Name: Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Ontdek hoe transcriptiefactoren het microRNA-transcriptoom reguleren met data mining, shRNA-transfectie en bio-informatica-analyse. Deze methode biedt inzicht in genregulatie en genexpressie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een subsidie ​​van de CLL Global Research Foundation. De Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health door middel van een Cancer Center Ondersteuning Grant (P30CA16672).

1. Identificeer transcriptiefactorbindingsplaatsen in de promotor van MicroRNA genen Met behulp van Data Mining Approach <ol><li> Gebruik de Universiteit van Californië in Santa Cruz (UCSC) genoom browser naar chromatine immunoprecipitatie (ChIP) sequencing gegevens die in het kader van de Encyclopedia of DNA-element (ENCODE) project te halen. <ol><li> Open de tabel browser in de UCSC genoom browser. </li><li> Gebruik de volgende specificaties om de tafel te pakken: Clade: (Zoogdieren), genoom: (Human), Montage: (Feb2009 (GRch37 / hg18)), de groep: (verordening), track (TxnFactorChIP), tabel: (weEncoderesTFbsCo7steredv3), regio : (Genome), output formaat (alle genen van geselecteerde tabel). </li><li> Sla de output van 1.1.2 als een txt-bestand en in een spreadsheet. </li><li> Sorteren en filteren voor de transcriptiefactor van belang (bijvoorbeeld, STAT2). </li></ol></li><li> Gebruik de lijst van microRNA promotors gebaseerd op H3K4me3 epigenetica handtekening verkrijgbaar bij Baeer et al. 9 </sup&gt;. Kopieer deze lijst in een .txt bestand. </li><li> Aan de hand van coördinaten op het menselijk genoom overeenkomen, breng de gegevens van 1.1 en 1.2 (bv STAT3 bindend vermeende microRNA promotors) en het bepalen van de mediane affiniteit met behulp van de code geschreven in C scherp als omschreven in aanvullende codering bestand 1. </li></ol> 2. Gebruik shRNA naar Down-reguleren van de expressie van een transcriptiefactor of Interest <ol><li> Plaat 1,5 x 10 6 cellen van 293 humane embryonale niercellijn in 10 cm plaat bij ongeveer 50% confluentie (DMEM met 10% FBS). </li><li> Transfecteren van cellen 293 humane embryonale niercellijn met 5 ug groene fluorescentie eiwit (GFP) lentivirus die shRNA gericht naar de transcriptiefactor van interesse en met 5 ug verpakkingsvectoren middels transfectie reagens voor hechtende cellen volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Als controle transfecteren van de cellen van 293 humane embryonale niercellijn metscrambled shRNA en de verpakking vectoren volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Blijf transfectiemengsel op cellen gedurende 16 uur (bij 37 ° C, CO2 incubator) en media veranderen in 10 ml vers 10% DMEM medium met 10% FBS. </li><li> Wacht 48 uur na transfectie, centrifuge de celkweek (300 x g, 5 min) en het verzamelen van besmettelijke supernatant. Filtreer de bovenstaande vloeistof door een 0,45 pm spuitfilter (25-mm oppervlakteactieve gratis celluloseacetaatmembraan) tot een drijvend cellen te verwijderen. </li><li> Concentreer de supernatant en het verzamelen van de lentivirus met behulp van een ultracentrifugale filter apparaat met een drempel van 100 kDa. Spin bij 950 g gedurende 30 - 60 min, totdat het volume concentraat geweest tot minder dan 250 pl. Bewaar de geconcentreerde virus bij -80 ° C. </li><li> Transfecteren de cellen met de lentivirus. Verwijderen lentivirus bevroren van -80 ° C vriezer en ontdooien bij kamertemperatuur. Transfer 100 ul virale supernatant naar een nieuwe 1,5 ml microcentrifugebuis. <ol><li> Bring het volume in de buis 1 ml met verminderde serum medium. Voeg hexadimethrinebromide aan 1 ml virussuspensie voor eindconcentratie van 10 ng / ml, meng voorzichtig en laat het mengsel staan ​​gedurende 5 min. </li></ol></li><li> Centrifugeer 5 x 10 6 cellen per transductie en voorzichtig resuspendeer de celpellet in 0,5 ml medium bevattende virus. Laat de cellen blijven in de incubator voor 4-24 uur, voeg 0,5 ml medium met 20% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 10% FBS. </li><li> Wacht 48 tot 72 uur en vlekken op de cellen met propidiumjodide (PI) en groene fluorescerende eiwit (GFP) volgens de instructies van de fabrikant. Bescherm de cellen tegen licht en gebruik een FACS sorter om de tarieven van GFP + / PI te meten - cellen. Aangezien PI vlekken alleen dode cel, dit percentage is een schatting van transfectie-efficiëntie in levende cellen. </li><li> Sorteren positieve celpopulatie GFP expressie (GFP +) van FACS sorter zoals eerder beschreven 10. </li><li> gebruik Western immunologische blotting zoals eerder beschreven 10 om de niveaus van een transcriptiefactor van interesse te bepalen voor en na het infecteren van de cellen van belang (bijvoorbeeld CLL cellen) met aangewezen shRNA. </li></ol> 3. Bepaal de expressie van MicroRNA Transcriptome in cellen die met Transcription Factor-shRNA <ol><li> Isoleer RNA met een commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant. </li><li> Label de RNA en hybridiseren aan microRNA microarray 11. </li><li> Bepaal de verschillend tot expressie microRNA in cellen die met transcriptiefactor-shRNA of met lege vector controls 5. </li><li> Valideren van de microarray resultaten voor het grootste differentieel tot expressie microRNA&#39;s met behulp van real-time PCR 5. </li></ol> 4. Bepaal de overlap tussen de Bio-informatica en de shRNA aanpak bij het beschrijven van de transcriptiefactor Dependent Transcriptome <ol><li> detHermelijn het verwachte en waargenomen verhoudingen van microRNA genen die transcriptiefactor bindingsplaatsen in hun promoters haven en werden neerwaarts gereguleerd in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen, het volgende doen: <ol><li> Het verkrijgen van de verhouding van genen die de transcriptiefactor van belang de haven in hun promotor / totaal microRNA in de lijst gegenereerd in 1.3. Deze lijst is de verwachte verhouding (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal microRNA genen getest = 0,25). </li><li> Bepaal het aantal genen die in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen werden neerwaarts gereguleerd in de lijst gegenereerd in 3.3 en heeft transcriptiefactor van belang bindende plaatsen in de lijst gegenereerd in 1.3. Dit nummer / Totaal aantal genen neerwaarts gereguleerd is de waargenomen ratio (bijv microRNA genen met STAT3 binding sites / totaal aantal neerwaarts gereguleerd microRNAs = 0,6). </li></ol></li&gt; <li> Gebruik χ2 statistieken de waargenomen en verwachte verhoudingen die hierboven zijn gegenereerd vergelijken en bepalen of de lijst van genen die neerwaarts gereguleerd werden in transcriptiefactor-shRNA getransfecteerde cellen zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen in hun promotor. </li></ol>

<ol><li>Bentwich, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hundreds+of+conserved+and+nonconserved+human+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of hundreds of conserved and nonconserved human microRNAs.</a> Nat Genet. 37, 766-770 (2005).</li>
<li>Hata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functions of microRNAs in cardiovascular biology and disease.</a> Annu Rev Physiol. 75, 69-93 (2013).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+target+recognition+and+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.</a> Cell. 136, 215-233 (2009).</li>
<li>Piriyapongsa, J., Jordan, I. K., Conley, A. B., Ronan, T., Smalheiser, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+highly+enriched+within+microRNA+precursor+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are highly enriched within microRNA precursor sequences.</a> Biol Direct. 6, 61(2011).</li>
<li>Rozovski, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29-3+regulates+microRNA+gene+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Signal transducer and activator of transcription (STAT)-3 regulates microRNA gene expression in chronic lymphocytic leukemia cells.</a> Mol Cancer. 12, 50(2013).</li>
<li>Turner, M. J., Slack, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+microRNA+expression+in+C.+elegans%3A+promoting+better+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of microRNA expression in C. elegans: promoting better understanding.</a> RNA Biol. 6, 49-53 (2009).</li>
<li>Cui, Q., Yu, Z., Pan, Y., Purisima, E. O., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+preferentially+target+the+genes+with+high+transcriptional+regulation+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs preferentially target the genes with high transcriptional regulation complexity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 733-738 (2007).</li>
<li>Yamakuchi, M., Lowenstein, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34%2C+SIRT1+and+p53%3A+the+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">MiR-34, SIRT1 and p53: the feedback loop.</a> Cell Cycle. 8, 712-715 (2009).</li>
<li>Baer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter+DNA+hypermethylation+and+hypomethylation+is+associated+with+aberrant+microRNA+expression+in+chronic+lymphocytic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter DNA hypermethylation and hypomethylation is associated with aberrant microRNA expression in chronic lymphocytic leukemia.</a> Cancer Res. 72, 3775-3785 (2012).</li>
<li>Hazan-Halevy, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+is+constitutively+phosphorylated+on+serine+727+residues%2C+binds+DNA%2C+and+activates+transcription+in+CLL+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 is constitutively phosphorylated on serine 727 residues, binds DNA, and activates transcription in CLL cells.</a> Blood. 115, 2852-2863 (2010).</li>
<li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TARBP2+mutation+in+human+cancer+impairs+microRNA+processing+and+DICER1+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A TARBP2 mutation in human cancer impairs microRNA processing and DICER1 function.</a> Nat Genet. 41, 365-370 (2009).</li>
<li>Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+STAT+family+proteins%3A+lessons+from+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Functional roles of STAT family proteins: lessons from knockout mice.</a> Stem Cells. 17, 138-146 (1999).</li>
<li>Frank, D. A., Mahajan, S., Ritz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+lymphocytes+from+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+contain+signal+transducer+and+activator+of+transcription+%28STAT%29+1+and+STAT3+constitutively+phosphorylated+on+serine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">B lymphocytes from patients with chronic lymphocytic leukemia contain signal transducer and activator of transcription (STAT) 1 and STAT3 constitutively phosphorylated on serine residues.</a> J Clin Invest. 100, 3140-3148 (1997).</li>
<li>Calin, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+reveals+distinct+signatures+in+B+cell+chronic+lymphocytic+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 11755-11760 (2004).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+the+encyclopedia+of+DNA+elements+%28ENCODE%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">A user's guide to the encyclopedia of DNA elements (ENCODE).</a> PLoS biology. 9, e1001046(2011).</li>
<li>Miranda, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern-based+method+for+the+identification+of+MicroRNA+binding+sites+and+their+corresponding+heteroduplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A pattern-based method for the identification of MicroRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes.</a> Cell. 126, 1203-1217 (2006).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489, 57-74 (2012).</li>
<li>Lau, J. C., Hanel, M. L., Wevrick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+and+imprinted+epigenetic+modifications+of+the+human+NDN+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific and imprinted epigenetic modifications of the human NDN gene.</a> Nucl Acids Res. 32, 3376-3382 (2004).</li>
<li>Corcoran, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+mammalian+microRNA+promoters+emerge+from+polymerase+II+chromatin+immunoprecipitation+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Features of mammalian microRNA promoters emerge from polymerase II chromatin immunoprecipitation data.</a> PLoS One. 4, e5279(2009).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Feuerbach, L., Bhadra, T., Lengauer, T., Bandyopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+transcription+start+site+prediction+with+multi-objective+feature+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Stat+Appl+Genet+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA transcription start site prediction with multi-objective feature selection.</a> Stat Appl Genet Mol Biol. 11, Article 6 (2012).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Het mechanisme dat het RNA polymerase II de transcriptie afhankelijke eiwit-coderende genen is uitgebreid bestudeerd. Hoewel deze elementen maken slechts 1% - 2% van het menselijk genoom, bewijsmateriaal van de ENCODE project suggereren dat meer dan 80% van het menselijk genoom transcriptie 17 kan ondergaan en wat reguleert de transcriptie van de niet-coderende DNA-elementen nog zwaar 6 . Verschillende studies waaruit bleek dat Pol II is ook verantwoordelijk voor de tra...

MicroRNAs zijn endogene kleine niet coderende RNA&#39;s regelgeving die typisch functioneren als negatieve regulatoren van mRNA expressie in het post-transcriptionele niveau. Ongeveer 1000 niet coderende 20-25 nucleotiden lang microRNA worden in het menselijk genoom 1,2. MicroRNAs genexpressie tot canonieke basenparing tussen het zaad sequentie van microRNA en zijn complementaire sequentie seed match, die gewoonlijk is gelegen aan het 3 &#39;onvertaalde gebied (UTR) van het doelwit mRNA. Gezamenlijk microRNAs reguleren van meer dan 30% van de proteïne-coderende genen 3, maar is slechts weinig bekend over de transcriptie van DNA van microRNAs. Er is gesuggereerd dat de regulering van microRNA transcriptie vergelijkbaar met die van mRNA 4,5. Vooral vergelijkbaar met de activiteit bevorderen transcriptie van eiwitcoderende genen, transcriptie factoren zijn die de transcriptie van miRNA 6 activeert. Transcriptiefactor-microRNA samenspel is gemeld als een modulator factor van genexpressie 7, en kunnen vormen ook feed-back en feed-forward loops. Bijvoorbeeld Yamakuchi et al. Rapporteerde een terugkoppellus waarin p53 induceert de expressie van microRNA34a, waardoor remt translatie van het p53 repressor SIRT en daardoor p53 activiteit 8 toe. Dat specifieke voorbeelden van transcriptie factor afhankelijke expressie van miRNA gemeld wordt geaccepteerd als die informatie geeft over hoe een transcriptiefactor van interesse reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom ontbreekt. Het doel van het protocol hierin voorgesteld is om een ​​diepgaande beschrijving van transcriptiefactor-afhankelijke regulatie van het microRNA-transcriptoom bieden. Door het combineren van publiekelijk beschikbare gegevens, bio-informatica hulpmiddelen en het gebruik van microarray technologie, zou onderzoekers die dit algoritme volgen in staat om op een genomische schaal om vast te leggen hoe eentranscriptiefactor in elk celtype van belang reguleert de expressie van microRNA-transcriptoom en een vermeende bijdrage van de transcriptiefactor mRNA verkennen in microRNA expressie reguleren.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;m spuitfilter</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultracentrifugaal filterapparaat met een drempel van 100&nbsp;kDa</td><td>Merck Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybren</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reagens</td><td>Life Tachnologies (Invitrogen)</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>293 Cellijn mens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85120602</td><td></td></tr></tbody></table>

het beschrijven van een transcriptiefactor afhankelijk verordening van het microrna transcriptome

Describing a Transcription Factor Dependent Regulation of the MicroRNA Transcriptome

Terwijl de transcriptieregulatie van eiwitcoderende genen uitgebreid bestudeerd weinig bekend over hoe transcriptiefactoren betrokken zijn bij transcriptie van niet-coderende RNA&#39;s specifiek van miRNA. Hier stellen we een strategie om de mogelijke rol van transcriptiefactor studeren in het reguleren van transcriptie van microRNA&#39;s met behulp van publiekelijk beschikbare gegevens, computational resources en high throughput data. We gebruiken de H3K4me3 epigenetische handtekening aan microRNA promotors en chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -sequencing data identificeren van de ENCODE project om microRNA promotors die zijn verrijkt met transcriptiefactor bindingsplaatsen te identificeren. Door het transfecteren van cellen plaats met shRNA gericht op een transcriptiefactor van interesse en het onderwerpen van de cellen aan microRNA array, onderzoeken we het effect van deze transcriptiefactor op de microRNA transcriptoom. Als illustratief voorbeeld gebruiken we ons onderzoek naar het effect van STAT3 op microRNA transcriptoom van chronische lymphocytic leukemie (CLL) cellen.

STAT3 is een transcriptiefactor die gewoonlijk induceert de transcriptie van genen die anti- apoptotische en proliferatieve effecten 12 hebben. Of STAT3 beïnvloeden ook de niet-coderende RNA transcriptoom is momenteel niet bekend. In alle CLL cellen STAT3 constitutief gefosforyleerd op serine residuen 707 10,13. Fosfoserine STAT3 shuttles naar de kern, bindt aan DNA en activeert genen bekend zijn geactiveerd door tyrosine pSTAT3 in andere celtypen tot 10....

Hier stellen we een strategie voor om het effect van een transcriptiefactor van belang op het microRNA-transcriptoom te bestuderen met behulp van openbaar beschikbare gegevens, computationele bronnen en high-throughput gegevens van microRNA-arrays na het transfecteren van cellen met kleine hairpin (sh)RNA die zich richten op een transcriptiefactor van belang.

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

While the transcription regulation of protein coding genes was extensively studied, little is known on how transcription factors are involved in ...

Het algemene doel van deze methodologie is om te beschrijven hoe een transcriptiefactor van belang het microRNA-transcriptoom reguleert. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen over de vraag of transcriptiefactoren die de transcriptie van eiwitcoderende genen moduleren, ook betrokken zijn bij de transcriptie van microRNA's. Het belangrijkste voordeel van deze methodologie is dat het datamining, laboratoriumgegevens en bioinformatische analyse integreert om een uitgebreide beschrijving te geven van de transcriptie van microRNA-genen die afhankelijk is van de activiteit van de transcriptiefactor van belang.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de interactie tussen de transcriptie van microRNA-genen en de activiteit van de transcriptiefactorstatus, is het belangrijk om te onthouden dat dit een beschrijvende methode is en dat bevestiging van een dergelijke associatie via aanvullende assays moet gebeuren. Begin met het openen van een genoombrowser, zoals de genoombrowser van de University of California Santa Cruz, om chromatin immunoprecipitation sequencing-data te extraheren. Ga eenmaal op de site naar het bovenmenu, selecteer Tools en open de Table Browser.Voer de specificaties, zoals hier getoond, in de respectievelijke vakken in en selecteer vervolgens Get Output om de tabel te extraheren. Sla de output op als een tekstbestand. Importeer daarna het bestand in een spreadsheet.Sorteer in het spreadsheetprogramma de kolom met namen en filter de resultaten op een transcriptiefactor van belang, zoals STAT2. Kopieer vervolgens de lijst met microRNA-promotors op basis van hun H3K4me3 epigenetische signatuur en plak deze lijst in een txt-bestand. Gebruik daarna de in SQL geschreven aanvullende code, die is opgenomen in de supplementaire databestanden, om de verzamelde gegevens in kaart te brengen en de mediane bindingsaffiniteit te bepalen.Voeg eerst 1,5 miljoen HEK293-cellen toe aan een schaal van 10 centimeter en voeg DMEM toe, aangevuld met 10% FBS. Kweek de cellen gedurende 24 uur tot ze een confluentie van ongeveer 50% bereiken. Vervang vervolgens het medium.Voeg vervolgens een transfectie-reagens toe in combinatie met vijf microgram van een Lentivirus met een groen fluorescent eiwit dat het doelgerichte shRNA bevat en vijf microgram verpakkingsvectoren, overeenkomstig de instructies van de fabrikant. Transfect als controle een identieke plaat cellen met scrambled shRNA en de verpakkingsvectoren. Incubeer het transfectiemengsel op de cellen gedurende 16 uur en vervang daarna het medium door 10 milliliters vers DMEM-medium aangevuld met 10% FBS.Verwijder 48 uur na transfectie het medium van de cellen. Centrifugeer vervolgens vijf minuten om het infectieuze supernatant te verzamelen. Filtreer het supernatant door een spuitfilter van 0,45 micron om eventuele zwevende cellen te verwijderen.Voeg vervolgens het medium toe aan een ultracentrifugale filtereenheid met een drempelwaarde van 100 kilodalton. Centrifugeer het medium om het Lentivirus te concentreren totdat het volume minder dan 250 microliter is. Breng de resterende vloeistof over in een cryobuis en bewaar het geconcentreerde virus bij minus 80 graden Celsius tot het nodig is.Wanneer u klaar bent om verder te gaan, haalt u het bevroren lentivirus uit de vriezer van -80 °C en laat u het buisje op kamertemperatuur komen. Breng 100 µL viraal supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 mL en voeg 900 µL serumvrij medium toe. Voeg vervolgens 10 ng/mL hexadimethrine bromide toe aan de ene mL virussuspensie.Meng de buis voorzichtig en laat het mengsel vijf minuten staan. Oogst vijf miljoen cellen voor elke geplande transductie en resuspendeer vervolgens het celpellet voorzichtig in 0,5 milliliter medium met virus. Breng de cellen over naar een 12-wellplaat en incubeer ze gedurende vier tot 24 uur.Voeg vervolgens nog eens 0,5 milliliters medium toe met 20% FBS. Oogst de cellen 48 tot 72 uur na transductie en kleur ze met propidiumjodide volgens de instructies van de fabrikant. Bescherm de cellen na het kleuren tegen licht en gebruik flowcytometrie om de transductie-efficiëntie te schatten door de percentages GFP-positieve, propidiumjodide-negatieve cellen te meten.Verzamel vervolgens de gesorteerde GFP-positieve celpopulatie en extraheer hun eiwitten. Gebruik ten slotte western blotting om de niveaus van de beoogde transcriptiefactor te bepalen vóór en na het infecteren van de cellen met het aangewezen shRNA. Na de transfectie van CLL-cellen met STAT3 shRNA waren zowel de niveaus van STAT3 mRNA als van STAT3-eiwit significant afgenomen.Daarnaast toonde een microRNA-array van de CLL-cellen 23 microRNA's aan waarvan de expressie significant verschilde tussen CLL-cellen die waren getransfecteerd met STAT3 shRNA en CLL-cellen die waren getransfecteerd met een lege vector. De resultaten van de microRNA-array werden voor zeven van de genen, hier weergegeven, gevalideerd met behulp van kwantitatieve RT-PCR. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals chromatine-immunoprecipitatie, een electromobility shift assay en een differentie-assay, worden uitgevoerd om te valideren dat deze transcriptiefactor de promotor van een specifiek doelgen bindt en activeert.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u bio-informatica-analyse, openbaar beschikbare gegevens en het uitschakelen van een transcriptiefactor via een shRNA-benadering kunt integreren om te ontdekken hoe deze transcriptiefactor de expressie van microRNA-genen reguleert.

describing-transcription-factor-dependent-regulation-microrna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

MicroRNA (miRNAs) zijn belangrijke regulatoren van genexpressie en is aangetoond dat een rol spelen bij talrijke biologische processen. Om beter te begrijpen miRNA-UTR interacties, hebben we een genoom-brede collectie van drie UTR luciferase reporters gepaard met een nieuw luciferase gen en assay reagens, het LightSwitch systeem.

Het identificeren van doelen van Human microRNA&#39;s met de LightSwitch Luciferase Assay System met behulp van 3&#39;UTR-reporter constructen en een microRNA Mimic in hechtende cellen

We beschrijven hier een methode voor het reguleren van picornavirus-tropisme door sequenties die complementair zijn aan specifieke microRNA's in het virale genoom op te nemen. Dit protocol kan worden aangepast aan alle verschillende klassen van virussen met aanpassingen op basis van de lengte en aard van hun levenscyclus.

MicroRNA-gebaseerde verordening van Picornavirus Tropism

Dit verslag wordt een snelle en betrouwbare methode voor het valideren van mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs beschreven. Het gebruik van de methode synthetische biotinyleerd vergrendeld nucleïnezuur LNA gebaseerde miRNA bootst te vangen target mRNA. Vervolgens daar beklede magnetische kralen pulldown worden gebruikt de doelstelling mRNA voor kwantificering van qPCR polymerase-kettingreactie.

Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

We ontwikkelden een intronische microRNA-biogenese-reportertest voor gebruik in cellen in vitro met vier plasmiden: één met intronisch miRNA, één met het doelwit, één om een regulerend eiwit te overexpresseren en één voor Renilla luciferase. Het miRNA werd verwerkt en kon de expressie van luciferase controleren door zich aan de doelsequentie te binden.

Een Reporter Assay om intronische microRNA-rijping in zoogdiercellen te analyseren

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Wij beschrijven het gebruik van een gestopt-flow instrument zowel de reductieve en oxidatieve halve reacties van...

Toezicht op de reductieve en oxidatieve Half-reacties van een Flavin-afhankelijke mono-oxygenase met Gestopt-Flow Spectrofotometrie

We presenteren een combinatie van cryo-elektronenmicroscopie, lipide nanotechnologie en structuuranalyse aangebracht op het membraan gebonden structuur van twee zeer homologe FVIII vormen lossen: mens en varken. De in ons laboratorium ontwikkeld om de twee functionele recombinante FVIII vormen spiraalvormig organiseren negatief geladen lipide nanotubes (LNT) methode wordt beschreven.

Spiraalvormige Organisatie van Blood stollingsfactor VIII op Lipid nanobuisjes

Hierin beschrijven we eenvoudige werkwijzen voor de bereiding van vesicles, de inkapseling van transcriptie en translatie, en de controle van eiwitproductie. De verkregen celvrije systemen kunnen worden gebruikt als een uitgangspunt steeds complexe cellulaire nabootst.

De inkapseling van de Cell-free transcriptie en vertaling Machines in Blaasjes voor de bouw van Cellular Mimics

Ontdek hoe transcriptiefactoren het microRNA-transcriptoom reguleren met data mining, shRNA-transfectie en bio-informatica-analyse. Deze methode biedt inzicht in genregulatie en genexpressie.

Het beschrijven van een transcriptiefactor Afhankelijk verordening van het MicroRNA Transcriptome

Meer video's verkennen