Name: Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Leer de isolatie van virale replicatiecompartimenten uit adenovirus-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze methode gebruikt een snelheidsgradiënt om sub-nucleaire fracties te verrijken voor virologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van CONACyT-SEP (SEP-2008-84582; CB-2011-01-168497) en Promep-SEP voor R.A.G.; P.H. ontving een beurs van CONACyT (447442).

1. HFF Cell Cultuur en Ad-infectie <ol><li> Propageren Ad5 WT virus in monolagen van HEK-293-cellen en titer als fluorescerende eenheden (FFU) op HFF cellen zoals eerder beschreven 8. </li><li> Groei humane voorhuid fibroblasten (HFF) in 10 ml DMEM / 10% foetaal runderserum (FBS) in steriele kweek 100 mm schalen bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator. Bepaal het aantal cellen met een Neubauer kamer door het tellen van cellen in de vier 16-square sets. Het aantal cellen per ml wordt verkregen door het gemiddelde aantal cellen in de vier 16-square sets en dit aantal te vermenigvuldigen met 10 4. Voor iedere keer na infectie in stap 1,3, gebruik 1 x 10 7 HFF cellen. </li><li> Mock-infecteren infecteren HFF cellen met adenovirus type 5 (Ad5) wild-type (WT) (H5pg4100 8) in 100 mm weefselkweekplaten gebruik 1 ml van Ad5 in DMEM per schaaltje met een MOI van 30 Focus Forming Unit of FFU per cel. Incubeer 2 uur in ahumidified celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO 2 voorzichtig schommelen van de gerechten elke 15 min een homogene verdeling van het virus inoculum over de cellen te waarborgen. Hierna verwijdert het medium vervangen door vers DMEM aangevuld met 10% FBS en incubeer gedurende 16, 24 of 36 uur in een bevochtigde celkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Ga verder met stap 2.1. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Sub-nucleaire Fracties verrijkt met Adenovirus RC <ol><li> Oogst Ad5-besmet of mock-geïnfecteerde HFF cellen met een cel scrapper en het verzamelen van de cellen in steriele centrifugebuizen. Bepaal het aantal cellen zoals in stap 1,2. Gebruik 1 x 10 7 cellen voor elke keer na infectie opgegeven in stap 1.3. </li><li> Centrifugeer de cellen bij 220 xg, 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer de celpellet in ijskoud PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4 en 1,8 mM KH 2PO 4). Was celpellets 3 maal gebruik 5 ml ijskoude PBS per wasbeurt. Daartoe centrifuge de cellen bij 220 xg, 4 ° C gedurende 5 min De bovendrijvende vloeistof (SN) weggooien en resuspendeer de celpellet door voorzichtig pipetteren. </li><li> Om het plasmamembraan verstoren, resuspendeer de celpellet in 700 pl ijskoude hypotonische buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCI, 1,5 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 20 μ g / ml fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L -argininal) en laat de cellen zwellen op ijs gedurende 3 uur. </li><li> Lyse van de cellen met behulp van een homogenisator met een loszittende Een type teflon stamper. Voer 80 dounce beroertes en beeldscherm monsters per 20 slagen per helderveld microscopie zodat alle cellen zijn gelyseerd, maar nuclei not is beschadigd of gescheurd. </li><li> Centrifugeer de cel homogenaat bij 300 xg, 4 ° C gedurende 5 min. Bewaar de SN de cytoplasmatische fractie bij -20 ºC in een centrifugebuis. </li><li> Om celresten uit kernen te verwijderen, resuspendeer de pellet in 750 μ l oplossing 1 (S1) (0,25 M sucrose, 10 mM MgCl2 20 μ g / ml PMSF, een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal) en laag over een gelijk volume van oplossing 2 (S2) (0,35 M sucrose, 0,5 mM MgCl2, 20 μ g / ml PMSF, een mengsel van cysteïne, serine, threonine en aspartyl protease remmers waaronder 10 μ g / ml runder alvleesklier trypsine inhibitor, 10 μ g / ml pepstatine A en 10 μ g / ml N-acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-argininal). Centrifuge bij 1400 xg, 4 ° C gedurende 5 minuten. </li><li> Gooi de SN met behulp van een micropipet. Vermijd de pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de pellet met geïsoleerde kernen in 750 μ l van S2. </li><li> Om subnucleaire fracties verrijkt met adenovirus RC (RCF) isoleren Sonificeer geresuspendeerd kernen met een ultrasoon bad, 5 min met twee pulsen, of totdat alle kernen zijn gelyseerd zoals waargenomen met helderveld microscopie. Gebruik ijs in ultrasoon bad nodig om monsters op of onder 4 ° C houden. </li><li> Laag het gesoniceerd kernen over een gelijk volume oplossing 3 (S3) (0,88 M sucrose, 0,5 mM MgCl2) en centrifugeer bij 3000 xg, 4 ° C gedurende 10 min. Bewaar de 1,5 ml supernatant als nucleoplasmatische fractie (Npl) bij -70 ° C. Resuspendeer de pellet in 700 μ l van S2 en opslag als RCF bij -70 ° C. </li></ol> 3. Western Blot Analyse van RCF LET OP: Voor de Western Blot analyse van Npl en RCF fracties set opzij 640 pi voor Npl en 300 μ l voor RCF uit de totale verkregen in stap 2.11 volume. <ol><li> Meng 15 μ l van elk subnucleaire fractie in Laemmli buffer 2x (4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol, 0,004% broomfenolblauw, 0,125 M Tris-HCl pH 6,8) en koken bij 95 ° C gedurende 5 min. Plaats de monsters in een 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) denaturerende gel en gescheiden eiwitten gedurende 1,5 uur bij 20 milliampère (mA). </li><li> Overdracht eiwitten door elektroblotten gedurende 1,5 uur bij 400 mA op polyvinylideendifluoride (PVDF) membranen. </li><li> Blok membraan gedurende 2 uur bij KT middels 3% magere droge melk in PBS. </li><li> Incubeer O / N bij 4 ° C met primair antilichaam tegen virale E2A-DNA-bindend eiwit (B6-8 9) bij een 1: 500 verdunning in PBS / 0,3% magere melkpoeder. </li><li> Was membraan 3 maal met PBS / 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten. </li><li> Incubeer het membraan met de muis anti-IgG een secundairetibody gekoppeld aan mierikswortelperoxidase (HRP) bij een 1: 10.000 verdunning in PBS gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was het membraan 3 maal met PBS / 0,1% Tween 20 gedurende 10 minuten. </li><li> Ontwikkel het membraan met behulp van versterkte chemiluminescentie en röntgenfilms. </li></ol> 4. Virale DNA Detection in RCF LET OP: Voor DNA isolatie van zowel Npl en RCF fracties, gebruiken 210 μ l voor Npl en 100 μ l voor RCF van het totaal verkregen in stap 2.11 volume. <ol><li> Incubeer sub-nucleaire fracties gedurende 1 uur bij 55 ° C met 1 mg / ml proteïnase K en 0,5% Tween 20. </li><li> Inactiveer proteinase K door de monsters te incuberen gedurende 10 min bij 95 ° C. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g bij kamertemperatuur 2 min. </li><li> Verzamel de SN. Precipiteren van het DNA met 1/10 volume 3M natriumacetaat en één volume isopropanol O / N bij 4 ° C. </li><li> Centrifugeer de monsters bij 20.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min. </li><li> Gooi de SN uzingen een micropipet. Was de pellet met 70% ethanol en centrifugeer bij 20.000 xg, 4 ° C gedurende 5 min. </li><li> Resuspendeer het DNA in 10 μ l 10 mM Tris-HCl pH 7,4 </li><li> Kwantificeren DNA met een spectrofotometer door het meten van de optische dichtheid (OD) bij 260 nm. </li><li> Viraal DNA amplificeren, gebruik 100 ng DNA uit elke subnucleaire fractie in een standaard PCR-reactie met gebruikmaking van Taq DNA-polymerase in 25 μ l reactievolume met primers die de amplificatie van een gebied binnen de major late transcriptie-eenheid toe, van nucleotide 7273 tot nucleotide 7353 (81 bp) (Fw: GAGCGAGGTGTGGGTGAGC; Rv: GGATGCGACGACACTGACTTCA). Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: Initiële denaturatie gedurende 3 minuten bij 95 ° C, gevolgd door 20 cycli van amplificatie (1 min bij 95 ° C, hybridisatie gedurende 1 minuut bij 62 ° C en verlenging gedurende 30 seconden bij 72 ° C) en een laatste verlenging stap 3 min bij 72 ° C. </li><li> Voer het PCR product in 2% agarose gels, bij 90 V. Stain met ethidiumbromide in 0,5 μ g / ml eindconcentratie en visualiseren DNA viraal DNA verrijking bevestigen in de RCF. Handvat ethidiumbromide met uiterste voorzichtigheid en zorgen er altijd voor om handschoenen te dragen, aangezien deze verbinding is een krachtige mutagene stof. Gooi ethidiumbromide volgens de institutionele richtlijnen. </li></ol> 5. Laat Viraal mRNA detectie in RCF LET OP: Voor de RNA-isolatie van zowel Npl en RCF fracties, gebruiken 640 μ l voor Npl en 300 μ l voor RCF uit de totale verkregen in stap 2.11 volume. <ol><li> Isoleren RNA uit subnucleaire fracties Trizol gebruik volgens de instructies van de fabrikant. Resuspendeer de RNA in 50 μ l DEPC (diethilpyrocarbonate) behandelde water. </li><li> Kwantificeren van de RNA met behulp van een spectrofotometer de OD bij 260 nm te meten (ongeveer 3 μ g worden verkregen). Bewaar het RNA in 50 ng / gl aliquots bij -70 ° C. </li><li> Controleer gezuiverd RNAde afwezigheid van DNA-contaminatie door het uitvoeren van een controle-PCR reactie in afwezigheid van reverse transcriptase (RT), gebruik 5 ng totaal RNA en cyclusomstandigheden in stap 4.9 beschreven. <ol><li> Als DNA verontreiniging afwezig geen amplicon worden geproduceerd. Als DNA verontreiniging aanwezig is, incubeer de monsters met 10 U DNase I, 10 U RNase inhibitor, 0,1 M Tris-HCl pH 8,3, 0,5 M KCl en 15 mM MgCl2 gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Ga opnieuw isoleren RNA zoals in stap 5,1. </li></ol></li><li> Virale mRNA geassocieerd met RCF analyseren amplificeren 100 ng RNA uit elke fractie subnucleaire door RT-PCR met behulp van primers ontworpen om adenovirale late mRNA van verschillende genfamilies (tabel 1) te detecteren. <ol><li> Voor reverse transcriptie (RT), gebruikt 100 ng RNA uit elke fractie subnucleaire in een standaard RT-reactie met M-MuLV RT enzym in 20 μ l reactievolume gedurende 1 uur bij 42 ° C en 10 min bij 70 ° C. </li><li> Voor versterking, gebruik 1μ l van het cDNA in PCR-reacties, zoals in stap 4,9. Gebruik de volgende cyclusomstandigheden: Initiële denaturatie gedurende 3 minuten bij 95 ° C, gevolgd door 25 cycli van amplificatie (1 min bij 95 ° C, hybridisatie gedurende 1 min bij de in tabel 1 en de verlenging 30 seconden bij 72 ° C temperatuur) en een laatste verlenging stap gedurende 3 min bij 72 ° C. </li></ol></li><li> Voer de RT-PCR-producten in 2% agarosegels, op 90 V. Stain gels met ethidiumbromide bij 0,5 μ g / ml uiteindelijke concentratie en visualiseren om virale late mRNA associatie met het RCF bevestigen. Behandel ethidiumbromide zoals in stap 4.10. </li></ol> 6. Immunofluorescentie Visualisatie van RCF Opmerking: Voer nu deze procedure onder een laminaire stroming kast contaminatie van monsters met eventuele stofdeeltjes te voorkomen, en alle oplossingen filteren vóór gebruik. <ol><li> Spot 5 gl van de RCF fractie verkregen in stap 2.10 directly een silaan beklede slide. </li><li> Laat de vlek drogen gedurende ongeveer 5 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Rehydrateren door langzaam en indirect pipetteren 500 μ l PBS in een druppel naast de RCF plek en te laten stromen door het kantelen van de dia. Afvoer van het overtollige PBS vanaf de zijkant. </li><li> Blok door het bedekken van het monster met 500 μ l van PBS / 5% runderserumalbumine (BSA) gedurende 2 uur bij KT. </li><li> Was de dia 3 keer door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia voor de afvoer van het overtollige PBS. </li><li> Incubeer het monster met het primaire antilichaam tegen virale E2A-DNA-bindend eiwit (B6-8 9) bij een 1: 500 verdunning in PBS gedurende 2 uur bij KT. Bedek de bevlekte monster met 20 μ l van de antilichaamoplossing en incuberen in een vochtige kamer om uitdrogen te voorkomen. </li><li> Was het monster 3 keer met PBS / 0,02% Tween 20 door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia tap de exproces wasoplossing. </li><li> Incubeer de monsters met muizen anti-IgG secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorofoor die wordt geëxciteerd bij 488 nm in een 1: 2000 verdunning in PBS, gedurende 1 uur bij 4 * C. Bedek de bevlekte monster met 20 μ l van de antilichaamoplossing en incuberen in een vochtige kamer om uitdrogen te voorkomen. </li><li> Was het monster 3 keer met PBS / 0,02% Tween 20 door voorzichtig en indirect pipetteren 500 μ l PBS op het monster. Kantel de dia voor de afvoer van het overtollige wasoplossing. </li><li> Bedek de gespot monster op de dia met een dekglaasje met behulp van 2 μ l PBS / 10% glycerol als montage medium. Seal met duidelijke nagellak en slaan al -20 ºC. </li><li> Analyseer de monsters met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een 63x objectief en een 1,4 numerieke apertuur (NA) bij een golflengte van 488 nm. </li></ol>

<ol><li>Doucas, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+replication+is+coupled+with+the+dynamic+properties+of+the+PML+nuclear+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Dev%22%5BJournal%5D)">Adenovirus replication is coupled with the dynamic properties of the PML nuclear structure.</a> Genes & Dev. 10, 196-207 (1996).</li>
<li>Schmid, M., Speiseder, T., Dobner, T., Gonzalez, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+virus+replication+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">DNA virus replication compartments.</a> J. Virol. 88, 1404-1420 (2014).</li>
<li>Boon, J. A., Diaz, A., Ahlquist, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+viral+replication+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic viral replication complexes.</a> Cell host microbe. 8, 77-85 (2010).</li>
<li>Paul, D., Hoppe, S., Saher, G., Krijnse-Locker, J., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+biochemical+characterization+of+the+membranous+hepatitis+C+virus+replication+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Morphological and biochemical characterization of the membranous hepatitis C virus replication compartment.</a> J. Virol. 87, 10612-10627 (2013).</li>
<li>Busch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Nucleoli%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of Nucleoli.</a> Exp Cell Res. 24, Suppl 9. 150-163 (1963).</li>
<li>Lam, Y. W., Lyon, C. E., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+isolation+of+Cajal+bodies+from+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale isolation of Cajal bodies from HeLa cells.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 2461-2473 (2002).</li>
<li>Lam, Y. W., Trinkle-Mulcahy, L., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The nucleolus.</a> J Cell Sci. 118, 1335-1337 (2005).</li>
<li>Groitl, P., Dobner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+adenovirus+type+5+early+region+1+and+4+virus+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Construction of adenovirus type 5 early region 1 and 4 virus mutants.</a> Methods Mol Med. 130, 29-39 (2007).</li>
<li>Reich, N. C., Sarnow, P., Duprey, E., Levine, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+which+recognize+native+and+denatured+forms+of+the+adenovirus+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies which recognize native and denatured forms of the adenovirus DNA-binding protein.</a> Virology. 128, 480-484 (1983).</li>
<li>Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+on+adenovirus+late+gene+expression+of+deleting+the+E1b+55K+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Selective effects on adenovirus late gene expression of deleting the E1b 55K protein.</a> J Gen Virol. 74 (Pt 4), 575-582 (1993).</li>
<li>Gonzalez, R., Huang, W., Finnen, R., Bragg, C., Flint, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+E1B+55-kilodalton+protein+is+required+for+both+regulation+of+mRNA+export+and+efficient+entry+into+the+late+phase+of+infection+in+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus E1B 55-kilodalton protein is required for both regulation of mRNA export and efficient entry into the late phase of infection in normal human fibroblasts.</a> J. Virol. 80, 964-974 (2006).</li>
<li>Castillo-Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mre11+Cellular+Protein+Is+Modified+by+Conjugation+of+Both+SUMO-1+and+SUMO-2%2F3+during+Adenovirus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Virology%22%5BJournal%5D)">The Mre11 Cellular Protein Is Modified by Conjugation of Both SUMO-1 and SUMO-2/3 during Adenovirus Infection.</a> ISRN Virology. 2014, 14(2014).</li>
<li>Morris, S. J., Scott, G. E., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+late-phase+infection+is+controlled+by+a+novel+L4+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Adenovirus late-phase infection is controlled by a novel L4 promoter.</a> J. Virol. 84, 7096-7104 (2010).</li>
<li>Wright, J., Leppard, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+adenovirus+5+L4+promoter+is+activated+by+cellular+stress+response+protein+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The human adenovirus 5 L4 promoter is activated by cellular stress response protein p53.</a> J. Virol. 87, 11617-11625 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om de moleculaire mechanismen die de regulatie van cellulaire activiteiten door virale infectie bepalen, te verduidelijken, zou het begrijpen van de samenstelling en activiteiten geassocieerd met RC van essentieel belang zijn. Daarom, om een gedetailleerde analyse van RC te maken, hebben we een celvrij systeem opgezet dat gebruikmaakt van de grootte en biochemische samenstelling van deze door virus geïnduceerde structuren, om subnucleaire fracties verrijkt met RC te isoleren met behulp van een eenvoudige procedure die ve...

Adenovirussen een dubbelstrengs DNA-genoom, dat repliceert in de geïnfecteerde celkern. Als het virale DNA de kern binnengaat, is gelokaliseerd grenzend aan PML kernlichaampjes 1. Naar aanleiding van de virale vroege genexpressie, wordt de nucleaire architectuur drastisch gereorganiseerd, het induceren van de vorming van virale micro-omgevingen, zogenaamde virale replicatie compartimenten (RC) 2. Sinds adenovirus (Ad) RC zijn sites waar virale genoom replicatie en expressie van virale late genen plaatsvinden, ze bieden een omgeving voor de aanwerving van alle noodzakelijke virale en cellulaire factoren die deelnemen aan deze processen. Interessant is dat een verscheidenheid aan cellulaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de cellulaire antivirale respons, zoals de DNA-schade reactie de aangeboren immuunrespons en tumorsuppressie samen worden gekozen om deze virale plaatsen 2. Daarom kan Ad RC worden beschouwd regelgeving hubs die een efficiënte virale replicatie te bevorderen, terwijl tegelijkertijd de regulering van decellulaire antivirale respons, wat aangeeft dat deze structuren zijn de sleutel tot het begrip van virus-gastheer cel interacties. Niettemin, de moleculaire mechanismen van RC vorming, de samenstelling en de bijbehorende activiteiten worden slecht begrepen. Adenovirale RC, en RC uit andere DNA-virussen die repliceren in de kern wordt niet geassocieerd met membranen, in tegenstelling tot cytoplasmatische RC 3. Bovendien zijn deze virus-geïnduceerde structuren waarschijnlijk geheel bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren. RC gevormd in cellen geïnfecteerd met RNA-virussen (gewoonlijk aangeduid als virale fabrieken) zijn geïsoleerd, profiteren van hun cytoplasmatische lokalisatie en membraangebonden status waarin de gedetailleerde morfologische, functionele en biochemische karakterisatie 4 is vergemakkelijkt. Voor zover wij weten, zijn virale kern RC niet geïsoleerd, misschien vanwege de complexiteit van de nucleaire architectuur en afwezigheid van intranucleaire membranes dat hun isolatie zou vergemakkelijken. Hun studie heeft vertrouwd in plaats daarvan op immunofluorescentiemicroscopie, vis en transmissie elektronen microscopie. Echter, ondanks de complicaties die inherent zijn aan het isoleren subnucleaire structuren, andere nucleaire domeinen zoals nucleoli en Cajal organen zijn geïsoleerd voordat 5,6. Aangezien nucleoli en RC zijn beide samengesteld uit eiwitten en nucleïnezuren, en een diameter tussen 0,5 - 5 pm, veronderstelden we dat RC ook vatbaar afzonderlijk te beoordelen. Teneinde de moleculaire samenstelling en functies in verband met RC preciezer te karakteriseren hebben we een nieuwe werkwijze voor subnucleaire fracties verrijkt met RC isoleren. Daartoe hebben we bereid sub-nucleaire fracties behulp snelheidsgradiënten en sucrose kussens Soortgelijke procedures voor nucleoli 7 of andere nucleaire domeinen 6 isoleren en werd een celvrij systeem dat de studie van de moleculaire samenstelling en bijbehorende activiteiten mogelijk maaktRC. Deze techniek dient derhalve vooraf het begrip van virus-gastheer cel interacties en vormt een krachtig instrument dat ook een gedetailleerde analyse van RC dient te vergemakkelijken van andere virussen die repliceren in de kern en induceren de vorming van replicatie compartimenten van soortgelijke afmetingen aan die gevormd in adenovirus geïnfecteerde cellen, zoals herpesvirussen, papillomavirussen en polyomavirussen.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12100-046</td><td>Opwarmen in een 37 &ordm;C waterbad voor gebruik</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, Ultra Pure</td><td>Research Organics</td><td>0928S</td><td>Bereid een 2.55 M stockoplossing en bewaar bij 4 &ordm;C</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Kontess Glass Company</td><td>884900-0000</td><td></td></tr><tr><td>Branson 1800 Ultrasoon Bad</td><td>Branson</td><td>Z769533&nbsp;SIGMA</td><td>15 min voor gebruik inschakelen.</td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG1 Secundaire Antistof, Alexa Fluor 488 conjugaat</td><td>Life Technologies</td><td>A-21121</td><td>Gebruik bij een 1:2.000 verdunning in PBS</td></tr><tr><td>Silane-Prep Slides</td><td>Sigma</td><td>S4651-72EA</td><td>Open in een laminaire flow kast</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>34080</td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

Tijdens infectie van menselijke cellen door adenovirus (Ad) wordt de celkern van de gastheercellen dramatisch gereorganiseerd, wat leidt tot de vorming van nucleaire micro-omgevingen door de aanwerving van virale en cellulaire eiwitten op locaties die worden bezet door het virale genoom. Deze sites, replicatiecompartimenten (RC) genoemd, kunnen worden beschouwd als door virus geïnduceerde nucleaire domeinen waar het virale genoom is gelokaliseerd en virale en cellulaire eiwitten die deelnemen aan replicatie, transcriptie en post-transcriptionele verwerking worden gerekruteerd. Bovendien worden cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij de antivirale respons, zoals tumorsuppressoreiwitten, DNA-schaderespons (DDR) componenten en factoren van de aangeboren immuunrespons, ook meegeteld naar RC. Hoewel RC een cruciale rol lijken te spelen om een efficiënte en productieve replicatiecyclus te bevorderen, is er geen gedetailleerde analyse gemaakt van hun samenstelling en bijbehorende activiteiten. Om het onderzoek naar adenovirale RC en mogelijk die van andere DNA-virussen die zich in de celkern repliceren, te vergemakkelijken, hebben we een eenvoudige procedure aangepast op basis van snelheidsgradienten om Ad RC te isoleren en een celvrij systeem opgesteld dat geschikt is voor morfologische, functionele en samenstellingsstudies van deze door virus geïnduceerde subnucleaire structuren, evenals om hun impact op gastheercelinteracties te bestuderen.

Aangezien virale replicatie compartimenten (RC) zijn subnucleaire viraal geïnduceerde structuren bestaande uit eiwitten en nucleïnezuren, vergelijkbaar met andere nucleaire domeinen, bleken zij vatbaar voor isolatie te worden door snelheidsgradiënten gebaseerd op biochemische kenmerken. Kritische stappen van de fractionering protocol worden geïllustreerd in figuur 1. Bij elke stap de monsters moeten worden gevolgd met helderveld microscopie om de integriteit van de verschillende subcellulaire fracties w...

We bieden een nieuwe strategie om virale replicatiecompartimenten (RC) te isoleren van adenovirus (Ad)-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze aanpak vertegenwoordigt een celvrij systeem dat kan helpen om de moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en -expressie reguleren, evenals de regulatie van virale-gastheerinteracties die in het RC worden gevestigd, te verduidelijken.

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een niet-nucleaire fractie, verrijkt met replicatiecompartimenten gevormd in adenovirus-geïnfecteerde cellen, voor de gedetailleerde bestudering van hun samenstelling, ultrastructuur en geassocieerde activiteiten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van de DNA-virologie, zoals de studie naar moleculaire mechanismen die de replicatie en expressie van het virale genoom controleren, welke op hun beurt afhankelijk zijn van replicatiecompartimenten voor de regulatie van interacties tussen het virus en de gastheercel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige procedure is op basis van een snelheidsgradiënt om een celvrij systeem te creëren dat geschikt is voor het bestuderen van de mechanismen waarmee in de kern replicerende DNA-virussen de controle over de geïnfecteerde cel overnemen.Om deze assay uit te voeren, bereidt u eerst adenovirus type 5 of Ad5 en menselijke voorhuidfibroblasten of HFF voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol. Begin met het infecteren van 10⁷ HFF in 100 millimeter weefselkweekschalen met gebruik van 1 milliliter DMEM per schaal bij een MOI van 30 focus-vormende eenheden of FFU per cel. Incubeer de cellen gedurende twee uur in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Schud de schalen voorzichtig elke 15 minuten om een homogene distributie van het virusinoculum over de cellen te garanderen. Verwijder na incubatie het medium en voeg vers DMEM toe.Aangevuld met 10% FBS, waarna de cellen 16, 24 of 36 uur worden geïncubeerd met behulp van een celscraper. Oogst de geïnfecteerde cellen en de controlecellen voorzichtig na infectie en verzamel de celsuspensie in steriele centrifugebuisjes op ijs. Tel de cellen met een neubauerkamer en centrifugeer de cellen vervolgens 5 minuten bij 220 ×g bij 4 °C.Resuspendeer vervolgens de celpellet in vijf milliliter ijskoud PBS; centrifugeer en was de cellen drie keer in vijf milliliter ijskoud PBS, waarbij de wassupernatanten worden weggegooid om de cellen te lyseren. Resuspendeer de celpellet in 700 µL ijskoud hypotoon buffer met protease-remmers en laat de cellen drie uur op ijs zwellen. Homogeniseer de cellen vervolgens met 10 tot 20 neerwaartse slagen met een Teflon stamper type A.Controleer het lysaat periodiek elke 20 slagen onder de microscoop om de cellyse te bewaken. Herhaal dit proces gedurende ongeveer 80 slagen totdat alle cellen succesvol zijn opengebroken. Centrifugeer vervolgens het homogenaat bij 300 ×g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Bewaar het supernatant bij -20 °C in een buis als de cytoplasmatische fractie om celresten te scheiden van de kernresten. Suspendeer de pellet in 750 µL 0,25 M sucrose-oplossing één. Pipetteer 750 µL 0,35 M sucrose-oplossing twee in een centrifugebuis en laag het resuspendeerde homogenaat voorzichtig bovenop oplossing twee. Centrifugeer het sucrosekussen bij 1400 ×g bij 4 °C gedurende vijf minuten en verwijder vervolgens het supernatant.Resuspendeer de pellet in 750 µL van oplossing twee om te lyseren. Sonicate de nucleaire suspensie in een ultrasoon bad, gehouden op of onder 4 °C, in twee pulsen van vijf minuten. Controleer de nucleaire lyse onder een lichtveldmicroscoop tussen de pulsen door en sonicate verder totdat de kernen volledig zijn gelyseerd.Pipette vervolgens 750 µL van 0,88 M sucrose-oplossing drie in een centrifugebuis en breng de nucleaire lysaatoplossing in lagen aan over oplossing drie. Centrifugeer het lysaat bij 3000 ×g bij 4 °C gedurende 10 minuten. De 1,5 mL supernatant is de nucleoplasmatische fractie, die wordt bewaard bij -70 °C.Resuspendeer vervolgens de pellet in 700 µL van oplossing twee. Dit is de 85 replicatiecompartiment-fractie of RCF van de gastheerkern, die eveneens wordt bewaard bij -70 °C. Om te beginnen met de immunofluorescentieanalyse, voegt u een druppel van 5 µL RCF toe aan een met zoutoplossing gecoate glazen objectglas.Laat de druppel aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 microliters PBS toe in een druppel naast de plek en kantel het objectglas zodat de PBS over de plek stroomt. Giet de PBS van het objectglas af.Blok vervolgens de monsterplek gedurende twee uur bij kamertemperatuur met 500 µL PBS bevatten 5% bovine serum albumine. Om de overtollige blokkeringsoplossing te verwijderen, voegt u voorzichtig 500 µL PBS toe aan het monster op de objectglasplaat, zonder direct op het monster te pipetteren. Voer deze wasstap drie keer uit.Voeg vervolgens 20 microliters van de verdunde primaire antilichaam tegen het virale E two A DNA-bindende eiwit toe op de monsterplek. Dek het objectglas af om verdamping te voorkomen en incubeer het in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Was het monster nu drie keer voorzichtig met PBS bevatten 0.02%tween 20.Vermijd het direct pipetteren op het monster na deze wasstappen. Voeg 20 µL fluoro four-geconjugeerd muis secundair antilichaam direct toe aan het monster en incubeer dit gedurende één uur bij 4 °C. Voeg in een bevochtigingskamer 500 µL PBS met 0,02% Tween 20 toe aan de objectglazen, waarbij opnieuw moet worden vermeden om direct op het monster te pipetteren.Voeg vervolgens twee µL monteervloeistof toe en plaats een dekglas omgekeerd over het monster. Kit de zijkanten van de dekglasjes af met nagellak. Bekijk het preparaat onder een fluorescentiemicroscoop met een 63 x objectief bij de gewenste golflengte die specifiek is voor de gebruikte fluoro four; het resultaat van de immunofluorescentie van het adenovirale E2A DNA-bindende eiwit of DBP wordt hier getoond.De DBP-bevattende structuren zijn subnucleaire virale rc; let op dat de E2A-DBP gelokaliseerd is binnen de RC en groen verschijnt. Daarnaast werd de verrijking van viraal DNA in de RCF bevestigd via PCR door de RCF te vergelijken met de nucleoplasmatische fractie of NPL op 24 en 36 uur na infectie. Het virale GNA werd selectief aangetroffen in de RCF en niet in de NPL.De bijbehorende tekst voor aanvullend bewijs van adenovirale MNA in de RCF. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in zes uur worden voltooid, vanaf het moment dat de geïnfecteerde cellen worden geoogst tot de isolatie van de RCF, mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de monsters altijd op ijs te bewaren en de stappen voor homogenisatie van de kern, isolatie, sonicatie en isolatie van de subnucleaire fractie te monitoren via lichtmicroscopie. Volg deze procedure.Andere methoden, zoals R-T-P-C-R en transmissie-elektronenmicroscopie, kunnen worden uitgevoerd om de regulatie van de virale genexpressie in verband met de virale replicatiecompartimenten en de ultrastructuur van deze partikels te bestuderen. Deze techniek heeft de potentie om de weg vrij te maken voor onderzoekers op het gebied van DNA-tumorvirologie om moleculaire mechanismen te verkennen die de celcyclusregulatie veranderen en de virale replicatie in menselijke cellen bevorderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale replicatiecompartimenten uit geïnfecteerde celkernen kunnen worden geïsoleerd om morfologische, functionele en compositionele studies uit te voeren naar deze virus-geïnduceerde structuren.Vergeet niet dat werken met een SAN-indicator gevaarlijk kan zijn, en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van gehoorbescherming, tijdens het uitvoeren van deze procedure.

isolation-viral-replication-compartment-enriched-sub-nuclear

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het genoom van het influenza A-virus bestaat uit acht afzonderlijke complexen van RNA en eiwitten, de zogenaamde virale ribonucleoproteïne complexen (vRNPs). Dit document beschrijft de glycerol gradiënt zuivering en transmissie elektronenmicroscopie visualisatie van influenza A vRNPs.

Zuivering en Visualisatie van Influenza A Viral ribonucleoproteïne Complexen

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Influenza virussen repliceren hun RNA genoom in samenwerking met gastheer-cel chromatine. Hier we een methode intact viraal ribonucleoproteïne complexen zuiveren van chromatine van geïnfecteerde cellen. Gezuiverd virale complexen kunnen worden geanalyseerd door zowel Western blot en primer extension eiwit en RNA inhoud respectievelijk.

Affiniteit Zuivering van Influenza Virus ribonucleoproteïne Complexen van het chromatine van geïnfecteerde cellen

Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T...

Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie

Een protocol voor de generatie van adenovirale vectoren met hoge capaciteit waarbij alle virale coderende sequenties ontbreken, wordt gepresenteerd. Het klonen van transgenen die in het vectorgenoom zijn opgenomen, is gebaseerd op homing-endonucleasen. Virusamplificatie in producencellen die als adhesieven cellen worden gekweekt en in suspensie is afhankelijk van een helpervirus dat virale genen in trans levert.

Klonen en grootschalige productie van hoge capaciteit adenovirale vectoren op basis van de menselijke adenovirus type 5

Hier presenteren we een protocol voor de productie van adenovirus met behulp van het pAdEasy-systeem. De technologie omvat de recombinatie van de pAdTrack en pAdEasy-1 plasmiden, de verpakking en versterking van het adenovirus, de zuivering van de adenovirale deeltjes uit cellysaat en kweekmedium, de virale titratie en het functioneel testen van het adenovirus.

Een efficiënte methode voor de productie van Adenovirus

Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.

Productie en zuivering van adeno-geassocieerd virus door centrifugatie met diodixanoldichtheidsgradiënt voor in-vivotoepassingen

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol voor het genereren en zuiveren van adeno-geassocieerde virale vectoren met behulp van een geoptimaliseerde op heparine gebaseerde affiniteitschromatografiemethode. Het biedt een eenvoudige, schaalbare en kosteneffectieve aanpak, waardoor ultracentrifugatie niet nodig is. De resulterende vectoren vertonen een hoge zuiverheid en biologische activiteit, wat hun waarde bewijst in preklinische studies.

Isolatie van adeno-geassocieerde virale vectoren door middel van een eenstaps en semi-geautomatiseerd heparine-affiniteitschromatografieprotocol

Leer de isolatie van virale replicatiecompartimenten uit adenovirus-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze methode gebruikt een snelheidsgradiënt om sub-nucleaire fracties te verrijken voor virologisch onderzoek.

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen (Video) | JoVE Journal

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Meer video's verkennen