Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo's

Het algemene doel van deze procedures is om aan te tonen hoe cellen of DNA nauwkeurig kunnen worden overgebracht naar vroege post-implantatie muisembryo's. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het testen van het in vivo potentieel van in vitro gekweekte cellen en de functies van bepaalde genen in specifieke embryonale stadia. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze geen gespecialiseerde apparatuur vereisen en experimentele manipulaties van vroege posering planten muisbryo mogelijk maken Na het opofferen van een zwangere vrouw op dag E 7.5 of E 8.5 volgens het tekstprotocol, gebruik schaar en pincetten om de baarmoeder te isoleren en plaats deze in een 30 millimeter schotel gevuld met M twee medium met twee paar fijne pincetten.

Scheur voorzichtig het myometrium uit elkaar, pel vervolgens de decidua af, zorg ervoor dat u de extra-embryonale holtes niet puncteert. Verwijder het riker-membraan door het met pincetten te knijpen en het langzaam van het embryo te scheiden. Controleer vervolgens onder een stereo dissectiemicroscoop of de embryo's intact zijn om ervoor te zorgen dat de dooierzak amnion en op placentale kegel intact zijn. Breng de embryo's met een pipet over naar een schone schotel van M twee en plaats ze op een 30 millimeter plastic petrischaaldeksel op ijs of een ijsplatform om de embryo's gedeeltelijk af te koelen.

Bereid het kweekmedium voor en kweek embryo's volgens het tekstprotocol om gekweekte cellen in muisembryo's te enten. Begin met het gebruik van een 200 microliter pipettepunt om eblast-stamcellen, die overal GFP tot expressie brengen, fysiek te schrabben van een zes-well kweekplaat. Breng de cellen over in de schotel met de embryo's.

Bevestig een handgetrokken verbindingskapillaris aan de aspiratorbuis om een mondpipet te maken, zuig voorzichtig het mondpipet om een ​​of meer celklompjes van meer dan 20 cellen in de verbindingskapillaris te trekken. Blaas vervolgens voorzichtig de cellen uit om grote klompen te verspreiden. Selecteer een klomp met ongeveer 10 tot 20 cellen en trek deze in de verbindingskapillaris.

Houd de klomp weer dicht bij de opening van de capillair met een paar pincetten. Houd het embryo losjes op zijn plaats en steek de verbindingskapillaris in het gewenste gebied. Om een opening te maken.

Druk voorzichtig de klomp uit de verbindingskapillaris, waardoor de korte draad van 10 tot 20 cellen in het embryo wordt vastgezet. Laat de embryo's in dezelfde schotel met M twee medium en gebruik een fluorescentie-samengesteld dissectiemicroscoop en camera om de geënte embryo's te beeld. Houd de beeldacquisitietijd tot een minimum om overmatige blootstelling van de embryo's aan licht en warmte te voorkomen.

Direct na het beeldvormen met een pasta, breng de embryo's over met een minimaal volume van M twee medium naar vooraf geëquilibreerd kweekmedium en kweek volgens de richtlijnen in het tekstprotocol. Voordat u elektroporeringsexperimenten uitvoert, gebruikt u een horizontale micropipetpool om DNA-injectiepipetten met een fijne punt en een opening van minder dan 10 micrometer te trekken. Om weefselbeschadiging te voorkomen. Voor elektroporering van glascapillairen, gebruik een microsmeedijzer om de opening van de DNA-injectiepipetten te snijden tot een interne diameter van 20 of 30 micrometer met een schone punt en geen gebroken randen. Bevestig elke platina-elektrode aan een dunne geïsoleerde draad en steek deze in een microinjectienaaldenhouder bedekt met isolatietape.

Om een handgemaakte capillaire elektrode te bereiden, steekt u een 0,2 millimeter diameter platinadraad in een elektroporeringsglascapillair met een vaste opening van 20 of 30 micrometer in diameter. Om de elektrische stroom te richten en de plasma-DNA naar een klein gebied van belang in het embryo te leveren. Maak een L-vormige elektrode door een 0,2 millimeter diameter platinadraad te buigen, waardoor een L-vorm ontstaat met de horizontale lijn van de L ongeveer een millimeter lang.

Monteer de naaldhouders op standaard micro-manipulatie-instrumenthouders. Verbind de capillaire elektrode met de anode van de voeding. Verbind de L-vormige elektrode met de anode van de multimeter.

Verbind vervolgens de kathode van de multimeter met de kathode van de voeding. Vul de elektroporeringsglascapillair met PBS tot binnen een tot twee millimeter van de bovenkant en steek de rechte platina-elektrode in de glascapillair totdat deze de bodem van de capillair bereikt. Bevestig de L-vormige elektrode op het oppervlak van de 30 millimeter petrischaal gevuld met PBS.

Gebruik een pneumatische pico-pomp voor DNA-injectie. Steek de injectienaald van de laterale eblast in de vruchtwaterholte van het embryo en injecteer ongeveer vijf microliters DNA-oplossing in de holte of totdat deze volledig gevuld is. Zorg ervoor dat het embryo niet barst.

Plaats vervolgens het embryo voorzichtig tussen de elektroden en beweeg de capillaire elektrode naar de precieze locatie waar de DNA moet worden afgeleverd. Elektroporeer het embryo met 200 volt in zes pulsen van elk 50 milliseconden duur, met een interval van één seconde tussen elke puls. Breng het embryo onmiddellijk over naar vooraf geëquilibreerd kweekmedium voordat u de elektroporering voor het volgende embryo herhaalt.

Detecteer geelektroporeerde levende of dode cellen twee uur na elektroporering. Volgens het tekstprotocol dat hier wordt getoond, is een embryo met epi PSC's die overal EGFP tot expressie brengen, geënt op E 7.5 en gedurende 24 uur ex vivo gekweekt. Wanneer 10 tot 16 fscs werden geënt in E 7.5 embryo's, werden ze goed ingebouwd en geprolifereerden ze in het gastheerembryo.

Echter, het geven van meer cellen resulteert niet in betere chimerisme en resulteert in feite in niet-incorporatieve klonten zoals hier wordt aangetoond. Zoals getoond in deze elektroporering van GFP-expresserende plasmiden. GFP-positieve cellen werden een tot twee uur na elektroporering gedetecteerd.

Toen distale eblast-cellen in het embryo in het late primitieve streepstadium werden geëlektroporeerd, droegen gelabelde cellen bij aan de neurale derm na