Explant Cultuur voor Ontwikkelingsstudies
Explantcultuur is een techniek waarbij levende cellen of weefsels uit een embryo worden verwijderd voor verdere ontwikkeling buiten het organisme. Dez…
Explantcultuur is een techniek waarbij hele weefsels en organen worden verwijderd, of 'explanteerd', uit een foetus of embryo en buiten het lichaam worden gekweekt, of 'ex vivo'. Deze methoden bieden een uniek venster om ons te helpen het ontwikkelingsproces te begrijpen door directe observaties van orgaan- en weefselgroei mogelijk te maken, een proces dat organogeneze wordt genoemd.
Deze video zal de basisprincipes van explantcultuur bekijken, belangrijke stappen van de procedure schetsen, typische manipulaties bespreken en specifieke toepassingen van deze techniek in ontwikkelingsstudies bieden.
Voordat we beschrijven hoe explanten worden gekweekt, laten we enkele van de principes achter deze techniek bekijken.
Explantcultuur is toepasbaar op een verscheidenheid aan embryonale weefsels van een breed scala aan organismen. Deze techniek is ideaal voor het onderzoek naar orgaanontwikkeling, omdat structurele veranderingen, bekend als morfogenese, direct kunnen worden waargenomen als functie van tijd. Bovendien kunnen weefsels worden behandeld met experimentele moleculen om hun impact op ontwikkeling te bepalen. Bovendien, wanneer explantcultuur wordt gecombineerd met moleculaire hulpmiddelen om genexpressie te veranderen en fluorescentiemicroscopie, wordt het een krachtig hulpmiddel voor het beantwoorden van vragen over cel- en weefseldifferentiatie.
Laten we nu een protocol bekijken voor explantcultuur van zoogdierweefsels.
Om de procedure te starten, worden embryo's verwijderd uit een geëuthanaseerd zwanger knaagdier. Na verwijdering van de omliggende membranen wordt het embryo geïsoleerd. De weefsels of organen van belang worden vervolgens geïsoleerd uit het geëxtraheerde embryo en overgebracht naar platen voor groei. Media met antibiotica worden toegevoegd en de platen worden gekweekt in een incubator ingesteld op 37°C. Weefsalexplanten zijn nu klaar voor manipulatie.
Zodra explantculturen zijn gevestigd, kunnen verschillende soorten manipulaties worden uitgevoerd.
Bijvoorbeeld, het explantatieweefsel kan genetisch worden gemanipuleerd om de rol van een gen van belang op een specifiek ontwikkelingsproces te testen. Dit kan worden bereikt door genetisch materiaal in het weefsel te introduceren met behulp van technieken zoals elektroporatie, waarbij een elektrisch veld wordt gebruikt om geïnjecteerd DNA in nabijgelegen cellen te drijven.
Explanten worden ook vaak gebruikt om de rollen te testen die signaalmoleculen, zoals groeifactoren, spelen in organogeneze. Weefsel gekweekt in vitro is bijzonder nuttig voor dit soort studies omdat behandeling met de verbinding zo eenvoudig is als het toevoegen ervan aan het kweekmedium. Echter, kleine kralen gedrenkt in experimentele verbindingen kunnen ook in het weefsel worden geïmplanteerd voor een meer gecontroleerde aanpak van chemische behandeling.
Ongeacht de aanpak, is een groot voordeel van de explanttechniek dat de effecten van experimentele manipulaties gemakkelijk in real time kunnen worden gevisualiseerd, met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie.
Laten we nu enkele specifieke toepassingen van ex vivo cultuur bekijken.
Ten eerste vertegenwoordigen explanten een modelsysteem waarin weefselontwikkeling direct kan worden gevisualiseerd. Bijvoorbeeld, deze onderzoekers verwijderden de zich ontwikkelende alvleesklier uit embryonale muizen en kweekten deze op glazen bodemplatjes voor betere beeldvorming.
De ontwikkeling van het weefsel kan worden waargenomen door lichtmicroscopie, maar het gebruik van transgeen weefsel dat fluorescerende markers tot expressie brengt, biedt een nog gedetailleerdere weergave van ontwikkelingsprocessen, zoals tubuluskieming. Explanteerd weefsel kan ook worden onderworpen aan immunokleuring, waardoor onderzoekers de ontwikkeling van specifieke celtypen kunnen monitoren, zoals de insulineproducerende cellen die hier in blauw en groen worden getoond.
Een andere toepassing van explantculturen is om de rol van specifieke moleculen, zoals groeifactoren, in organogeneze te helpen ontcijferen.
Hier werden foetale longexplanten gedissecteerd uit E12.5 muisembryo's gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van een groeifactor gedurende maximaal 48 uur. De resultaten geven aan dat deze groeifactor de luchtwegvorming in de foetale long remmt.
Ten slotte kunnen explanten van vroege embryo's worden gebruikt om de mechanismen te bepalen die de genregulatie controleren tijdens de eerste stadia van embryogenese.
Deze onderzoekers explanteerden twee verschillende celtypen uit de 16-cellig fase van kikkerembryo's: degenen die bestemd zijn om dorsale structuren te vormen en degenen die zullen bijdragen aan ventrale structuren. De explanten werden ongeveer een dag lang ontwikkeld voorafgaand aan kleuring om het expressiepatroon van een gen specifiek voor dorsaal weefsel te karakteriseren.
Aangezien de expressie van dit gen alleen werd waargenomen in explanten van het dorsale gebied, werd geconcludeerd dat genregulatieprogramma's in deze embryonale cellen waren gecodeerd, in plaats van te worden aangestuurd door cel-cel interacties die later in de ontwikkeling plaatsvinden.
We hebben nu explantcultuursystemen bekeken en geobserveerd hoe het kan worden gebruikt in ontwikkelingsstudies. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel dat ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dierlijke ontwikkeling vergemakkelijkt. Bedankt voor het bekijken!
Explantcultuur is een techniek waarbij hele weefsels en organen worden verwijderd, of 'explanteerd', uit een foetus of embryo en buiten het lichaam worden gekweekt, of 'ex vivo'. Deze methoden bieden een uniek venster om ons te helpen het ontwikkelingsproces te begrijpen door directe observaties van orgaan- en weefselgroei mogelijk te maken, een proces dat organogeneze wordt genoemd.
Deze video zal de basisprincipes van explantcultuur bekijken, belangrijke stappen van de procedure schetsen, typische manipulaties bespreken en specifieke toepassingen van deze techniek in ontwikkelingsstudies bieden.
Voordat we beschrijven hoe explanten worden gekweekt, laten we enkele van de principes achter deze techniek bekijken.
Explantcultuur is toepasbaar op een verscheidenheid aan embryonale weefsels van een breed scala aan organismen. Deze techniek is ideaal voor het onderzoek naar orgaanontwikkeling, omdat structurele veranderingen, bekend als morfogenese, direct kunnen worden waargenomen als functie van tijd. Bovendien kunnen weefsels worden behandeld met experimentele moleculen om hun impact op ontwikkeling te bepalen. Bovendien, wanneer explantcultuur wordt gecombineerd met moleculaire hulpmiddelen om genexpressie te veranderen en fluorescentiemicroscopie, wordt het een krachtig hulpmiddel voor het beantwoorden van vragen over cel- en weefseldifferentiatie.
Laten we nu een protocol bekijken voor explantcultuur van zoogdierweefsels.
Om de procedure te starten, worden embryo's verwijderd uit een geëuthanaseerd zwanger knaagdier. Na verwijdering van de omliggende membranen wordt het embryo geïsoleerd. De weefsels of organen van belang worden vervolgens geïsoleerd uit het geëxtraheerde embryo en overgebracht naar platen voor groei. Media met antibiotica worden toegevoegd en de platen worden gekweekt in een incubator ingesteld op 37°C. Weefsalexplanten zijn nu klaar voor manipulatie.
Zodra explantculturen zijn gevestigd, kunnen verschillende soorten manipulaties worden uitgevoerd.
Bijvoorbeeld, het explantatieweefsel kan genetisch worden gemanipuleerd om de rol van een gen van belang op een specifiek ontwikkelingsproces te testen. Dit kan worden bereikt door genetisch materiaal in het weefsel te introduceren met behulp van technieken zoals elektroporatie, waarbij een elektrisch veld wordt gebruikt om geïnjecteerd DNA in nabijgelegen cellen te drijven.
Explanten worden ook vaak gebruikt om de rollen te testen die signaalmoleculen, zoals groeifactoren, spelen in organogeneze. Weefsel gekweekt in vitro is bijzonder nuttig voor dit soort studies omdat behandeling met de verbinding zo eenvoudig is als het toevoegen ervan aan het kweekmedium. Echter, kleine kralen gedrenkt in experimentele verbindingen kunnen ook in het weefsel worden geïmplanteerd voor een meer gecontroleerde aanpak van chemische behandeling.
Ongeacht de aanpak, is een groot voordeel van de explanttechniek dat de effecten van experimentele manipulaties gemakkelijk in real time kunnen worden gevisualiseerd, met behulp van licht- of fluorescentiemicroscopie.
Laten we nu enkele specifieke toepassingen van ex vivo cultuur bekijken.
Ten eerste vertegenwoordigen explanten een modelsysteem waarin weefselontwikkeling direct kan worden gevisualiseerd. Bijvoorbeeld, deze onderzoekers verwijderden de zich ontwikkelende alvleesklier uit embryonale muizen en kweekten deze op glazen bodemplatjes voor betere beeldvorming.
De ontwikkeling van het weefsel kan worden waargenomen door lichtmicroscopie, maar het gebruik van transgeen weefsel dat fluorescerende markers tot expressie brengt, biedt een nog gedetailleerdere weergave van ontwikkelingsprocessen, zoals tubuluskieming. Explanteerd weefsel kan ook worden onderworpen aan immunokleuring, waardoor onderzoekers de ontwikkeling van specifieke celtypen kunnen monitoren, zoals de insulineproducerende cellen die hier in blauw en groen worden getoond.
Een andere toepassing van explantculturen is om de rol van specifieke moleculen, zoals groeifactoren, in organogeneze te helpen ontcijferen.
Hier werden foetale longexplanten gedissecteerd uit E12.5 muisembryo's gekweekt in de aanwezigheid of afwezigheid van een groeifactor gedurende maximaal 48 uur. De resultaten geven aan dat deze groeifactor de luchtwegvorming in de foetale long remmt.
Ten slotte kunnen explanten van vroege embryo's worden gebruikt om de mechanismen te bepalen die de genregulatie controleren tijdens de eerste stadia van embryogenese.
Deze onderzoekers explanteerden twee verschillende celtypen uit de 16-cellig fase van kikkerembryo's: degenen die bestemd zijn om dorsale structuren te vormen en degenen die zullen bijdragen aan ventrale structuren. De explanten werden ongeveer een dag lang ontwikkeld voorafgaand aan kleuring om het expressiepatroon van een gen specifiek voor dorsaal weefsel te karakteriseren.
Aangezien de expressie van dit gen alleen werd waargenomen in explanten van het dorsale gebied, werd geconcludeerd dat genregulatieprogramma's in deze embryonale cellen waren gecodeerd, in plaats van te worden aangestuurd door cel-cel interacties die later in de ontwikkeling plaatsvinden.
We hebben nu explantcultuursystemen bekeken en geobserveerd hoe het kan worden gebruikt in ontwikkelingsstudies. Deze techniek is een krachtig hulpmiddel dat ons begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan dierlijke ontwikkeling vergemakkelijkt. Bedankt voor het bekijken!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is explant culture and why is it used in developmental studies?
Explant culture is a technique where tissues or organs are removed from embryos and cultured outside the body, or ex vivo. This approach allows researchers to directly observe organogenesis—the growth and structural changes of developing organs—while manipulating tissues with experimental molecules. It provides a unique window into developmental processes that cannot be easily studied in living organisms.
Q2: How are explant tissues isolated and prepared for culture?
Embryos are removed from euthanized pregnant rodents and surrounding membranes are carefully removed. The tissues or organs of interest are isolated from the extracted embryo and transferred to culture plates. Media containing antibiotics are added, and plates are incubated at 37°C. Once established, explant cultures are ready for experimental manipulation and observation.
Q3: What genetic techniques can be used to manipulate explant cultures?
Explanted tissues can be genetically manipulated using techniques like electroporation, where an electrical field drives injected DNA into cells to test gene roles in development. This approach, combined with molecular developmental biology and growth factors, allows researchers to determine how specific genes influence organogenesis and tissue differentiation in real time.
Q4: How do researchers use chemical treatments in explant culture experiments?
Signaling molecules like growth factors can be added directly to culture media for simple treatment, or small beads soaked in experimental compounds can be implanted into tissue for more controlled delivery. A major advantage is that effects of these chemical manipulations can be easily visualized in real time using light or fluorescent microscopy.
Q5: What imaging methods help visualize development in explant cultures?
Light microscopy allows direct observation of tissue development on glass-bottom dishes. Transgenic tissues expressing fluorescent markers provide detailed views of developmental processes like tubule budding. Immunostaining enables researchers to monitor specific cell types during development, such as insulin-producing cells, offering multiple visualization approaches for studying organogenesis.
Q6: How can explants from early embryos reveal gene expression patterns?
Explants from specific embryonic regions can be cultured separately and stained to characterize gene expression patterns. By comparing expression in different tissue types—such as dorsal versus ventral regions—researchers determine whether gene expression programs are encoded within embryonic cells or directed by later cell-cell interactions during development.
Q7: What specific developmental questions can explant culture help answer?
Explant cultures help decipher roles of specific molecules in organogenesis, such as how growth factors inhibit or promote airway formation in fetal lung tissue. They also reveal mechanisms controlling gene expression during early embryogenesis and allow direct visualization of morphogenesis—structural changes in developing tissues—making them powerful tools for understanding molecular mechanisms underlying animal development.