Name: High Throughput Danio Rerio Energie Uitgaven Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Leer een high-throughput resazurine-gebaseerde fluorometrische assay om metabole snelheid te meten in Danio rerio larven. Deze methode ondersteunt onderzoek naar energiehomeostase en obesitas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Drs. Roger Cone en Chao Zhang bedanken voor hun bijdragen aan het valideren van de toepassing van deze assay zoals eerder gepubliceerd. Dit werk werd ondersteund door NIH 1F32DK082167-01 (BJR).

Opmerking: Dit protocol volgt de richtlijnen van de Universiteit van Arizona Bureau voor verantwoorde onderzoek en is door de Institutional Animal Care en gebruik Comite 1. zebravis Fokkerij en Embryo Onderhoud <ol><li> Bereid E3 embryo medium 8. Tot 60x voorraad-oplossing maken, los 34,8 g NaCl, 1,6 g KCI, 5,8 g CaCl2 ● 2H 2 O, en 9,78 g MgCl2 ● 6H 2 O in 1,95 L ddiH 2 O. Stel de pH tot 7,2 met NaOH en HCl Stel het volume op 2 L met ddiH 2 O. </li><li> Om 1x E3 embryo medium te bereiden, verdun 16,5 ml 60x voorraad in 1 L ddiH20. Voeg 100 ul 1% methyleenblauw. </li><li> Fokkerij <ol><li> Huis Mannelijke en Vrouwelijke broed voorraad (7-18 maanden oud) apart vruchtbaarheid te maximaliseren. </li><li> De verlichting uitschakelen 1-2 uur eerder op de dag voor eieren gewenst zijn. Opgezet paring (1 man en 1-2 vrouwtjes) in crossing kooien zoals eerder beschreven 9. Crossing kooien zorgen voor de eieren predatie ontsnappen als ze door de geperforeerde bodem van de tank insertie waarin de volwassen vissen worden gehouden. </li><li> Optioneel:. Voor getimede fokkerij, (als dat nodig zou zijn voor studies met morfolino injectie), scheiden de mannelijke en vrouwelijke vis door een doorzichtige plastic divider, Verwijder deze in de ochtend om te resulteren in een getimede leggen van de eieren en de bevruchting. Voor morfolino studies, uitgevoerd powerberekeningen het aantal embryonale vis vereist per behandeling te beoordelen. Zonder een schatting van de omvang van het effect of variatie kan een voorafgaande proef worden uitgevoerd met n = 8. </li></ol></li><li> Giet de eieren van de kruising kooi in een petrischaal (100-150 embryo&#39;s / 10 cm petrischaal). Laat de eieren naar de bodem van de schaal en giet het water. Verwijder eventuele resterende water met een fijne tip wegwerp transferpipet. Voeg back E3 embryo medium gemaakt in stap 1.1. </li><li> Maak aflame gepolijst disposable pipet voor toekomstige eieren en vis overdracht. Met behulp van een schaar, sneed een afgestudeerd wegwerp transferpipet op 0,25 ml afstuderen. Ruwe randen, vlam polish de cut tip over een bunsenbrander te verwijderen. </li><li> Behouden embryonale vis tot 4 dagen na de bevruchting (DPF) in 10 cm petrischalen in zebravis E3 embryo medium bij 28,5 ○ C. Twee keer per dag, gebruik maken van een vlam gepolijst afgestudeerd wegwerp transferpipet aan een onbevruchte eieren of dode embryo&#39;s (ondoorzichtige witte uiterlijk) te verwijderen. Eenmaal per dag, vervang E3 embryo medium. Giet E3 embryo medium, verwijder resterende vloeistof met een fijne tip wegwerp transferpipet en voeg terug voorverwarmde (28,5 ○ C) E3 embryo medium. </li></ol> 2. Bereid Assay Solution <ol><li> Bereid de testoplossing volgens tabel 1. Filtreer steriel testoplossing met een 0,22 uM filter. Vóór initiatie testen, verwarm de steriele testoplossing in een 28,5 ○ Cwaterbad. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Bestanddeel </td><td> % Van de totale </td><td> Volume (ul / 10 ml) </td></tr><tr><td> 60x E3 Embryo Medium </td><td> 1,667 </td><td> 166,7 </td></tr><tr><td> Dubbele gedemineraliseerd (DDI) H 2 0 </td><td> 96,233 </td><td> 9623,3 </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 mM NaOH </td><td> 1 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 0.1 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Assay Medium 3. Voer Assay <ol><li> Spoel de zebravis embryo&#39;s 3 maal met steriel gefiltreerd E3 embryo medium. Combineer alle levensvatbare zebravis embryo&#39;s uit de koppeling in een bekerglas. Steriele filter 75 ml E3 embryo medium. Met een fijne tip wegwerp transferpipet, rebewegen zoveel mogelijk van de E3 embryo medium van de zebravis embryo&#39;s mogelijk. Zet terug 20 ml steriel gefiltreerd E3 embryo medium. Verwijder en vervang E3 embryo medium 3 keer. </li><li> Plaat 1 vissen in elk van 93 putjes van een 96 putjes zwart eenzijdige doorzichtige bodemplaat. Breng de embryonale vis op de plaat door individueel vastleggen van een embryo in een vlam gepolijst afgestudeerd plastic wegwerp transferpipet (stap 1.5) en voorzichtig te werpen in de put. Transfer E3 embryo medium uit de beker die gespoeld vissen in de 3 lege putten. Dit zorgt ervoor dat lege putjes werden blootgesteld aan exact hetzelfde water als putjes die vis bevatten. Beide putten die vis en blanco putjes die moet ten minste ½ volledige (200 ui) aan het einde van deze stap. </li><li> Vervang E3 embryo medium met assay oplossing in alle 96 putten, met inbegrip van lege putten. Deze stap moet worden uitgevoerd 1 kolom per keer voor elk van de 12 kolommen in een 96 wells plaat. Met een fijne tip wegwerp transfer pipet, verwijder E3 embryo medium vanuit elke put in één kolom van de plaat (8 wells). Zorg ervoor dat de zebravis embryo niet aan. Voeg 300 pl testoplossing aan elk putje waaruit water is verwijderd. Herhaal de verwijdering van E3 embryo medium en vervanging testoplossing voor 12 kolommen van de plaat. </li><li> Optioneel: Om de stofwisseling verandering in respons op een testverbinding, maak een oplossing die 100 keer (100X) de gewenste concentratie behandeld. Van de nota, ervoor zorgen dat de 100x oplossing niet meer dan 10% DMSO om de uiteindelijke DMSO-concentratie te beperken tot niet meer dan 0,1%. Voeg 3 ul van de 100x oplossing in elk van de putjes behandeling. OPMERKING: Voer de macht berekeningen om het aantal van de behandeling putten beoordelen. Zonder een schatting van de omvang van de respons of variant, een voorafgaande proef worden uitgevoerd in 8 verbinding behandelde en 8 vehikel behandelde controleputjes die vis bevatten. <ol><li> Voeg 3 ul van voertuigcontrole controle (geen drug behandeling) putten die vis bevatten. Om de respons op fluorescente verbinding gevolge van acties binnen de vis, passen geneesmiddel en vehikel behandelingen 3 blanco putjes in een 96 wells plaat. </li></ol></li><li> Lees vis gevuld bord op fluorescerende plaat lezer met excitatie golflengte bij 530 nm en emissie golflengte bij 590 nm. </li><li> Plaats plaat in bevochtigde incubator ingesteld op 28,5 ○ C (plaat in het donker heel assay behouden om fotobleken van de test oplossing te voorkomen). De test kan worden uitgevoerd gedurende perioden van tijd die varieert van 1 uur tot 24 uur. De duur van de test hangt af van de doelstelling van de studie. Voor het testen van de respons op een kortwerkende niet stabiele verbinding korte duur kan het meest geschikt. Maar voor stabiele verbinding tests of tests van de genetische effecten, maximaliseren test duration voorkeur om de voordelen van de cumulatieve signaal benutten. </li><li> Op een vooraf bepaald tijdstip (zie stap 3.6 om te bepalen tijdstip)lees fluorescentie van visrijke plaat opnieuw met dezelfde instellingen als punt 3.5. </li></ol> 4. Beoordeel de relatieve verandering in fluorescentie geassocieerd met Behandeling <ol><li> Bereken verandering in fluorescentie van elk putje door het aftrekken van de fluorescentie op tijdstip 0 van de fluorescentie aan het einde van de studie. Wells zonder vis (spaties) moeten waarden in de buurt van 0, ver onder de waarden uit putten die vis bevatten. Verandering in fluorescentie = Fluorescentie bij sluiten - Fluorescence op tijdstip 0 </li><li> Om de relatieve verandering in fluorescentie vernemen Bereken de gemiddelde verandering in fluorescentie voor controleputjes verdeel de verandering in fluorescentie van elk putje van de gemiddelde verandering in fluorescentie van de controleputjes. Van de nota, zou controles ofwel bedieningsorganen van het voertuig of genetische controles. <img alt="Vergelijking 1" src="/files/ftp_upload/53297/53297eq1.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> PNAS. 110, 13904-13909 (2013).</li>
<li>Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+knock-in+transgenic+zebrafish+carrying+reporter%2Fdriver+genes+by+CRISPR%2FCas9-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering.</a> Sci. Rep. 4, 6545(2014).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Couture, P., Else, P. L., Withers, K. W., Hulbert, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+energy+metabolism.+Proton+permeability+of+the+inner+membrane+of+liver+mitochondria+is+greater+in+a+mammal+than+in+a+reptile%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Evolution of energy metabolism. Proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammal than in a reptile.</a> Biochem. J. 275 (Pt 1), 81-86 (1991).</li>
<li>Renquist, B. J., Zhang, C., Williams, S. Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+assay+for+high-throughput+energy+expenditure+monitoring+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an assay for high-throughput energy expenditure monitoring in the zebrafish.</a> Zebrafish. 10, 343-352 (2013).</li>
<li>Livingston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+volumetric+respirometer+for+long-term+studies+of+small+aquatic+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.Mar.+Biol.+Assoc.+U.K%22%5BJournal%5D)">A volumetric respirometer for long-term studies of small aquatic animals.</a> J.Mar. Biol. Assoc. U.K. 48, 485-497 (1968).</li>
<li>Makky, K., Duvnjak, P., Pramanik, K., Ramchandran, R., Mayer, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whole-animal+microplate+assay+for+metabolic+rate+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">A whole-animal microplate assay for metabolic rate using zebrafish.</a> J. Biomol. Screen. 13, 960-967 (2008).</li>
<li>E3 medium (for zebrafish embryos) Cold Spring Harb. Protoc. , <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449">http://cshprotocols.cshlp.org/citmgr?gca=protocols%3B2011%2F10%2Fpdb.rec66449</a> (2011).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53, 161-168 (2012).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%2C+A+practical+approach%22">Zebrafish, A practical approach</a>. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Fry, F. E. J., Hart, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cruising+speed+of+goldfish+in+relation+to+water+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish.+Res.+Board+Can%22%5BJournal%5D)">Cruising speed of goldfish in relation to water temperature.</a> J. Fish. Res. Board Can. 7, 169-175 (1948).</li>
<li>Oka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+obesity+in+zebrafish+shares+common+pathophysiological+pathways+with+mammalian+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+physiol%22%5BJournal%5D)">Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity.</a> BMC physiol. 10 (21), (2010).</li>
<li>Song, Y., Cone, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+a+genetic+model+of+obesity+in+a+teleost%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Creation of a genetic model of obesity in a teleost.</a> FASEB J. 21, 2042-2049 (2007).</li>
<li>Maddison, L. A., Joest, K. E., Kammeyer, R. M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+insulin+resistance+in+zebrafish+induces+alterations+in+beta-cell+number+and+glucose+tolerance+in+an+age+and+diet+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+physiol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle insulin resistance in zebrafish induces alterations in beta-cell number and glucose tolerance in an age and diet dependent manner.</a> Am. J. physiol. Endocrinol. , (2015).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent , C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio).</a> J. lipid res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+fluorescence-based+assay+system+for+appetite-regulating+gene+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening.</a> PloS one. 7, e52549(2012).</li>
<li>Tingaud-Sequeira, A., Ouadah, N., Babin, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+obesogenic+test%3A+a+tool+for+screening+molecules+that+target+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+lipid+res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish obesogenic test: a tool for screening molecules that target adiposity.</a> J. lipid res. 52, 1765-1772 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te onthullen.

Contaminatie met bacteriën of schimmels wordt sterk beperkt de toepassing van deze assay. De methyleenblauw in de E3 embryo medium beperkt de mogelijkheid van schimmel besmetting. Hele embryo grootbrengen is het essentieel dat zorg wordt genomen om de dode embryo&#39;s twee keer per dag te verwijderen. Daarnaast is het essentieel om grondig spoelen met steriel embryo E3 embryo medium op de dag van assay initiatie. Deze 2 stappen beperken de mogelijke bacteriële besmetting van het embryo. Het opnemen van blanco putjes in...

De muis is op dit moment het belangrijkste model voor obesitas onderzoek. De korte generatie interval en genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in de muis zijn ongeëvenaarde tot nu toe. De zebravis biedt ook een korte generatie tijd (3-4 maanden) en overtreft zelfs de muis gemak van genetische manipulatie 1,2. De zebravis onderhoudt bijna 90% van de genen van zoogdieren, terwijl ver boven de muis in aantal nakomelingen en de mogelijkheden voor gebruik in genetische en drug screens 3. Om het potentieel van de zebravis model voor studies van obesitas tikt, moet assays worden ontwikkeld om factoren die het lichaamsgewicht regelgeving, met inbegrip van de energie-uitgaven van invloed te onderzoeken. Aangezien metabolieten worden verwerkt via β-oxidatie en tricarbonzuur cyclus zuurstof wordt verbruikt en NADH 2 wordt geproduceerd. Aldus NADH 2 is een directe indicatie van de flux van metabolieten door middel van metabole pathways (metaboliet oxidatie). In poikilotherms, H + lekken door het binnenste mitochondriale membraan, dat NADH 2 oxidatie ontkoppelt van ATP-synthese, is 4-5 maal hoger dan in homeothermen 4. Dienovereenkomstig, in zebravis NADH 2 is zeer nauw verbonden met ATP productie door middel van oxidatieve fosforylering. Hierin beschrijven we een test die NADH 2 productie meet in larvale zebravis als proxy voor de energie-uitgaven 5. Zuurstofverbruik is de gouden standaard voor het meten van het energieverbruik. Toch optimaal te profiteren van de high throughput mogelijkheden van de zebravis, testen van energieverbruik moet vatbaar bij hoge doorvoer zijn. Zuurstofverbruik systemen die afhankelijk zijn van een gesloten kamer circulatiesysteem zijn overslag beperkt door het aantal beschikbare kamers 6. Open lucht O 2 verbruik / CO2 productie testen zijn ook toegepast in de zebravis 5,7. Deze open lucht 96-well plaat based systemen vatbaar zijn voor high throughput. Helaas beperkt gasuitwisseling met de omgeving sensitiviteit van deze assays. We hebben onlangs publiceerde de toepassing van een test die NADH 2 bewaakt met behulp van de redox-indicator AlamarBlue 5. Deze test overwint de beperkingen in verwerkingscapaciteit en gevoeligheid gemeenschappelijke analyses van zuurstofverbruik bij de zebravis. De zebravis is een steeds belangrijker model voor studies van het gehele lichaam energie homeostase. Voor een deel omdat zebravis vatbaar zijn voor gebruik in voorwaartse genetische screens en drugs schermen. Bovendien, gerichte genetische manipulatie, met inbegrip van knock-down en knock-in, kan snel worden toegepast. We hebben eerder aangetoond dat deze assay kan worden gecombineerd met bad geneesmiddeltoediening en genetische knockdown of knockout verbindingen en genen die metabolisme 5 veranderen identificeren. Bovendien is deze bepaling ontworpen om de doorvoer voordelen inherent aan de zebravis benutten. </p&gt;

<table><tbody><tr><td>AlamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-230-103</td><td>Geproduceerd door Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fine Tip DisposableTransfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-26</td><td>Geproduceerd door Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Fisherbrand Graduated Disposable Transfer Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-771-9AM</td><td>Geproduceerd door Thermo Scientific</td></tr><tr><td>Black sided clear bottom 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-320-785</td><td>Geproduceerd door E&amp;K Scientific Products Inc.</td></tr></tbody></table>

high throughput<em&gt; danio rerio</em&gt; energie uitgaven assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebravis een belangrijk modelorganisme inherente voordelen die potentieel zebravis een schaal toegepast model voor de studie van energiehomeostase en obesitas te maken. De geringe omvang van de zebravis zorgt voor tests op embryo&#39;s te worden uitgevoerd in een 96- of 384-well plaat formaat, Morfolino en CRISPR gebaseerde technologieën bevorderen gemak van genetische manipulatie, en behandeling met geneesmiddelen door bad applicatie levensvatbaar is. Bovendien zebravis zijn ideaal voor voorwaartse genetische screens waardoor nieuw gen ontdekking. Gezien de relatieve nieuwheid van de zebravis als model voor obesitas, is het nodig om instrumenten die volledig deze voordelen te benutten ontwikkelen. Hierin beschrijven we een methode om energieverbruik in duizenden embryonale zebravis simultaan meten. Wij hebben een hele dier microplaat platform waarop wij 96-well platen exemplaren isoleren ontwikkeld en beoordelen wij cumulatieve NADH 2 productie met behulp van de commercieel beschikbare celkweek levensvatbaarheid remiddel AlamarBlue. In koudbloedigen de relatie tussen NADH 2 productie en het energieverbruik is nauw verbonden. Deze energie-uitgaven test maakt het mogelijk om snel te screenen farmacologische of genetische manipulaties die direct veranderen energieverbruik of de reactie op een toegepaste geneesmiddel (bijv insulinesensibiliseermiddelen) veranderen.

Testoplossing geen fluorescentie verhoging bij afwezigheid van embryonale vis (figuur 1). De test is zeer gevoelig voor kleine veranderingen in de stofwisseling in de put. Een enkele vis in een put wordt een signaal significant verschilt van blanco putjes binnen 1 uur (p &lt;0,0001). Figuur 2 geeft een visuele representatie van signalen van embryonale vis na 24 uur incubatie. Ten behoeve van deze afbeelding duidelijke eenzijdige putjes werden toegepast. Toch zijn zwarte eenzijdig putten...

Zebravissen zijn een belangrijk modelorganisme voor de studie van energiehomeostase. Door gebruik te maken van een NADH2 gevoelige redoxindicator, alamar Blue, hebben we een test ontwikkeld die de metabole snelheid van zebravislarven meet in een 96-well plate formaat en kan worden toegepast op medicijn- of genontdekking.

High Throughput<em&gt; Danio Rerio</em&gt; Energie Uitgaven Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Het algemene doel van deze high-throughput fluorometrische assay op basis van resazurine is het monitoren van het effect van genetische of farmacologische manipulaties op de NADH2-productie, wat een maat is voor de metabole snelheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied obesitas, zoals het effect van een specifiek geneesmiddel of gen op de metabole snelheid. Daarnaast kan deze assay worden toegepast om te screenen op potentiële geneesmiddel-geneesmiddel- of geneesmiddel-gen-interacties in een volledig diersysteem.Het belangrijkste voordeel van deze assay, in vergelijking met assays voor zuurstofverbruik, is de hoge doorvoersnelheid en de accumulatie van het signaal over tijd, waardoor de gebruiker kleine verschillen in de stofwisselingssnelheid kan detecteren. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Caroline Foy, een promovendus in mijn laboratorium. Nadat een 60X-stokoplossing van E3-medium volgens het tekstprotocol is bereid, wordt 1X E3-medium gemaakt door 16,5 milliliters van de stokoplossing te verdunnen met één liter dubbel gedestilleerd water.Voeg vervolgens 100 µL 1% methyleenblauw toe. Om een vlamgepolijste wegwerppipet voor het overbrengen van eitjes en vissen te maken, knipt u met een schaar een gegradeerde wegwerppipet af bij de markering van 0,25 mL. Gebruik vervolgens een Bunsenbrander om de afgesneden tip vlam te polijsten om de ruwe randen te verwijderen.Nadat de kruisingen van zebravis zijn opgezet en de eitjes zijn verzameld, laat u de eitjes naar de bodem van de schaal zakken en giet u het water af. Gebruik een wegwerppipet met een fijne punt om het resterende water te verwijderen. Voeg vervolgens het E3-medium opnieuw toe.Incubeer de embryonale vissen bij 28,5 °C tot vier dagen na bevruchting, of DPF. Gebruik twee keer per dag een vlamgepolijste, gegradueerde wegwerppipet om onbevruchte eitjes of dode embryo's te verwijderen. Giet vervolgens één keer per dag het E3-medium af.Gebruik een transferpipet met een fijne punt om het resterende medium te verwijderen en vervang dit door vers E3 dat is voorverwarmd tot 28.5 degrees Celsius. Bereid de assay-oplossing volgens deze tabel om de bepaling van het energieverbruik uit te voeren. Gebruik een filter van 0.22 micrometer om de oplossing steriel te filteren en verwarm deze in een waterbad tot 28.5 degrees Celsius voor de assay.Combineer alle levensvatbare zebravisembryo's uit het clutch in een petrischaal. Nadat 75 milliliters E3-medium is filtergesteriliseerd, gebruikt u een wegwerppoepipet met een fijne punt om zoveel mogelijk van het E3-medium uit de petrischaal te verwijderen. Voeg vervolgens 20 milliliters steriel E3 toe. Herhaal het verwijderen en vervangen van het steriele E3 nog twee keer.Breng vervolgens, met behulp van een vlamgepolijste, gegradeerde plastic wegwerppipet, individuele embryonale vissen over naar de putjes van een 96-wellplaat. Werk kolom voor kolom en verwijder het E3-medium uit de acht putjes van de eerste kolom, waarbij u er zorg voor draagt dat de embryo's niet met de transferpipet worden geraakt. Voeg daarna 300 µL assay-oplossing toe aan elk putje.Herhaal dit voor alle 12 kolommen van de plaat. Om een behandeling met een geneesmiddel toe te voegen, voegt u, na het bereiden van een 100X-oplossing van de gewenste verbinding, drie µL toe aan elk van de behandelingsputjes. Voeg vervolgens drie µL vehicle-controle toe aan de controleputjes met vissen.Om er zeker van te zijn dat de fluorescentierespons op de verbinding het resultaat is van activiteit in de vis, worden voor zowel de drug- als de vehicle-behandelingen drie blanco wells per behandeling ingericht in een 96-well plaat. Lees nu de wells van de visplaat af met een fluorescentieplaatlezer, met excitatie- en emissiegolflengten van respectievelijk 530 nanometers en 590 nanometers. Plaats de plaat in een bevochtigde incubator bij 28.5 degrees Celsius.Afhankelijk van de assay en de stabiliteit van de geteste verbinding, wordt de fluorescentie opnieuw gemeten op een vooraf bepaald tijdstip. Om de relatieve verandering in fluorescentie te beoordelen, wordt de gemiddelde verandering in fluorescentie voor de controleputjes berekend. Deel vervolgens de verandering in fluorescentie van elk putje door de gemiddelde verandering in fluorescentie van de controleputjes.Hier is een voorbeeld van het gebruik van twee kolommen van een 96-well plaat. De wells in kolom A bevatten met vehicle behandelde controle-zebravissen, terwijl de wells in kolom B insuline-behandelde zebravissen bevatten. In tabel A wordt de fluorescentie getoond die op tijdstip nul is gemeten.Tabel B bevat de fluorescentie die 24 uur later is gemeten. In tabel C is de fluorescentie op tijdstip nul afgetrokken van de fluorescentie na 24 uur om de verandering in fluorescentie te beoordelen. Bereken vervolgens de gemiddelde verandering in fluorescentie in de controleputjes.Tabel D toont de verandering in fluorescentie van elke individuele well, gedeeld door de gemiddelde verandering in de controle-wells. Hier is te zien dat behandeling met insuline bij 10 micromol over 24 uur een 2,77-voudige toename veroorzaakte in het door zebravis gegenereerde signaal, met een P-waarde van minder dan 0,0001. Zoals hier te zien is, verandert de assay-oplossing niet van kleur of absolute fluorescentieniveaus in afwezigheid van embryo's.De assay is echter zeer gevoelig voor kleine veranderingen in de stofwisselingssnelheid binnen de put. Deze figuur representeert signalen gegenereerd door tilapia-embryo's na een incubatie van 24 uur. Roze putten zijn indicatief voor vissen met een hoge stofwisselingssnelheid.Paarse putjes bevatten vissen met matige metabole snelheden, en de blauwe putjes vertegenwoordigen een lage metabole snelheid. Dit toont ook de veelzijdigheid van deze assay en de toepassing bij diverse teleoste soorten. Omdat de door NADH2 geïnduceerde reductie van alamar blue onomkeerbaar is, accumuleert het signaal na verloop van tijd, waardoor kleine veranderingen kunnen worden versterkt.Hier wordt de relatieve verandering in fluorescentie getoond, geïnduceerd door één tot vijf vissen na één, twee en vier uur. Bij elke toename van het aantal vissen neemt de relatieve verandering in fluorescentie significant toe over de tijd, waarbij een groter aantal vissen leidt tot een grotere mate van verandering in fluorescentie over de tijd. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze worden uitgevoerd op maximaal 5 000 embryonale vissen per dag.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zorgvuldig te werken om beschadiging van de embryonale vis te voorkomen. Na deze assay kunnen andere procedures worden uitgevoerd, zoals de Nile red-meting van neutrale lipiden of het meten van de fageerdrift via de opname van met fluorassay gelabelde paramecia. Hiermee kunnen we de relatie tussen de stofwisselingssnelheid en het lipidenmetabolisme, of tussen de stofwisselingssnelheid en de fageerdrift vergelijken.Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van energiemetabolisme en metabole ziekten om het energieverbruik bij zebravischen te bestuderen zonder beperkingen in de doorvoer. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het fluorometrische reagens resazurine kan worden gebruikt om de NADH2-productie in de zebravisch te meten.

high-throughput-danio-rerio-energy-expenditure-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te...

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dit is een hoog vet dieet voeding protocol om zwaarlijvigheid in Drosophila, een model voor begrip fundamentele moleculaire mechanismen betrokken bij lipotoxicity. Het biedt ook een hoge doorvoersnelheid triglyceride assay voor het meten van vet accumulatie in Drosophila en mogelijk andere (insect) modellen onder verschillende voeding, milieu, genetische of fysiologische omstandigheden.

Hoog vet dieet voeding en High Throughput triglyceride test bij Drosophila Melanogaster

Presenteren we een protocol voor het meten van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in Drosophila melanogaster larvale en volwassen hersenen. Een metabole analyzer wordt gebruikt met een aangepast en geoptimaliseerd protocol. Micro-weefsel beperkingen werden zijn een essentieel onderdeel van dit protocol en ontworpen en gemaakt speciaal voor hun gebruik in deze analyse.

Metabole analyse van Drosophila melanogaster Larval en volwassen hersenen

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Mitochondriale ademhaling is van cruciaal belang voor de overleving van het organisch; Daarom is zuurstof verbruik tarief is een uitstekende indicator voor mitochondriale gezondheid. In dit protocol, beschrijven we het gebruik van een commercieel beschikbare respirometer voor het meten van basale en maximale zuurstof verbruik in leven, intact, en vrij-sporenvormende Caenorhabditis elegans.

Meting van zuurstof verbruik in Intact Caenorhabditis elegans

Hier karakteriseren we cellulaire proteotoxische stressreacties in de nematode C. elegans door het meten van de activering van fluorescerende transcriptieverslaggevers en assaying gevoeligheid voor fysiologische stress.

Metingen van fysiologische stressreacties in C. Elegans

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

De microplate feeder assay biedt een economische, hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van vloeibare voedselconsumptie in Drosophila. Een 3D-geprint apparaat verbindt een 96-well microplaat waarin vliegen zijn gehuisvest met een 1536-well microplaat waaruit vliegen een voedingsoplossing met een tracerkleurstof consumeren. De volumedaling van de oplossing wordt spectrofotometrisch gemeten.

Een high throughput microplate feeder assay voor kwantificering van consumptie in Drosophila

Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.

High-Throughput screening van microbiële isolaten met impact op caenorhabditis elegans gezondheid

Dit protocol beschrijft een test om de voedingssnelheid van Caenorhabditis elegans te kwantificeren op basis van het meten van de klaring van bacteriën in vloeibare cultuur.

Kwantificering van de voedselinname bij Caenorhabditis elegans door de bacteriële klaring te meten

Leer een high-throughput resazurine-gebaseerde fluorometrische assay om metabole snelheid te meten in Danio rerio larven. Deze methode ondersteunt onderzoek naar energiehomeostase en obesitas.

High Throughput

Meer video's verkennen