Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo's
December 25th, 2015
We demonstreren een methode voor het enten van gekweekte cellen in specifieke delen van vroege muis-embryo's om hun in vivo potentieel te bepalen. We introduceren ook een geoptimaliseerde elektroporatiemethode die glazen capillairen van bekende diameter gebruikt, waardoor de nauwkeurige levering van exogeen DNA in een paar cellen in de embryo's mogelijk wordt.
Het algemene doel van deze procedures is om aan te tonen hoe cellen of DNA nauwkeurig kunnen worden overgebracht naar vroege post-implantatie muisembryo's. Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie, zoals het testen van het in vivo potentieel van in vitro gekweekte cellen en de functies van bepaalde genen in specifieke embryonale stadia. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat ze geen gespecialiseerde apparatuur vereisen en experimentele manipulaties van vroege posering planten muisbryo mogelijk maken Na het opofferen van een zwangere vrouw op dag E 7.5 of E 8.5 volgens het tekstprotocol, gebruik schaar en pincetten om de baarmoeder te isoleren en plaats deze in een 30 millimeter schotel gevuld met M twee medium met twee paar fijne pincetten.
Scheur voorzichtig het myometrium uit elkaar, pel vervolgens de decidua af, zorg ervoor dat u de extra-embryonale holtes niet puncteert. Verwijder het riker-membraan door het met pincetten te knijpen en het langzaam van het embryo te scheiden. Controleer vervolgens onder een stereo dissectiemicroscoop of de embryo's intact zijn om ervoor te zorgen dat de dooierzak amnion en op placentale kegel intact zijn. Breng de embryo's met een pipet over naar een schone schotel van M twee en plaats ze op een 30 millimeter plastic petrischaaldeksel op ijs of een ijsplatform om de embryo's gedeeltelijk af te koelen.
Bereid het kweekmedium voor en kweek embryo's volgens het tekstprotocol om gekweekte cellen in muisembryo's te enten. Begin met het gebruik van een 200 microliter pipettepunt om eblast-stamcellen, die overal GFP tot expressie brengen, fysiek te schrabben van een zes-well kweekplaat. Breng de cellen over in de schotel met de embryo's.
Bevestig een handgetrokken verbindingskapillaris aan de aspiratorbuis om een mondpipet te maken, zuig voorzichtig het mondpipet om een of meer celklompjes van meer dan 20 cellen in de verbindingskapillaris te trekken. Blaas vervolgens voorzichtig de cellen uit om grote klompen te verspreiden. Selecteer een klomp met ongeveer 10 tot 20 cellen en trek deze in de verbindingskapillaris.
Houd de klomp weer dicht bij de opening van de capillair met een paar pincetten. Houd het embryo losjes op zijn plaats en steek de verbindingskapillaris in het gewenste gebied. Om een opening te maken.
Druk voorzichtig de klomp uit de verbindingskapillaris, waardoor de korte draad van 10 tot 20 cellen in het embryo wordt vastgezet. Laat de embryo's in dezelfde schotel met M twee medium en gebruik een fluorescentie-samengesteld dissectiemicroscoop en camera om de geënte embryo's te beeld. Houd de beeldacquisitietijd tot een minimum om overmatige blootstelling van de embryo's aan licht en warmte te voorkomen.
Direct na het beeldvormen met een pasta, breng de embryo's over met een minimaal volume van M twee medium naar vooraf geëquilibreerd kweekmedium en kweek volgens de richtlijnen in het tekstprotocol. Voordat u elektroporeringsexperimenten uitvoert, gebruikt u een horizontale micropipetpool om DNA-injectiepipetten met een fijne punt en een opening van minder dan 10 micrometer te trekken. Om weefselbeschadiging te voorkomen. Voor elektroporering van glascapillairen, gebruik een microsmeedijzer om de opening van de DNA-injectiepipetten te snijden tot een interne diameter van 20 of 30 micrometer met een schone punt en geen gebroken randen. Bevestig elke platina-elektrode aan een dunne geïsoleerde draad en steek deze in een microinjectienaaldenhouder bedekt met isolatietape.
Om een handgemaakte capillaire elektrode te bereiden, steekt u een 0,2 millimeter diameter platinadraad in een elektroporeringsglascapillair met een vaste opening van 20 of 30 micrometer in diameter. Om de elektrische stroom te richten en de plasma-DNA naar een klein gebied van belang in het embryo te leveren. Maak een L-vormige elektrode door een 0,2 millimeter diameter platinadraad te buigen, waardoor een L-vorm ontstaat met de horizontale lijn van de L ongeveer een millimeter lang.
Monteer de naaldhouders op standaard micro-manipulatie-instrumenthouders. Verbind de capillaire elektrode met de anode van de voeding. Verbind de L-vormige elektrode met de anode van de multimeter.
Verbind vervolgens de kathode van de multimeter met de kathode van de voeding. Vul de elektroporeringsglascapillair met PBS tot binnen een tot twee millimeter van de bovenkant en steek de rechte platina-elektrode in de glascapillair totdat deze de bodem van de capillair bereikt. Bevestig de L-vormige elektrode op het oppervlak van de 30 millimeter petrischaal gevuld met PBS.
Gebruik een pneumatische pico-pomp voor DNA-injectie. Steek de injectienaald van de laterale eblast in de vruchtwaterholte van het embryo en injecteer ongeveer vijf microliters DNA-oplossing in de holte of totdat deze volledig gevuld is. Zorg ervoor dat het embryo niet barst.
Plaats vervolgens het embryo voorzichtig tussen de elektroden en beweeg de capillaire elektrode naar de precieze locatie waar de DNA moet worden afgeleverd. Elektroporeer het embryo met 200 volt in zes pulsen van elk 50 milliseconden duur, met een interval van één seconde tussen elke puls. Breng het embryo onmiddellijk over naar vooraf geëquilibreerd kweekmedium voordat u de elektroporering voor het volgende embryo herhaalt.
Detecteer geelektroporeerde levende of dode cellen twee uur na elektroporering. Volgens het tekstprotocol dat hier wordt getoond, is een embryo met epi PSC's die overal EGFP tot expressie brengen, geënt op E 7.5 en gedurende 24 uur ex vivo gekweekt. Wanneer 10 tot 16 fscs werden geënt in E 7.5 embryo's, werden ze goed ingebouwd en geprolifereerden ze in het gastheerembryo.
Echter, het geven van meer cellen resulteert niet in betere chimerisme en resulteert in feite in niet-incorporatieve klonten zoals hier wordt aangetoond. Zoals getoond in deze elektroporering van GFP-expresserende plasmiden. GFP-positieve cellen werden een tot twee uur na elektroporering gedetecteerd.
Toen distale eblast-cellen in het embryo in het late primitieve streepstadium werden geëlektroporeerd, droegen gelabelde cellen bij aan de neurale derm na
Overzicht
Deze studie demonstreert een methode voor het enten van gekweekte cellen in vroege muis-embryo's en introduceert een geoptimaliseerde elektroporatietechniek voor DNA-bezorging. Deze methoden zijn bedoeld om het in vivo potentieel van gekweekte cellen en genfuncties tijdens embryonale ontwikkeling te verkennen.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Celbiologie
- Embryologie
Achtergrond
- Het begrijpen van celgedrag in vivo is cruciaal voor de ontwikkelingsbiologie.
- Ent- en elektroporatietechnieken kunnen inzicht geven in genfuncties.
- Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur, waardoor ze toegankelijk zijn.
- Eerdere studies hebben wisselend succes laten zien met celincorporatie in embryo's.
Doel van Studie
- Om nauwkeurige cel- en DNA-overdracht in muis-embryo's te demonstreren.
- Om het in vivo potentieel van gekweekte cellen te beoordelen.
- Om de effecten van elektroporatie op genexpressie in embryo's te evalueren.
Gebruikte Methoden
- Isolatie van vroege post-implantatie muis-embryo's.
- Enten van gekweekte cellen met behulp van een met de hand getrokken capillair.
- Elektroporatie van embryo's met plasmide DNA met behulp van aangepaste elektroden.
- Beeldvorming van geënte embryo's om integratie en levensvatbaarheid te beoordelen.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle enting van gekweekte cellen in embryo's werd bereikt.
- Elektroporatie resulteerde in detecteerbare expressie van GFP in doelwittende cellen.
- Cellincorporatie varieerde met het aantal geënte cellen.
- Enige mate van celdood werd waargenomen na elektroporatie.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden zijn effectief voor het bestuderen van celgedrag in vivo.
- Geoptimaliseerde elektroporatie kan genbezorging in embryonale studies vergemakkelijken.
- Meer onderzoek is nodig om deze technieken te verfijnen voor betere resultaten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables precise delivery of cells or DNA into early postimplantation mouse embryos, supporting functional validation of genetic targets and assessment of cultured cell phenotypes in a physiologically relevant context. By allowing in situ analysis of genetic manipulations during gastrulation and organogenesis, it provides mechanistic insights that can de-risk target validation and phenotypic screening efforts in early discovery. The approach requires no specialized equipment, enhancing accessibility for laboratories seeking to bridge in vitro findings with in vivo relevance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Tests the in vivo developmental potential of in vitro cultured cell populations, informing target relevance and phenotypic fidelity.
- Operational Value: Enables spatial and temporal control of genetic perturbations to interrogate gene function in specific embryonic lineages.
- Predictive Value: Supports assessment of whether cultured cells accurately model in vivo behavior, reducing false positives in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts on cell incorporation, proliferation, and localization following grafting or electroporation.
- Operational Value: Uses standardized glass capillaries of defined diameter to ensure reproducible DNA delivery and transfection efficiency.
- Assay Readiness: Produces ex vivo cultured embryos suitable for imaging and analysis of differentiation outcomes after perturbation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro cell manipulations to in vivo developmental outcomes, supporting biomarker-aligned phenotypic assessment.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of genetic modifications on cell fate decisions within the native embryonic microenvironment.
- Predictive Confidence: Allows correlation of electroporation efficiency with downstream phenotypic contributions, such as neural lineage derivation from primitive streak cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling hypothesis testing in embryogenesis following target identification and preceding lead optimization, particularly for pathways governing cell fate and differentiation.
- Discovery Biology: Facilitates interrogation of gene function in specific embryonic stages and regions, supporting pathway validation and target de-risking.
- Screening: Delivers quantitative transfection metrics via capillary electroporation, allowing comparison of construct efficacy and toxicity.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts (e.g., GFP expression) to quantify transfection success and cell survival post-manipulation.
- Translational Research: Connects cultured cell behavior to embryonic integration, informing the translational relevance of in vitro models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs or cell phenotypes across multiple embryonic timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of targets through direct assessment of genetic and cellular perturbations in situ.
- Operational Value: High reproducibility due to standardized capillary dimensions and minimal equipment requirements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by validating target function in a developing mammalian system.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on in vivo phenotypic validation from early embryonic models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo dissection, microsurgery, and fluorescence microscopy.
- Depends on glass capillary preparation and electrode fabrication for electroporation.
- Necessitates standardized culture conditions (M2 medium) and timed embryo isolation (E7.5–E8.5).
- Involves optimization of DNA concentration and pulse parameters to balance transfection efficiency with viability.
- Limited by embryo accessibility post-grafting and the need for ex vivo culture to assess outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Dissecting E7.5 or E8.5 Postimplantation Embryos for ex vivo Culture
2:03
Grafting Cultured Cells into E7.5 or E8.5 Mouse Embryos
3:42
Handmade Electroporation Materials and Apparatus Setup
5:19
Electroporation of E7.5 or E8.5 Embryos
6:44
Results: Localized Cell and DNA Transfer into Mouse Embryos
8:15
Conclusion
