Een endotheliale Planar Cell Model for Imaging Immunologische Synapse Dynamics

Het algemene doel van deze techniek is om endotheelcellen te gebruiken als een nieuw type planair antigeen presenterend celmodel om fundamentele antigene signaalprocessen te onderzoeken. Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen in het veld van adaptieve immuniteit te beantwoorden, zoals hoe subcellulaire en moleculaire hermodelleringsdynamiek ruimtelijk en tijdelijk wordt gecoördineerd binnen de immunologische synaps. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het endotheel van vrijwel planair een PC-oppervlak vormt.

Dit maakt beeldvorming mogelijk met optimale ruimtelijk-tijdelijke resolutie in de context van een fysiologisch complex en een formabel celoppervlak. Hoewel deze methode zich richt op CD vier positieve TH een effector geheugencel activering, kan deze ook worden toegepast voor de studie van een verscheidenheid aan T-celtypen, antigeen en signaalprocessen. Vandaag zullen Chris en ik je laten zien hoe je begint door primaire humane long- of dermale microvasculaire endotheelcellen te transecteren met membraan YFP en oplosbaar DS rood via NU nucleaire afwijking en de getransfecteerde cellen op levende celbeeldvormingscultuurplaten te plaatsen.

Vervang de volgende dag het celkweekmedium met vers medium aangevuld met interferon gamma om M MHC twee expressie op de endotheelcellen te induceren, gevolgd door stimulatie van de cellen met 20 nanogram per milliliter van TNF alfa 24 uur later op dag drie 30 tot 60 minuten. Voordat je met het experiment begint, incubeer het endotheel met een microgram per milliliter, elk van de bacteriële superantigenen stafylokokken enterotoxine B en toxisch shock syndroom toxine een bij 37 graden Celsius. Tijdens de incubatie, tel het aantal levensvatbare cellen van de belangrijke lymfocytcultuur en breng twee keer 10 tot de zesde van de cellen over in een 15 milliliter conische buis.

Spin vervolgens de cellen naar beneden en resuspendeer de pellet in twee milliliter vers bereide buffer A zodat er geen celclusters overblijven. Voeg vervolgens twee micromolair RA twee toe aan het T-cel monster, sluit de buis af en draai deze onmiddellijk om om de kleurstof homogeen te verdelen. Distribueer de kleurstof door de celsuspensie.

Na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius, spin de gelabelde lymfocyten naar beneden en resuspendeer de cellen voorzichtig maar grondig in 20 tot 40 microliters verse buffer A om de cellen levend af te beelden, zet het microscoopsysteem aan en open de geschikte software voor beeldregistratie. Stel de juiste parameters in voor geautomatiseerde multi-kanaals tijd-lapse beeldvorming, evenals het interval voor acquisitie gedurende 10 tot 30 seconden en een totale duur van ongeveer 20 tot 60 minuten. Voeg vervolgens vers olie toe aan het objectief.

Monteer een microscoopbakje met 0,5 milliliter buffer A op de verwarmingsfase adapter en zet onmiddellijk de adapter aan die eerder is ingesteld op 37 graden Celsius. Gebruik na twee tot drie minuten van equilibratie een 20 microliter pipette om de rustende RA twee beladen lymfocyten toe te voegen aan de gemonteerde microscoopbakjeskamer en zet het helderveldbeeld aan. Selecteer de lichtbaan naar de oculairen en gebruik de grove focusknop om het objectief in contact te brengen met de bodem van de microscoopbakje.

Gebruik vervolgens het oculaire en de fijne focusknop om de T-cellen te lokaliseren die zich aan de bodem van de bak bevinden en gebruik de XY-stadsbedieningselementen om een veld te selecteren dat minimaal 10 cellen bevat wanneer de juiste cellen zijn gevonden. Schakel over van helderveld naar de fluorescerende lichtbron en van IP-beeldvorming naar de CCD-camera. Optimaliseer de acquisitieparameters en verwerf vervolgens rustende Fira 2 3 40 en FIRA 2 3 80 beelden.

Een van de belangrijkste stappen om succesvolle resultaten te genereren is zorgvuldige optimalisatie van de fluorescentie-acquisitieparameters, ervoor zorgen dat voldoende signaal wordt verzameld en in het geval van fira twee, dat de baseline 3 43 80 verhouding dicht bij één ligt. Wanneer de FIRA twee belichtingstijden zijn ingesteld, vervang de bak met T-cellen door een microscoopbakje met endotheelcellen met behulp van een wegwerppipet verwijder snel het medium en spoel de cellen eenmaal met één milliliter voorverwarmde buffer A, vervang vervolgens de was met 0,5 milliliter verse buffer A. Gebruik het objectief om velden te identificeren waarin de helder fluorescerende endotheelcellen gezond lijken. Pas vervolgens de acquisitieparameters aan voor membraan YFP en DS RED zoals net voor fira twee is gedemonstreerd.

Zorg ervoor dat de gemiddelde fluorescente signaalintensiteit in elk kanaal tussen 25 en 75% van het dynamische bereik van de detector valt. Voordat u het levende celbeeldvormingsexperiment uitvoert, maakt u verschillende intervallen van afbeeldingen van de endotheelcellen alleen om een baseline te vestigen met de geautomatiseerde software. Breng vervolgens de punt van een klein volume in de media dicht bij het centrum van het objectief.

Breng langzaam vijf microliters geconcentreerd fira, twee beladen lymfocyten naar het centrum van het microscoopbakje beeldveld. Terwijl de lymfocyten zich nestelen, maak fijne aanpassingen aan de focus om ervoor te zorgen dat de T-cel-endotheelcel-interfaces in het focale vlak worden gehandhaafd. Met de 40 en 63 x objectieven is 10 tot 20 cellen per veld optimaal.

Na de gewenste observatie-interval, blijf beelden en pipet CIN direct in de microscoopbakje tot een eindconcentratie van twee micromolair om een maximale calciumflux sphera te induceren. Twee signaal. Bij het toepassen van behandelingen op cellen, zorg ervoor dat u scherp focust op het apicale membraan YFP-gelabelde oppervlak van het endotheel om een optimale resolutie van de immuunsynapse hermodellering te garanderen.

In afwezigheid van superantigeen op het endotheel verspreiden superantigeenspecifieke CD vier positieve TH een lymfocyten zich snel, polariseren en migreren lateraal over de endotheelcellen. Tijdens dit proces strekken de lymfocyten kortstondige uitsteeksels of ILP's uit in het endotheel