Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een niet-nucleaire fractie, verrijkt met replicatiecompartimenten gevormd in adenovirus-geïnfecteerde cellen, voor de gedetailleerde bestudering van hun samenstelling, ultrastructuur en geassocieerde activiteiten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de DNA-virologie, zoals de studie naar moleculaire mechanismen die de replicatie en expressie van het virale genoom controleren, welke op hun beurt afhankelijk zijn van replicatiecompartimenten voor de regulatie van interacties tussen het virus en de gastheercel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige procedure is op basis van een snelheidsgradiënt om een celvrij systeem te creëren dat geschikt is voor het bestuderen van de mechanismen waarmee in de kern replicerende DNA-virussen de controle over de geïnfecteerde cel overnemen.

Om deze assay uit te voeren, bereidt u eerst adenovirus type 5 of Ad5 en menselijke voorhuidfibroblasten of HFF voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Begin met het infecteren van 10⁷ HFF in 100 millimeter weefselkweekschalen met gebruik van 1 milliliter DMEM per schaal bij een MOI van 30 focus-vormende eenheden of FFU per cel. Incubeer de cellen gedurende twee uur in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Schud de schalen voorzichtig elke 15 minuten om een homogene distributie van het virusinoculum over de cellen te garanderen. Verwijder na incubatie het medium en voeg vers DMEM toe.

Aangevuld met 10% FBS, waarna de cellen 16, 24 of 36 uur worden geïncubeerd met behulp van een celscraper. Oogst de geïnfecteerde cellen en de controlecellen voorzichtig na infectie en verzamel de celsuspensie in steriele centrifugebuisjes op ijs. Tel de cellen met een neubauerkamer en centrifugeer de cellen vervolgens 5 minuten bij 220 ×g bij 4 °C.

Resuspendeer vervolgens de celpellet in vijf milliliter ijskoud PBS; centrifugeer en was de cellen drie keer in vijf milliliter ijskoud PBS, waarbij de wassupernatanten worden weggegooid om de cellen te lyseren. Resuspendeer de celpellet in 700 µL ijskoud hypotoon buffer met protease-remmers en laat de cellen drie uur op ijs zwellen. Homogeniseer de cellen vervolgens met 10 tot 20 neerwaartse slagen met een Teflon stamper type A.

Controleer het lysaat periodiek elke 20 slagen onder de microscoop om de cellyse te bewaken. Herhaal dit proces gedurende ongeveer 80 slagen totdat alle cellen succesvol zijn opengebroken. Centrifugeer vervolgens het homogenaat bij 300 ×g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.

Bewaar het supernatant bij -20 °C in een buis als de cytoplasmatische fractie om celresten te scheiden van de kernresten. Suspendeer de pellet in 750 µL 0,25 M sucrose-oplossing één. Pipetteer 750 µL 0,35 M sucrose-oplossing twee in een centrifugebuis en laag het resuspendeerde homogenaat voorzichtig bovenop oplossing twee. Centrifugeer het sucrosekussen bij 1400 ×g bij 4 °C gedurende vijf minuten en verwijder vervolgens het supernatant.

Resuspendeer de pellet in 750 µL van oplossing twee om te lyseren. Sonicate de nucleaire suspensie in een ultrasoon bad, gehouden op of onder 4 °C, in twee pulsen van vijf minuten. Controleer de nucleaire lyse onder een lichtveldmicroscoop tussen de pulsen door en sonicate verder totdat de kernen volledig zijn gelyseerd.

Pipette vervolgens 750 µL van 0,88 M sucrose-oplossing drie in een centrifugebuis en breng de nucleaire lysaatoplossing in lagen aan over oplossing drie. Centrifugeer het lysaat bij 3000 ×g bij 4 °C gedurende 10 minuten. De 1,5 mL supernatant is de nucleoplasmatische fractie, die wordt bewaard bij -70 °C.

Resuspendeer vervolgens de pellet in 700 µL van oplossing twee. Dit is de 85 replicatiecompartiment-fractie of RCF van de gastheerkern, die eveneens wordt bewaard bij -70 °C. Om te beginnen met de immunofluorescentieanalyse, voegt u een druppel van 5 µL RCF toe aan een met zoutoplossing gecoate glazen objectglas.

Laat de druppel aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 microliters PBS toe in een druppel naast de plek en kantel het objectglas zodat de PBS over de plek stroomt. Giet de PBS van het objectglas af.

Blok vervolgens de monsterplek gedurende twee uur bij kamertemperatuur met 500 µL PBS bevatten 5% bovine serum albumine. Om de overtollige blokkeringsoplossing te verwijderen, voegt u voorzichtig 500 µL PBS toe aan het monster op de objectglasplaat, zonder direct op het monster te pipetteren. Voer deze wasstap drie keer uit.

Voeg vervolgens 20 microliters van de verdunde primaire antilichaam tegen het virale E two A DNA-bindende eiwit toe op de monsterplek. Dek het objectglas af om verdamping te voorkomen en incubeer het in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Was het monster nu drie keer voorzichtig met PBS bevatten 0.02%tween 20.

Vermijd het direct pipetteren op het monster na deze wasstappen. Voeg 20 µL fluoro four-geconjugeerd muis secundair antilichaam direct toe aan het monster en incubeer dit gedurende één uur bij 4 °C. Voeg in een bevochtigingskamer 500 µL PBS met 0,02% Tween 20 toe aan de objectglazen, waarbij opnieuw moet worden vermeden om direct op het monster te pipetteren.

Voeg vervolgens twee µL monteervloeistof toe en plaats een dekglas omgekeerd over het monster. Kit de zijkanten van de dekglasjes af met nagellak. Bekijk het preparaat onder een fluorescentiemicroscoop met een 63 x objectief bij de gewenste golflengte die specifiek is voor de gebruikte fluoro four; het resultaat van de immunofluorescentie van het adenovirale E2A DNA-bindende eiwit of DBP wordt hier getoond.

De DBP-bevattende structuren zijn subnucleaire virale rc; let op dat de E2A-DBP gelokaliseerd is binnen de RC en groen verschijnt. Daarnaast werd de verrijking van viraal DNA in de RCF bevestigd via PCR door de RCF te vergelijken met de nucleoplasmatische fractie of NPL op 24 en 36 uur na infectie. Het virale GNA werd selectief aangetroffen in de RCF en niet in de NPL.

De bijbehorende tekst voor aanvullend bewijs van adenovirale MNA in de RCF. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes uur worden voltooid, vanaf het moment dat de geïnfecteerde cellen worden geoogst tot de isolatie van de RCF, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de monsters altijd op ijs te bewaren en de stappen voor homogenisatie van de kern, isolatie, sonicatie en isolatie van de subnucleaire fractie te monitoren via lichtmicroscopie. Volg deze procedure.

Andere methoden, zoals R-T-P-C-R en transmissie-elektronenmicroscopie, kunnen worden uitgevoerd om de regulatie van de virale genexpressie in verband met de virale replicatiecompartimenten en de ultrastructuur van deze partikels te bestuderen. Deze techniek heeft de potentie om de weg vrij te maken voor onderzoekers op het gebied van DNA-tumorvirologie om moleculaire mechanismen te verkennen die de celcyclusregulatie veranderen en de virale replicatie in menselijke cellen bevorderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale replicatiecompartimenten uit geïnfecteerde celkernen kunnen worden geïsoleerd om morfologische, functionele en compositionele studies uit te voeren naar deze virus-geïnduceerde structuren.

Vergeet niet dat werken met een SAN-indicator gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van gehoorbescherming, tijdens het uitvoeren van deze procedure.