische endotheelcellen zijn in opkomst als een grote (dwz, groter in aantal dan alle professionele APC&#39;s, door ~ 1000-voudig) perifere compartiment van &#39;semi-professioneel &quot;APC&#39;s 16-18. Deze cellen brengen MHC-I, MHC-II en een veelheid aan co-stimulator moleculen (bijvoorbeeld CD40, LFA3, ICOSL, 4-1BB, OX40L, TL1A, PD-L1, maar niet CD80 en CD86) en strategisch gepositioneerd aan de bloed-weefsel interface waar ze dienen gespecialiseerde sentinel functies 16-18. Vorige studies aangetoond dat endotheelcellen effectief opnieuw stimuleren effector / geheugen, maar niet naïeve T-cellen 19-25. Aldus endotheelcellen waarschijnlijk unieke APC rollen in effector fase van adaptieve immuunreacties in de perifere weefsels, zoals lokale invloed op T-celactivering, differentiatie, geheugen en tolerantie 16,17,26. Critisch, wanneer gekweekt in vitro endotheliale cellen vormen vrijwel vlakke celoppervlakken en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Deze functies zijn ideaal voor hoge spatiotemporele resolutie beeldvorming van topologische dynamiek in cel-cel interacties 19,27. Zo endotheelcellen kunnen dienen als een fysiologische &quot;vlakke cellulaire APC-model duidelijk geschikt voor het onderzoek van de subcellulaire / moleculaire remodeling mechanismen antigeenherkenning drijven en te reguleren responsen (figuur 1C) 19,20. Eerder vastgestelde complementaire beeldvormingstechnieken (waaronder transfectie van endotheel cellen met fluorescent eiwit makers van de plasmamembraan en cytosol) voor het bestuderen van de details van leukocyt-endotheel interactie tijdens hechting en transendotheliale migratie 27, bleek dat leukocyten actief sonde het oppervlak van het endotheel door dynamische inbrengen van eend terugtrekken van sub-micron-schaal, actine-rijke cilindrische uitsteeksels (~ 200-1000 nm in diameter en diepte) genoemd invadosome-achtige uitsteeksels (dat wil zeggen, &#39;POPs&#39;) 27,28. Deze beeldvormingstechnieken zijn verder uitgebreid met de creatie protocollen te profiteren van endotheliale APC functie om de eerste werkwijzen voor spatiotemporele hoge resolutie afbeelding van de T-cel-endotheliale immunologische synaps gerapporteerde 19,20 ontwikkelen en verder hierin beschreven. Een centrale bevinding afgeleid van deze nieuwe vlakke cellulaire APC model is dat T-cel POPs functioneren, zowel in het bevorderen van de initiële Ag detectie en bij het instandhouden van de daaropvolgende signalering. Inderdaad, arrays van meerdere POPs (die werden gestabiliseerd en opgebouwd in reactie op calciumflux initiële) tonen verrijking in TCR en moleculen die wijzen op actieve signalering zoals PKC-Q, ZAP-70, fosfotyrosine en HS1. Daarom POPs lijken een driedimensionale fysiologische equivalent aan het TCR-signalering micro vertegenwoordigenclusters gezien op vlakke dubbellaag modellen. Deze aanpak, dus onthult gevoelig / rapporten moleculaire en architecturale (en impliciete biomechanische) dynamiek anders niet aantoonbaar. De hierin beschreven werkwijze moet nuttig zijn om de kloof tussen professionele APC en kunstmatige APC substraat modellen om ons vermogen om fundamentele mechanismen van adaptieve immuunreacties ondervragen verbeteren zijn. Hoewel hier de nadruk op de activatie van CD4 + Th1-type effector / geheugencel kan deze basisaanpak gemakkelijk worden aangepast aan een breed scala van T-cel soorten en Ags bestuderen, zoals hieronder besproken.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer stretch latex free tourniquet</td><td>BD Biosciences</td><td>367203</td><td></td></tr><tr><td>BD alcohol swabs</td><td>BD Biosciences</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Safety-Lok</td><td>BD Biosciences</td><td>367861</td><td>K2 EDTA</td></tr><tr><td>BD Vacutainer Push Button Blood Collection Set</td><td>BD Biosciences</td><td>367335</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1440-02</td><td>Breng voor gebruik naar RT</td></tr><tr><td>FCS-Optima</td><td>Atlanta Biologics</td><td>s12450</td><td>Heat geïnactiveerd</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>staphylococcal enterotoxin B</td><td>Toxin Technology</td><td>BT202RED</td><td>Stockoplossing 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>toxic shock syndrome toxin 1</td><td>Toxin Technology</td><td>TT606RED</td><td>Stockoplossing 1mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>human IL-15</td><td>R&amp;D Systems</td><td>247-IL-025</td><td>Stockoplossing 50ug/ml in PBS</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>Stockoplossing 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells</td><td>Lonza</td><td>CC-2543</td><td>Andere menselijke microvasculaire EC's kunnen worden gebruikt, d.w.z. HLMVEC's</td></tr><tr><td>EGM-2 MV bullet kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-4174</td><td>Stockoplossing 10x, verdunnen in PBS</td></tr><tr><td>amaxa-HMVEC-L Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>vpb1003</td><td>Vereiste kit voor stap 4</td></tr><tr><td>IFN-g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3265</td><td>Stockoplossing 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>TNF-alpha 10ug, human</td><td>Life Technologies</td><td>PHC3015</td><td>Stockoplossing 1mg/ml in H20</td></tr><tr><td>phenol Red-free HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175-103</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP299-100</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>Stockoplossing 1M in H20</td></tr><tr><td>Magnesium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208337</td><td>Stockoplossing 1M in H20</td></tr><tr><td>Human Serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6909-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Immersol 518 F fluorescence free Immersion oil</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM 20x50ug</td><td>Life Technologies</td><td>F1221</td><td>Stockoplossing 1mM in DMSO</td></tr><tr><td>pEYFP-Mem (Mem-YFP)</td><td>Clontech</td><td>6917-1</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer (Soluble Cytoplasmic DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632466</td><td></td></tr><tr><td>pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed)</td><td>Clontech</td><td>632512</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-Actin</td><td>Clontech</td><td>6116-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td>Toxisch, gebruik afzuigkap</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-5ML</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-70C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-49A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tissue Culture Treated Flasks T25</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Falcon Tissue Culture Treated Flasks T75</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Corning Cell Culture Treated T175</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-61&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-85&nbsp;</td><td>12 mm diameter</td></tr><tr><td>&nbsp;Falcon Tissue Culture Plates 24-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Delta-T plates</td><td>Bioptechs</td><td>04200415B</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Disposable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ICAM1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>555509</td><td></td></tr><tr><td>HS1 mouse anti-human</td><td>BD Biosciences</td><td>610541</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD11a (LFA-1alpha) Purified</td><td>ebioscience</td><td>BMS102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD3 Alexa Fluor&reg; 488</td><td>ebioscience</td><td>53-0037-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MHC Class II antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab55152</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Talin 1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab71333</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKC theta antibody&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab109481</td><td></td></tr><tr><td>phosphotyrosine (4G10 Platinum)</td><td>Millipore</td><td>50-171-463</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector II</td><td>Amaxa Biosystems</td><td></td><td>Vereiste elektroporatieapparaat voor stap 4</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM510&nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovison Software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU-425 (Series 60) Biological Safety Cabinet</td><td>NuAIRE</td><td>Nu-425-600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;Forma STRCYCLE 37 &deg;C, 5% CO2 Cell culture Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>202370</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>EW-02570-02</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;Z359629</td><td>Bright-Line Hemocytometer</td></tr><tr><td>Isotemp Waterbath model 202</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-2</td><td></td></tr></tbody></table>

een endotheliale planar cell model for imaging immunologische synapse dynamics

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptieve immuniteit wordt geregeld door dynamische interacties tussen T-cellen en antigeen-presenterende cellen (&quot;APC&#39;s&quot;) genoemd &quot;immunologische synapsen. Binnen deze intieme cel-cel-interfaces discrete sub-cellulaire clusters van MHC / Ag-TCR, F-actine, hechting en signaalmoleculen vormen en snel te verbouwen. Deze dynamiek wordt gedacht dat ze kritische factoren voor zowel de efficiëntie en kwaliteit van de immuunresponsen die zich ontwikkelen en dus van beschermende immuniteit tegen pathologische. Huidige begrip van immunologische synapsen met fysiologische APC&#39;s wordt beperkt door de ontoereikendheid van de verkregen beeldresolutie. Hoewel kunstmatig substraat modellen (bijvoorbeeld vlakke lipidendubbellagen) bieden een uitstekende resolutie en zijn zeer waardevolle hulpmiddelen geweest, ze zijn inherent niet-fysiologische en ongenuanceerd. Vasculaire en lymfatische endotheelcellen naar voren zijn gekomen als een belangrijke perifere weefsels (of stromale) compartiment van &#39;semi-beroepal APCs. Deze APC&#39;s (die het merendeel van de moleculaire machinerie van professionele APC&#39;s tot expressie) hebben de unieke eigenschap van het vormen nagenoeg vlak celoppervlak en gemakkelijk te transfecteren (bijvoorbeeld met fluorescente proteïne reporters). Hierin een fundamentele benadering van endotheelcellen als nieuw en fysiologische &quot;vlakke cellulaire APC model&quot; voor verbeterde beeldvorming en ondervraging van fundamentele antigene signaleringsprocessen uitvoering worden beschreven.

Een nieuwe imaging benadering middels endotheliale cellen en het combineren van de resolutie voordelen van de vlakke lipide dubbellagen model met de fysiologische complexiteit en vervormbaarheid van professionele APC werd ontwikkeld (figuur 1). Figuur 2 geeft voorbeelden van normale migratie, calcium flux en topologische dynamiek waargenomen met dit aanpak. Aangezien SAg op endotheel, SAg-specifieke CD4 + Th1 lymfocyten snel verspreiden, polar...

Adaptieve immuniteit wordt gecontroleerd door dynamische 'immunologische synapsen' gevormd tussen T-cellen en antigeen presenterende cellen. Dit protocol beschrijft methoden voor het onderzoeken van endotheelcellen, zowel als onderbelichte fysiologische APC's als ook als een nieuw type 'planair cellulair APC-model'.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Het algemene doel van deze techniek is om endotheelcellen te gebruiken als een nieuw type planair model voor antigeenpresenterende cellen om fundamentele antigenische signaleringsprocessen te onderzoeken. Deze methode kan ons helpen belangrijke vragen in het veld van de adaptieve immuniteit te beantwoorden, zoals de manier waarop subcellulaire en moleculaire remodelleringsdynamieken ruimtelijk en temporeel zijn gecoördineerd binnen de immunologische synaps. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het endotheel een vrijwel planaire PC-oppervlakte vormt.Dit maakt beeldvorming met een optimale spatiotemporele resolutie mogelijk binnen de context van een fysiologisch complex en vormbaar celoppervlak. Hoewel deze methode zich richt op de activatie van CD4-positieve Th1-effector memory-cellen, kan deze ook worden toegepast voor de studie van diverse T-celtypen, antigenen en signaleringsprocessen. Vandaag zullen Chris en ik u laten zien hoe u de procedure uitvoert. Begin met het cotransfecteren van primaire humane long- of dermale microvasculaire endotheelcellen met membraan-YFP en oplosbaar DsRed via nucleofectie, en zaai de getransfecteerde cellen uit op kweekplaten voor liv

an-endothelial-planar-cell-model-for-imaging-immunological-synapse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Hier tonen we methoden voor het verankeren van celadhesie eiwitten waarvan bekend is dat moduleren synapsvorming naar de bovenste folder van de lipide bilyer en synapsvorming met behulp van TIRF microscopie visualiseren.

Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

This video demonstrates live-cell imaging of immunological synapse topology, investigating the interactions between T lymphocytes and epithelial cells carrying fluorescent antigens. Fluorescence microscopy reveals red cytoplasm displacement and yellow membrane rings in endothelial cells, indicating the formation of immunological synapses.

Assessing Immunological Synapse Topology through Live-Cell Imaging

Source: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the use of confocal microscopy to visualize dendritic dynamics in live mouse retinal explants. It outlines the steps for stabilizing the retina under a confocal microscope, performing epifluorescence imaging to visualize starburst amacrine interneurons, and capturing...

Time-Lapse Confocal Imaging of Neuronal Dendritic Dynamics in Mouse Retinal Explants

Hier illustreren we het protocol voor beeldvorming door twee kleuren STED nanoscopy de cytotoxische immuun synaps van NK-cellen samengevat op glas. Met deze methode krijgen we sub-100 nm resolutie van synapseiwitten en het cytoskelet.

Visualisatie van de immunologische Synapse door Dual Color Time-gated stimulated emission depletion (STED) Nanoscopy

Leukocyten steken de endotheelcellen monolaag met behulp van de paracellulaire of de transcellulaire route. We ontwikkelden een eenvoudige test om te volgen de verdeling van endogene junctionele VE-cadherine en PECAM-1 tijdens de migratie van leukocyten onder fysiologische stroom te maken tussen de twee transmigratie routes.

Real-time beeldvorming van endotheelcellen-cel Junctions Tijdens Neutrophil Transmigration onder fysiologische Flow

We beschrijven hier een combinatie van de glas-ondersteunde lipide dubbellaagstechniek voor het vormen van immunologische synapsen met de superresolutie-beeldtechniek van gestimuleerde emissiedepletie (STED) microscopie. Het doel van dit protocol is gebruikers de nodige instructies te geven om deze twee technieken met succes uit te voeren.

Super-resolutie beeldvorming van de Natural Killer Cell Immunological Synapse op een glas-ondersteunde Planar lipidendubbellaag

Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.

Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry

Dit protocol beelden zowel de immunologische Synapse vorming en de daaropvolgende gepolariseerde secretoire verkeer naar de immunologische Synapse. Celconjugaten werden gevormd tussen een superantigen-gepulseerde Raji-cel (optredend als een antigeen-presentercel) en een Jurkat-kloon (optredend als effector helper T lymfocyten).

Imaging van de humane immunologische SYNAPS

Hier presenteren we het protocol voor de stapsgewijze reconstitutie van synthetische antigeen-presenterende cellen met behulp van Bead-Supported Lipid Bilayers en hun gebruik om de synaptische output van geactiveerde T-cellen te ondervragen.

Voorbereiding van door kralen ondersteunde lipide bilayers om de deeltjesoutput van T-cel immuunsynapsen te bestuderen

Ontdek een endotheliaal planair celmodel voor beeldvorming van immunologische synapsdynamica met hoge resolutie. Deze methode onthult T-celactiveringsmechanismen in adaptieve immuniteit.

Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Meer video's verkennen