Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Het algemene doel van deze procedure is om een nonnucleair fractie te verkrijgen die verrijkt is met replicatiecompartimenten die in adenovirus-geïnfecteerde cellen worden gevormd voor de gedetailleerde studie van hun samenstelling, ultrastructuur en bijbehorende activiteiten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het gebied van DNA-virologie, zoals een studie van moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en expressie controleren, die op hun beurt afhankelijk zijn van replicatiecompartimenten voor de regulatie van virus-gastheercelinteracties. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige procedure is die gebaseerd is op een snelheidsgradiënt om een ​​celvrij systeem te vestigen dat bruikbaar is voor de studie van de mechanismen die nucleair replicerende DNA-virussen in staat stellen om de geïnfecteerde cel onder controle te nemen.

Om deze test uit te voeren, bereidt u eerst adenovirus type vijf of een D vijf en humane voorhuidschilfers of HFF voor zoals beschreven in het bijbehorende tekstprotocol om te beginnen met het infecteren van 10 tot de zevende HFF in 100 millimeter weefselkweekschalen met behulp van een milliliter van 85 en DMM per schaal bij een MOI van 30 focusvormende eenheden of FFU per cel. Incubeer de cellen gedurende twee uur in een bevochtigde celkweekincubator bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Schud de schalen om de 15 minuten voorzichtig om een ​​gelijkmatige verdeling van het virusinoculum over de cellen te garanderen. Verwijder na de incubatie het medium en voeg vers dmem toe.

Voeg 10%FBS toe en incubeer vervolgens de cellen gedurende 16, 24 of 36 uur met behulp van een celschraper. Oogst de geïnfecteerde en controlecellen voorzichtig na infectie en verzamel de celsuspensie in steriele centrifugeerbuisjes op ijs. Tel de cellen met behulp van een neubauerkamer en centrifugeer vervolgens de cellen gedurende vijf minuten bij 220 keer G bij vier graden Celsius.

Resuspendeer vervolgens het celpellet in vijf milliliter ijskoud PBS centrifugeer en was de cellen drie keer in vijf milliliter ijskoud PBS en gooi de wassupernatanten weg om de cellen te lyzeren. Resus, suspendeer het celpellet in 700 microliter ijskoud hypotoon buffer met proteaseremmers en laat de cellen drie uur op ijs zwellen. Homogeniseer de cellen met behulp van een type A Teflon stamper met 10 tot 20 neerwaartse slagen.

Controleer het lysaat periodiek elke 20 slagen onder de microscoop om cellyse te bewaken. Herhaal het proces ongeveer 80 slagen totdat alle cellen met succes zijn gebroken. Centrifugeer vervolgens het homogenaat gedurende vijf minuten bij 300 keer G bij vier graden Celsius.

Bewaar de supernatant bij min 20 graden Celsius in een buis als de cytoplasmatische fractie om cellulaire deeltjes uit de kern te verwijderen. Suspensio de pellet in 750 microliters 0,25 molaire sucrose-oplossing, pipet 750 microliters 0,35 molaire sucrose-oplossing twee in een centrifugeerbuis en leg de gesuspendeerde homogenaat voorzichtig bovenop oplossing twee. Centrifugeer de sucrosekussen gedurende vijf minuten bij 1400 keer G bij vier graden Celsius, en gooi vervolgens de supernatant weg.

Resuspendeer het pellet in 750 microliters oplossing twee om te lyzeren. Soniceer de nucleaire suspensie in een ultrasoonbad, gehandhaafd op of onder vier graden Celsius in twee pulsen van vijf minuten. Controleer de nucleaire lyse onder een felveldmicroscoop tussen de pulsen en soniceer verder totdat de kernen volledig zijn gebroken.

Pipet vervolgens 750 microliters 0,88 molaire sucrose Oplossing drie in een centrifugeerbuis, leg de nucleaire lysaaloplossing bovenop oplossing drie. Centrifugeer de lysaaloplossing gedurende 10 minuten bij 3000 keer G bij vier graden Celsius. De 1,5 milliliter S-fractie is de nucleoplasmatische fractie, die wordt bewaard bij min 70 graden Celsius.

Resuspensio de pellet vervolgens in 700 microliters oplossing twee. Dit is de 85 replicatiecompartimentfractie of RCF van de gastheerkern, die ook wordt bewaard bij min 70 graden Celsius. Om de immunofluorescentieanalyse te beginnen, voegt u een vijf microliter druppel van de RCF toe aan een met zout bekleed glazen plaatje.

Laat de druppel op kamertemperatuur drogen. Voeg vervolgens 500 microliters PBS toe in een druppel naast de vlek en kantelt de plaat om het PBS over de vlek te laten stromen. Laat het PBS van de plaat lopen.

Blok vervolgens de steekproefvlek met 500 microliters PBS dat 5% bovien serumalbumine bevat gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Om de overtollige blokoplossing te verwijderen, voegt u voorzichtig 500 microliters PBS toe aan de steekproef op de plaat zonder direct op de steekproef te pipetten. Voer de wassing drie keer uit.

Voeg vervolgens 20 microliters verdunde primaire antilichaam toe tegen het virale E twee A DNA-bindend eiwit op de steekproefvlek. Bedek de plaat om verdamping te voorkomen en incubeer in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur gedurende twee uur. Was nu de steekproef drie keer voorzichtig met PBS met 0,02% tween 20.

Vermijd direct op de steekproef te pipetten na deze wasbeurten. Voeg 20 microliters fluoro vier gekoppelde muis secundair antilichaam rechtstreeks op de steekproef toe, incubeer gedurende een uur bij vier graden Celsius. Voeg in een bevochtigde kamer 500 microliters PBS met 0,02% Tween 20 toe aan de schalen, opnieuw zonder direct op de steekproef te pipetten.

Voeg vervolgens twee microliters montageoplossing toe en draai een dekglas om de steekproef. Verzegelde de zijden van de dekglazen met nagellak. Bekijk de plaat onder een fluorescentiemicroscoop met een 63 x objectief bij de gewenste golflengte specifiek voor de gebruikte fluoro vier een resultaat van immunofluorescentie van adenoviraal E twee A DNA-bindend eiwit of DBP wordt hier getoond.

De DBP-bevattende structuren zijn subnucleaire virale rc, merk op dat de E twee A DB