Gehele berging In Situ hybridisatie
Whole-mount in situ hybridisatie is een krachtige techniek die wetenschappers in staat stelt de moleculaire basis van embryonale ontwikkeling te begrijpen. "Whole-mount" geeft aan dat het hele embryo wordt gebruikt, niet alleen een weefselsnede. "In situ" is een Latijnse uitdrukking die "op zijn plaats" betekent. En ten slotte verwijst "hybridisatie" naar de complementaire binding van een synthetisch geproduceerd RNA-molecuul aan een mRNA-transcript binnen de cel van een organisme.
Deze video zal de procedure, de verwachte resultaten en geselecteerde toepassingen van deze techniek demonstreren die een beter begrip van ontwikkelingsstoornissen kunnen toelaten.
Genes die ten grondslag liggen aan de morfogenese van organismen worden gedurende het verloop van de embryonale ontwikkeling uitgedrukt in tijdelijk en ruimtelijk beperkte patronen.
Synthetisch geproduceerde RNA-sondes, ribosondes genoemd, worden gebruikt om mRNA's te detecteren door complementaire binding. Ribosondes zijn gelabeld met speciale nucleotiden die "haptenen" bevatten, zoals dinitrofenol, biotine of digoxenine. Haptenen zijn moleculen die een immuunrespons kunnen oproepen wanneer ze aan grotere moleculen zijn gehecht, en zijn daarom doelwitten voor antilichaambinding. Deze detectie-antilichamen zijn geconjugeerd aan enzymen, zoals meeldraaierperoxidase of alkalische fosfatase, die chemische reacties katalyseren waarbij een fluorescerende of gekleurde kleurstof kan worden afgezet.
Traditionele in situ hybridisatietechnieken vereisen de voorbereiding van weefselsecties van een embryo om de detectie van de interne structuren te vergemakkelijken. Als gevolg hiervan zal een volledige beoordeling van genexpressie in het hele organisme moeten worden gereconstrueerd uit de 5-6 μm weefselsneden met behulp van computersoftware. Met de ontwikkeling van whole-mount-technieken kan echter genexpressieanalyse over grotere afstanden binnen het hele embryo worden verkregen.
Nadat we de principes achter whole-mount in situ hybridisatie hebben bekeken, laten we nu de experimentele protocol stap voor stap doorlopen.
De eerste stap in deze procedure omvat de identificatie van de doelsequentie in het modelorganisme dat onderzocht zal worden. De doel-DNA-sequentie wordt vervolgens door PCR aangemaakt met primers die RNA-polymerase-initiatiesequenties bevatten. De aangemaakte DNA-sjabloon wordt nu in vitro getranscribeerd met hapten-gelabelde nucleotiden. Deze hapten-gelabelde ribosonde is nu klaar voor de hybridisatie-stap.
Embryo's worden voorbereid op hybridisatie via fixatie met formaldehyde, een cross-linking reagens dat eiwitten stabiliseert en beschermt tegen RNases. Na fixatie wordt het formaldehyde verwijderd door het embryo meerdere keren te wassen met fosfaatgebufferd zoutoplossing met een kleine hoeveelheid detergent, zoals Tween. Om cellulaire lipiden te verwijderen en het binnendringen van de sonde in de weefsels te vergemakkelijken, worden embryo's gedehydrateerd in een gegradueerde reeks methanolwasbeurten, bijvoorbeeld: 25%, 50%, 75%, 100% methanol. Embryo's kunnen worden bewaard in 100% methanol gedurende maximaal een maand (of meer) bij -20°C.
Om embryo's voor hybridisatie voor te bereiden, moeten ze worden gerehydrateerd door een gegradueerde reeks methanolwasbeurten met progressief minder methanol per wasbeurt. Embryo's worden vervolgens gedigesteerd met een protease om de diffusie van ribosonde in de weefsels te vergemakkelijken. De gelabelde ribosonde wordt aan het embryo toegevoegd en de hybridisatie wordt uitgevoerd.
Post-hybridisatie wasbeurten worden uitgevoerd om niet-specifieke hybridisaties te verwijderen. RNases A en T1 worden toegevoegd om onvolledig gehybridiseerde sondes te verwijderen door enkelstrengs RNA te verteren. De gehybridiseerde sondes worden gedetecteerd met een antilichaam-enzymconjugaat dat de hapten-gelabelde ribosondes bindt. Zoals eerder vermeld, worden enzymen zoals alkalische fosfatase geconjugeerd aan hapten-specifieke antilichamen, en worden gedetecteerd door het toevoegen van enzymsubstraten om een kleurverandering te veroorzaken. Het reactieproduct vormt een donker paarse neerslag die de locatie van het tot expressie gebrachte mRNA markeert, zoals te zien is in dit voorbeeld.
Nu u weet hoe u whole-mount in situ hybridisatie uitvoert, laten we enkele toepassingen van de techniek bekijken.
Whole-mount in situ hybridisatie is gebruikt om wetenschappers te helpen dodelijke muggenoverdraagbare ziekten aan te pakken, zoals malaria, knokkelkoorts en het West-Nijlvirus. Door de genen die betrokken zijn bij muggenreproductie en -ontwikkeling te karakteriseren, kunnen nieuwe biologische of chemische insecticiden worden ontworpen om beter de ziekteverspreidende muggen te targeten.
Een andere toepassing van deze techniek betreft de karakterisering van genexpressiepatroonveranderingen geassocieerd met blootstelling aan teratogenen, of agentia die interfereren met de foetale ontwikkeling.
Hier werd whole-mount in situ hybridisatie gebruikt in een zebravismodel van foetaal alcoholsyndroom om genen te identificeren waarvan de expressiepatronen veranderen na blootstelling aan alcohol. Dit kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën om de gevolgen van alcoholblootstelling in utero te verminderen.
Whole-mount in situ hybridisatie kan ook worden gebruikt om fenotypische veranderingen geassocieerd met aangeboren ziekten te valideren. Mutaties geassocieerd met het Bardet-Biedl-syndroom werden via synthetisch geproduceerde mutante mRNA's in zebravis-embryo's geïntroduceerd. Na een bepaalde periode werden embryo's verdeeld in groepen op basis van de ernst van de defecten. Het visualiseren van de expressie van genen stroomafwaarts van het gemuteerde gen werd gebruikt om de fenotypische veranderingen te valideren. Zo kan whole-mount in situ hybridisatie in combinatie met fenotypische scorering een beter begrip van de rollen van specifieke mutaties die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsstoornissen vergemakkelijken.
Whole-mount in situ hybridisatie (WMISH) is een veelgebruikte techniek voor het visualiseren van de locatie van geëxprimeerde RNA's in embryo's. In di…
Whole-mount in situ hybridisatie is een krachtige techniek die wetenschappers in staat stelt de moleculaire basis van embryonale ontwikkeling te begrijpen. "Whole-mount" geeft aan dat het hele embryo wordt gebruikt, niet alleen een weefselsnede. "In situ" is een Latijnse uitdrukking die "op zijn plaats" betekent. En ten slotte verwijst "hybridisatie" naar de complementaire binding van een synthetisch geproduceerd RNA-molecuul aan een mRNA-transcript binnen de cel van een organisme.
Deze video zal de procedure, de verwachte resultaten en geselecteerde toepassingen van deze techniek demonstreren die een beter begrip van ontwikkelingsstoornissen kunnen toelaten.
Genes die ten grondslag liggen aan de morfogenese van organismen worden gedurende het verloop van de embryonale ontwikkeling uitgedrukt in tijdelijk en ruimtelijk beperkte patronen.
Synthetisch geproduceerde RNA-sondes, ribosondes genoemd, worden gebruikt om mRNA's te detecteren door complementaire binding. Ribosondes zijn gelabeld met speciale nucleotiden die "haptenen" bevatten, zoals dinitrofenol, biotine of digoxenine. Haptenen zijn moleculen die een immuunrespons kunnen oproepen wanneer ze aan grotere moleculen zijn gehecht, en zijn daarom doelwitten voor antilichaambinding. Deze detectie-antilichamen zijn geconjugeerd aan enzymen, zoals meeldraaierperoxidase of alkalische fosfatase, die chemische reacties katalyseren waarbij een fluorescerende of gekleurde kleurstof kan worden afgezet.
Traditionele in situ hybridisatietechnieken vereisen de voorbereiding van weefselsecties van een embryo om de detectie van de interne structuren te vergemakkelijken. Als gevolg hiervan zal een volledige beoordeling van genexpressie in het hele organisme moeten worden gereconstrueerd uit de 5-6 μm weefselsneden met behulp van computersoftware. Met de ontwikkeling van whole-mount-technieken kan echter genexpressieanalyse over grotere afstanden binnen het hele embryo worden verkregen.
Nadat we de principes achter whole-mount in situ hybridisatie hebben bekeken, laten we nu de experimentele protocol stap voor stap doorlopen.
De eerste stap in deze procedure omvat de identificatie van de doelsequentie in het modelorganisme dat onderzocht zal worden. De doel-DNA-sequentie wordt vervolgens door PCR aangemaakt met primers die RNA-polymerase-initiatiesequenties bevatten. De aangemaakte DNA-sjabloon wordt nu in vitro getranscribeerd met hapten-gelabelde nucleotiden. Deze hapten-gelabelde ribosonde is nu klaar voor de hybridisatie-stap.
Embryo's worden voorbereid op hybridisatie via fixatie met formaldehyde, een cross-linking reagens dat eiwitten stabiliseert en beschermt tegen RNases. Na fixatie wordt het formaldehyde verwijderd door het embryo meerdere keren te wassen met fosfaatgebufferd zoutoplossing met een kleine hoeveelheid detergent, zoals Tween. Om cellulaire lipiden te verwijderen en het binnendringen van de sonde in de weefsels te vergemakkelijken, worden embryo's gedehydrateerd in een gegradueerde reeks methanolwasbeurten, bijvoorbeeld: 25%, 50%, 75%, 100% methanol. Embryo's kunnen worden bewaard in 100% methanol gedurende maximaal een maand (of meer) bij -20°C.
Om embryo's voor hybridisatie voor te bereiden, moeten ze worden gerehydrateerd door een gegradueerde reeks methanolwasbeurten met progressief minder methanol per wasbeurt. Embryo's worden vervolgens gedigesteerd met een protease om de diffusie van ribosonde in de weefsels te vergemakkelijken. De gelabelde ribosonde wordt aan het embryo toegevoegd en de hybridisatie wordt uitgevoerd.
Post-hybridisatie wasbeurten worden uitgevoerd om niet-specifieke hybridisaties te verwijderen. RNases A en T1 worden toegevoegd om onvolledig gehybridiseerde sondes te verwijderen door enkelstrengs RNA te verteren. De gehybridiseerde sondes worden gedetecteerd met een antilichaam-enzymconjugaat dat de hapten-gelabelde ribosondes bindt. Zoals eerder vermeld, worden enzymen zoals alkalische fosfatase geconjugeerd aan hapten-specifieke antilichamen, en worden gedetecteerd door het toevoegen van enzymsubstraten om een kleurverandering te veroorzaken. Het reactieproduct vormt een donker paarse neerslag die de locatie van het tot expressie gebrachte mRNA markeert, zoals te zien is in dit voorbeeld.
Nu u weet hoe u whole-mount in situ hybridisatie uitvoert, laten we enkele toepassingen van de techniek bekijken.
Whole-mount in situ hybridisatie is gebruikt om wetenschappers te helpen dodelijke muggenoverdraagbare ziekten aan te pakken, zoals malaria, knokkelkoorts en het West-Nijlvirus. Door de genen die betrokken zijn bij muggenreproductie en -ontwikkeling te karakteriseren, kunnen nieuwe biologische of chemische insecticiden worden ontworpen om beter de ziekteverspreidende muggen te targeten.
Een andere toepassing van deze techniek betreft de karakterisering van genexpressiepatroonveranderingen geassocieerd met blootstelling aan teratogenen, of agentia die interfereren met de foetale ontwikkeling.
Hier werd whole-mount in situ hybridisatie gebruikt in een zebravismodel van foetaal alcoholsyndroom om genen te identificeren waarvan de expressiepatronen veranderen na blootstelling aan alcohol. Dit kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën om de gevolgen van alcoholblootstelling in utero te verminderen.
Whole-mount in situ hybridisatie kan ook worden gebruikt om fenotypische veranderingen geassocieerd met aangeboren ziekten te valideren. Mutaties geassocieerd met het Bardet-Biedl-syndroom werden via synthetisch geproduceerde mutante mRNA's in zebravis-embryo's geïntroduceerd. Na een bepaalde periode werden embryo's verdeeld in groepen op basis van de ernst van de defecten. Het visualiseren van de expressie van genen stroomafwaarts van het gemuteerde gen werd gebruikt om de fenotypische veranderingen te valideren. Zo kan whole-mount in situ hybridisatie in combinatie met fenotypische scorering een beter begrip van de rollen van specifieke mutaties die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsstoornissen vergemakkelijken.
Whole-mount in situ hybridisatie is een krachtige techniek die wetenschappers in staat stelt de moleculaire basis van embryonale ontwikkeling te begrijpen. "Whole-mount" geeft aan dat het hele embryo wordt gebruikt, niet alleen een weefselsnede. "In situ" is een Latijnse uitdrukking die "op zijn plaats" betekent. En ten slotte verwijst "hybridisatie" naar de complementaire binding van een synthetisch geproduceerd RNA-molecuul aan een mRNA-transcript binnen de cel van een organisme.
Deze video zal de procedure, de verwachte resultaten en geselecteerde toepassingen van deze techniek demonstreren die een beter begrip van ontwikkelingsstoornissen kunnen toelaten.
Genes die ten grondslag liggen aan de morfogenese van organismen worden gedurende het verloop van de embryonale ontwikkeling uitgedrukt in tijdelijk en ruimtelijk beperkte patronen.
Synthetisch geproduceerde RNA-sondes, ribosondes genoemd, worden gebruikt om mRNA's te detecteren door complementaire binding. Ribosondes zijn gelabeld met speciale nucleotiden die "haptenen" bevatten, zoals dinitrofenol, biotine of digoxenine. Haptenen zijn moleculen die een immuunrespons kunnen oproepen wanneer ze aan grotere moleculen zijn gehecht, en zijn daarom doelwitten voor antilichaambinding. Deze detectie-antilichamen zijn geconjugeerd aan enzymen, zoals meeldraaierperoxidase of alkalische fosfatase, die chemische reacties katalyseren waarbij een fluorescerende of gekleurde kleurstof kan worden afgezet.
Traditionele in situ hybridisatietechnieken vereisen de voorbereiding van weefselsecties van een embryo om de detectie van de interne structuren te vergemakkelijken. Als gevolg hiervan zal een volledige beoordeling van genexpressie in het hele organisme moeten worden gereconstrueerd uit de 5-6 μm weefselsneden met behulp van computersoftware. Met de ontwikkeling van whole-mount-technieken kan echter genexpressieanalyse over grotere afstanden binnen het hele embryo worden verkregen.
Nadat we de principes achter whole-mount in situ hybridisatie hebben bekeken, laten we nu de experimentele protocol stap voor stap doorlopen.
De eerste stap in deze procedure omvat de identificatie van de doelsequentie in het modelorganisme dat onderzocht zal worden. De doel-DNA-sequentie wordt vervolgens door PCR aangemaakt met primers die RNA-polymerase-initiatiesequenties bevatten. De aangemaakte DNA-sjabloon wordt nu in vitro getranscribeerd met hapten-gelabelde nucleotiden. Deze hapten-gelabelde ribosonde is nu klaar voor de hybridisatie-stap.
Embryo's worden voorbereid op hybridisatie via fixatie met formaldehyde, een cross-linking reagens dat eiwitten stabiliseert en beschermt tegen RNases. Na fixatie wordt het formaldehyde verwijderd door het embryo meerdere keren te wassen met fosfaatgebufferd zoutoplossing met een kleine hoeveelheid detergent, zoals Tween. Om cellulaire lipiden te verwijderen en het binnendringen van de sonde in de weefsels te vergemakkelijken, worden embryo's gedehydrateerd in een gegradueerde reeks methanolwasbeurten, bijvoorbeeld: 25%, 50%, 75%, 100% methanol. Embryo's kunnen worden bewaard in 100% methanol gedurende maximaal een maand (of meer) bij -20°C.
Om embryo's voor hybridisatie voor te bereiden, moeten ze worden gerehydrateerd door een gegradueerde reeks methanolwasbeurten met progressief minder methanol per wasbeurt. Embryo's worden vervolgens gedigesteerd met een protease om de diffusie van ribosonde in de weefsels te vergemakkelijken. De gelabelde ribosonde wordt aan het embryo toegevoegd en de hybridisatie wordt uitgevoerd.
Post-hybridisatie wasbeurten worden uitgevoerd om niet-specifieke hybridisaties te verwijderen. RNases A en T1 worden toegevoegd om onvolledig gehybridiseerde sondes te verwijderen door enkelstrengs RNA te verteren. De gehybridiseerde sondes worden gedetecteerd met een antilichaam-enzymconjugaat dat de hapten-gelabelde ribosondes bindt. Zoals eerder vermeld, worden enzymen zoals alkalische fosfatase geconjugeerd aan hapten-specifieke antilichamen, en worden gedetecteerd door het toevoegen van enzymsubstraten om een kleurverandering te veroorzaken. Het reactieproduct vormt een donker paarse neerslag die de locatie van het tot expressie gebrachte mRNA markeert, zoals te zien is in dit voorbeeld.
Nu u weet hoe u whole-mount in situ hybridisatie uitvoert, laten we enkele toepassingen van de techniek bekijken.
Whole-mount in situ hybridisatie is gebruikt om wetenschappers te helpen dodelijke muggenoverdraagbare ziekten aan te pakken, zoals malaria, knokkelkoorts en het West-Nijlvirus. Door de genen die betrokken zijn bij muggenreproductie en -ontwikkeling te karakteriseren, kunnen nieuwe biologische of chemische insecticiden worden ontworpen om beter de ziekteverspreidende muggen te targeten.
Een andere toepassing van deze techniek betreft de karakterisering van genexpressiepatroonveranderingen geassocieerd met blootstelling aan teratogenen, of agentia die interfereren met de foetale ontwikkeling.
Hier werd whole-mount in situ hybridisatie gebruikt in een zebravismodel van foetaal alcoholsyndroom om genen te identificeren waarvan de expressiepatronen veranderen na blootstelling aan alcohol. Dit kan helpen bij de ontwikkeling van therapieën om de gevolgen van alcoholblootstelling in utero te verminderen.
Whole-mount in situ hybridisatie kan ook worden gebruikt om fenotypische veranderingen geassocieerd met aangeboren ziekten te valideren. Mutaties geassocieerd met het Bardet-Biedl-syndroom werden via synthetisch geproduceerde mutante mRNA's in zebravis-embryo's geïntroduceerd. Na een bepaalde periode werden embryo's verdeeld in groepen op basis van de ernst van de defecten. Het visualiseren van de expressie van genen stroomafwaarts van het gemuteerde gen werd gebruikt om de fenotypische veranderingen te valideren. Zo kan whole-mount in situ hybridisatie in combinatie met fenotypische scorering een beter begrip van de rollen van specifieke mutaties die ten grondslag liggen aan ontwikkelingsstoornissen vergemakkelijken.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What does whole-mount in situ hybridization allow scientists to visualize?
Whole-mount in situ hybridization enables visualization of expressed RNA locations throughout an entire embryo. Synthetically produced RNA probes, called riboprobes, bind complementarily to target mRNA transcripts. This reveals spatial and temporal patterns of gene expression across the whole organism, providing insights into developmental genetics techniques and applications.
Q2: How are riboprobes labeled for detection in whole-mount in situ hybridization?
Riboprobes are labeled with special nucleotides containing haptens, such as dinitrophenol, biotin, or digoxygenin. Haptens are molecules that elicit immune responses when attached to larger molecules, making them targets for antibody binding. Detection antibodies conjugated to enzymes like horseradish peroxidase or alkaline phosphatase then catalyze reactions that deposit fluorescent or colored dyes.
Q3: Why is embryo fixation with formaldehyde important before hybridization?
Formaldehyde fixation stabilizes proteins and protects embryos against RNases, which would otherwise degrade RNA. After fixation, embryos are washed with phosphate buffered saline containing detergent to remove formaldehyde. This preparation step ensures the embryo is ready for subsequent dehydration and probe penetration.
Q4: What is the advantage of whole-mount techniques over traditional tissue section methods?
Traditional in situ hybridization requires reconstructing gene expression from 5-6 micrometer tissue slices using computer software. Whole-mount techniques eliminate this limitation by allowing gene expression analysis over larger distances within the entire embryo. This provides a complete assessment of spatial and temporal gene expression patterns without computational reconstruction.
Q5: How are riboprobes generated for whole-mount in situ hybridization?
Target DNA sequences are first identified and amplified by PCR using primers containing RNA polymerase initiation sequences. The amplified DNA template is then transcribed in vitro with hapten-labeled nucleotides to produce labeled riboprobes. These probes are now ready for the hybridization step with embryonic tissues.
Q6: What role do post-hybridization washes play in the technique?
Post-hybridization washes remove nonspecific hybridizations and incompletely bound probes. RNases A and T1 are added to digest single-stranded RNA that did not properly hybridize. This ensures that only specifically hybridized probes remain, improving signal accuracy and reducing background noise in the final detection.
Q7: How is whole-mount in situ hybridization being applied to understand developmental disorders?
Researchers use whole-mount in situ hybridization to characterize gene expression changes associated with teratogens and congenital diseases. In zebrafish models of fetal alcohol syndrome, the technique identified genes with altered expression after alcohol exposure. Combined with phenotypic scoring, it validates how specific mutations underlying developmental defects affect gene expression downstream.
Hoofdstukken in deze video
0:00
Overview
0:56
Concepts Behind In Situ Hybridization
2:27
Target Identification and Probe Development
5:15
Applications
7:17
Summary