Name: In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T13:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Leer een in vitro methode om fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit te meten in Leishmania celextracten zonder enzymzuivering. Dit protocol biedt inzicht in lipidenmetabolisme en fosfatidylcholine biosynthese.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies ARRA RO3 AI078145 en 1SC3GM113743 aan RZ.

1. Cell Extract Voorbereiding <ol><li> Groeien de Leishmania cellen in een steriele plastic fles afgesloten met luchtdichte deksel bij 26 ° C in een medium van 1x M199 aangevuld met 20 mM HEPES pH 7,4, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 5 ug / ml heem , 0,35 g / L NACO 2 H, 0,1 mM adenine en 2 ug / ml biopterine zonder schudden. Oogst de cellen door centrifugeren bij 1500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C wanneer zij een celdichtheid van 1-2 x 10 7 / ml bereikt. </li><li> Verwijder het supernatant met een pipet en was de cellen door resuspenderen de celpellet met een serologische pipet in de helft van het volume van de cultuur van koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, pH 7,4). Gooi celsupernatanten volgens BL2 veiligheidsrichtlijnen. </li><li> Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant met een pipet. Overgaan to de volgende stap of snap bevriezen de celpellet in vloeibare stikstof voor langdurige opslag bij -80 ° C (tot drie maanden). </li><li> Bereid 2x lysisbuffer (0,5 M sucrose, 0,1 M TrisHCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, en 2x proteaseremmer cocktail) en houd het bij 4 ° C op ijs. </li><li> Resuspendeer de celpellet (vers of bevroren) in gelijk volume 2 x lysisbuffer. Voeg 1x volume van glazen kralen. Vortex krachtig bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 2 volumes 1x lysis buffer en meng. Centrifuge cel extracten bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten om ongebroken cellen en kernen pellet. </li><li> Breng de supernatant met een pipet in een verse centrifugebuis en koel houden celextracten op ijs totdat de proef. </li></ol> 2. Bepaal de eiwitconcentratie van het celextract gebruiken Protein Estimation Kit Zoals bicinchoninezuur Assay <ol><li> Bereid de bicinchoninezuur (BCA) oplossing (1 ml / buis) door mengen van de BCA en koper (II) sulfate in een verhouding van 49: 1 (v / v). </li><li> Bereid de eiwitstandaarden van 0, 10, 20, 30, 40, 50, en 60 ug / ml door verdunning van een 10 mg / ml runderserumalbumine (BSA) voorraadoplossing in 1 ml porties van de BCA-oplossing. </li><li> Voeg 2 pi cellen uittreksels 1 ml BCA oplossing in duplo. Incubeer standaarden en eiwit monsters 10 minuten in een voorverwarmde 60 ° C waterbad. </li><li> Doorvoermonsters om ijs 3 min. Meet de absorptie van de standaarden en de eiwitmonsters met een spectrofotometer bij een golflengte van 562 nm. </li><li> Bereken de eiwitconcentratie van de celextracten met de BSA norm als referentie zoals in protocol van de fabrikant beschreven. Verdun celextracten een eiwitconcentratie van 10 mg / met 1x lysisbuffer ml. </li></ol> 3. Enzymatische Assay in 200 pi per buis LET OP: Draag de volgende stappen in een chemische kap. <ol><li> Test elk monster in tweevoud in een 15 mlconische buis. Bereid 20 pi 1 M TrisHCl pH 7,5 per buis en te houden op het ijs. Bereid 2 ml chloroform / methanol (1: 1 (v / v); stopoplossing) bij KT elke buis. </li><li> Pipetteer 20 ul van 1 M TrisHCl pH 7,5 per 15 ml conische buis op ijs. </li><li> Volg de straling veiligheid richtlijnen vanaf hier op. Voeg het equivalent van 0,06 pM (0,2 uCi) S - [Methyl 3 H] adenosyl-L-methionine en 50 uM koud SAM per buis voor een totaal van 50,06 uM SAM. Voeg x pi koud water waar x = 200 (20 (voor buffer) + 20 (voor mobiele extracten) + volume van koude en radioactieve SAM) per buis. </li><li> Overdracht elke conische buis met een voorverwarmde 30 ° C waterbad. Aan elke buis 20 gl celextracten (equivalent van 200 ug eiwit) om de reactie te starten. Incubeer de gewenste tijd (0-45 min). </li><li> Stop de reactie door toevoeging van 2 ml chloroform / methanol (1: 1, v / v; stopoplossing) aan elke buis. Breng de conische buis tot kamertemperatuur (20-256, C). </li></ol> 4. Lipid Extraction LET OP: Draag de volgende stappen in een chemische kap. <ol><li> Voeg 700 ul van water aan elke buis die het monster enzymatische reactie. Vortex krachtig gedurende 30 sec. Centrifugeer bij 1500 g gedurende 5 min bij RT om het organische scheiden van de waterfase. </li><li> Breng de onderste organische fase in een nieuwe 15 ml conische buis met een pipet. Voeg 1 ml water voor elke &quot;onderste fase&quot; met buis en vortex krachtig gedurende 30 sec. Centrifugeer opnieuw bij 1500 xg gedurende 5 min aan de organische scheiden van de waterfase. </li><li> Breng de onderste organische fase in een scintillatie-buisje met een pipet. Droge monsters onder een stroom N2. Gooi het water fasen met de niet-opgenomen radioactieve SAM en de radioactieve conische buizen per straling richtlijnen. </li><li> Voeg 2 ml / tube scintillatievloeistof. Meet de opgenomen radioactiviteit met een scintillatie counter volgens het protocol van de fabrikant en het gebruik instrument. </li><li> Bereken de enzymatische activiteit in nmol / mg eiwit met de volgende algemene formule: cpm waarde x 10 3 x [totale (radioactief en koud) concentratie van SAM (mm)] x 5 specifieke activiteit van radioactieve SAM (Ci / mmol) x [concentratie radioactieve SAM (mm)] OPMERKING: de bovenstaande protocol kan worden aangepast voor een SAM-concentratie-afhankelijke of een eiwit afhankelijk PEMT assay. Voor SAM concentratie afhankelijke enzymatische test wordt de tijd constant gehouden (15 min, die in het lineaire gebied) en verschillende hoeveelheden koude SAM wordt toegevoegd aan de test, terwijl voor eiwit afhankelijke PEMT assay SAM concentratie (we kozen 0,05 mM) en tijd worden constant gehouden (15 min). Ook de pH van de buffer kan zo nodig als sommige PEMT enzymen een verschillende optimale pH waarde veranderen. </li></ol>

<ol><li>Keogh, M. R., Courtney, P. D., Kinney, A. J., Dewey, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+phospholipid+N-.methyltransferases+from+Arabidopsis+and+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of phospholipid N-.methyltransferases from Arabidopsis and soybean.</a> J Biol Chem. 284 (23), 15439-15447 (2009).</li>
<li>Geiger, O., Lopez-Lara, I. M., Sohlenkamp, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+biosynthesis+and+function+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine biosynthesis and function in bacteria.</a> Biochim Biophys Acta. 1831 (3), 503-513 (2013).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+lipogenesis+in+white+adipose+tissue+contributes+to+the+resistance+to+high+fat+diet-induced+obesity+in+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Decreased lipogenesis in white adipose tissue contributes to the resistance to high fat diet-induced obesity in phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-deficient mice.</a> Biochim Biophys Acta. 1851 (2), 152-162 (2015).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+alters+plasma+VLDL+phospholipids+and+attenuates+atherosclerosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase alters plasma VLDL phospholipids and attenuates atherosclerosis in mice.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (9), 1349-1355 (2009).</li>
<li>Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+methylation+in+mammals%3A+from+biochemistry+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phospholipid methylation in mammals: from biochemistry to physiological function.</a> Biochim Biophys Acta. 1838 (6), 1477-1487 (2014).</li>
<li>Nishimaki-Mogami, T., Suzuki, K., Takahashi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+phosphatidylethanolamine+methylation+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins+by+cultured+rat+hepatocytes%3A+rapid+inhibition+of+phosphatidylethanolamine+methylation+by+bezafibrate+increases+the+density+of+apolipoprotein+B48-containing+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The role of phosphatidylethanolamine methylation in the secretion of very low density lipoproteins by cultured rat hepatocytes: rapid inhibition of phosphatidylethanolamine methylation by bezafibrate increases the density of apolipoprotein B48-containing lipoproteins.</a> Biochim Biophys Acta. 1304 (1), 21-31 (1996).</li>
<li>Noga, A. A., Zhao, Y., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+requirement+for+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+in+the+secretion+of+very+low+density+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An unexpected requirement for phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase in the secretion of very low density lipoproteins.</a> J Biol Chem. 277 (44), 42358-42365 (2002).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+repression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+%28PEMT%29+in+BRCA1-mutated+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Epigenetic repression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase (PEMT) in BRCA1-mutated breast cancer.</a> Oncotarget. 5 (5), 1315-1325 (2014).</li>
<li>Cui, Z., Houweling, M., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+rat+hepatoma+cell+growth+by+expression+of+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase-2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Suppression of rat hepatoma cell growth by expression of phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase-2.</a> J Biol Chem. 269 (40), 24531-24533 (1994).</li>
<li>Cui, Z., Shen, Y. J., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+correlation+between+expression+of+phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2+and+growth+rate+of+perinatal+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Inverse correlation between expression of phosphatidylethanolamine.N-.methyltransferase-2 and growth rate of perinatal rat livers.</a> Biochim Biophys Acta. 1346 (1), 10-16 (1997).</li>
<li>Minder, A. C., de Rudder, K. E., Narberhaus, F., Fischer, H. M., Hennecke, H., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylcholine+levels+in.Bradyrhizobium+japonicum.+membranes+are+critical+for+an+efficient+symbiosis+with+the+soybean+host+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylcholine levels in.Bradyrhizobium japonicum. membranes are critical for an efficient symbiosis with the soybean host plant.</a> Mol Microbiol. 39 (5), 1186-1198 (2001).</li>
<li>Kodaki, T., Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+phosphatidylethanolamine+methylation+pathway.+Cloning+and+characterization+of+two+distinct+methyltransferase+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast phosphatidylethanolamine methylation pathway. Cloning and characterization of two distinct methyltransferase genes.</a> J Biol Chem. 262 (32), 15428-15435 (1987).</li>
<li>Tanaka, Y., Amano, F., Maeda, M., Nishijima, M., Akamatsu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine+N-.methyltransferase%2C+the+enzyme+catalyzing+the+second+and+the+third+steps+in+the+phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+system%2C+from+mouse+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Med+Sci+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of phosphatidyl-N-.monomethylethanolamine N-.methyltransferase, the enzyme catalyzing the second and the third steps in the phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase system, from mouse liver microsomes.</a> Jpn J Med Sci Biol. 43 (3), 59-73 (1990).</li>
<li>Bibis, S. S., Dahlstrom, K., Zhu, T., Zufferey, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Leishmania+major+phosphatidylethanolamine+methyltransferases+LmjPEM1+and+LmjPEM2+and+their+inhibition+by+choline+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Leishmania major phosphatidylethanolamine methyltransferases LmjPEM1 and LmjPEM2 and their inhibition by choline analogs.</a> Mol Biochem Parasitol. 196 (2), 90-99 (2014).</li>
<li>deRudder, K. E., Thomas-Oates, J. E., Geiger, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobium+meliloti.+mutants+deficient+in+phospholipid+N-.methyltransferase+still+contain+phosphatidylcholine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Rhizobium meliloti. mutants deficient in phospholipid N-.methyltransferase still contain phosphatidylcholine.</a> J Bacteriol. 179 (22), 6921-6928 (1997).</li>
<li>Aktas, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+the+enzyme+properties+of+the+phospholipid+N-.methyltransferase+PmtA+from+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of the enzyme properties of the phospholipid N-.methyltransferase PmtA from Agrobacterium tumefaciens.</a> J Bacteriol. 191 (7), 2033-2041 (2009).</li>
<li>Ridgway, N. D., Vance, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+N-.methyltransferase+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine N-.methyltransferase from rat liver.</a> Methods Enzymol. 209, 366-374 (1992).</li>
<li>Gaynor, P. M., Carman, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylethanolamine+methyltransferase+and+phospholipid+methyltransferase+activities+from+Saccharomyces+cerevisiae.+Enzymological+and+kinetic+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylethanolamine methyltransferase and phospholipid methyltransferase activities from Saccharomyces cerevisiae. Enzymological and kinetic properties.</a> Biochim Biophys Acta. 1045 (2), 156-163 (1990).</li>
<li>Arondel, V., Benning, C., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+expression+in+Escherichia+coli.+of+a+gene+encoding+phosphatidylethanolamine+methyltransferase+%28EC+2.1.1.17%29+from+Rhodobacter+sphaeroides%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional expression in Escherichia coli. of a gene encoding phosphatidylethanolamine methyltransferase (EC 2.1.1.17) from Rhodobacter sphaeroides.</a> J Biol Chem. 268 (21), 16002-16008 (1993).</li>
<li>Wessel, M., Klusener, S., Godeke, J., Fritz, C., Hacker, S., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+of+Agrobacterium+tumefaciens.+requires+phosphatidylcholine+in+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Virulence of Agrobacterium tumefaciens. requires phosphatidylcholine in the bacterial membrane.</a> Mol Microbiol. 62 (3), 906-915 (2006).</li>
<li>Klusener, S., Aktas, M., Thormann, K. M., Wessel, M., Narberhaus, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+physiological+relevance+of+Agrobacterium+tumefaciens.+phosphatidylcholine+biosynthesis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Expression and physiological relevance of Agrobacterium tumefaciens. phosphatidylcholine biosynthesis genes.</a> J Bacteriol. 191 (1), 365-374 (2009).</li>
<li>Henderson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+encoding+Leishmania+donovani.S.-adenosylhomocysteine+hydrolase%2C+a+potential+target+for+antiparasitic+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biochem+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene encoding Leishmania donovani.S.-adenosylhomocysteine hydrolase, a potential target for antiparasitic chemotherapy.</a> Mol Biochem Parasitol. 53 (1-2), 169-183 (1992).</li>
<li>Koszalka, G. W., Krenitsky, T. A. 5'-Methylthioadenosine (MTA) phosphorylase from promastigote of Leishmania donovani. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoszalka%2C+GW+%22Purine+and+Pyrimidine+Metabolism+in+Man+V%2C+Adv+Exp+Med+Biol%22">Purine and Pyrimidine Metabolism in Man V, Adv Exp Med Biol</a>. Nyhan, W. L., Thompson, L. F., Watts, R. W. E. 131, Springer US. 559-563 (1986).</li>
<li>Biastoff, S., Teuber, M., Zhou, Z. S., Dräger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+activity+measurement+of+a+recombinant+putrescine+N.-methyltransferase+from+Datura+stramonium%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Med%22%5BJournal%5D)">Colorimetric activity measurement of a recombinant putrescine N.-methyltransferase from Datura stramonium.</a> Planta Med. 72 (12), 1136-1141 (2006).</li>
<li>Hendricks, C. L., Ross, J. R., Pichersky, E., Noel, J. P., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+colorimetric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled colorimetric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 326 (1), 100-105 (2004).</li>
<li>Cannon, L. M., Butler, F. N., Wan, W., Zhou, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stereospecific+colorimetric+assay+for+%28S.%2CS.%29-adenosylmethionine+quantification+based+on+thiopurine+methyltransferase-catalyzed+thiol+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A stereospecific colorimetric assay for (S.,S.)-adenosylmethionine quantification based on thiopurine methyltransferase-catalyzed thiol methylation.</a> Anal Biochem. 308 (2), 358-363 (2002).</li>
<li>Hoffman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+the+chiral+and+covalent+instability+of+S.-adenosyl-L-methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of the chiral and covalent instability of S.-adenosyl-L-methionine.</a> Biochemistry. 25 (15), 4444-4449 (1986).</li>
<li>Wu, S. E., Huskey, W. P., Borchardt, R. T., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chiral+instability+at+sulfur+of+S.-adenosylmethionine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chiral instability at sulfur of S.-adenosylmethionine.</a> Biochemistry. 22 (12), 2828-2832 (1983).</li>
<li>Dorgan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-coupled+continuous+spectrophotometric+assay+for+S.-adenosylmethionine-dependent+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for S.-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.</a> Anal Biochem. 350 (2), 249-255 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflict verklaard

Deze eenvoudige, snelle PEMT test maakt de kwantificering van gemethyleerde vormen van PE als gevolg van de overdracht van radioactieve methylgroepen van SAM op PE middels gehele celextract als eiwitbron. Het is snel, gevoelig en reproduceerbaar, en ook geschikt voor gezuiverde enzymen 17. Monomethyl- of dimethyl-PE kan worden toegevoegd aan de test indien het methyltransferase van belang is specifiek voor deze substraten plaats van PE 12,13,18,19. Als PEMT gezuiverde enzym wordt gebruikt, kan PE w...

Fosfatidylethanolamine methyltransferase (PEMT) enzymen katalyseren de covalente aanhechting van één of meer methylgroepen met S -adenosylmethionine (SAM) als methylgroepdonor op PE, monomethyl-dimethyl-PE of PE naar monomethyl-PE, dimethyl-PE en / of geeft fosfatidylcholine (PC). Deze enzymen zijn vrijwel overal in dierlijke cellen en schimmels. Ze kunnen ook in sommige planten 1 en ongeveer 10% van de bacteriën, met name die interageren met eukaryoten 2. PEMTs de biologie van de cel betrokken zijn niet alleen bijdragen aan de productie van PC, die de belangrijkste lipideklasse in dierlijke cellen, maar ook door te voldoen aan andere belangrijke cellulaire functies. In zoogdieren worden PEMTs voornamelijk tot expressie in de lever, waar zij nodig zijn voor normale afscheiding van zeer lage dichtheid lipoproteïne en ze dragen ook bij aan dieet-geïnduceerde obesitas 3, atherosclerose 4 en insuline weerstandkomstig 5. Daarnaast zijn zoogdieren PEMT eveneens uitgedrukt in adipocyten, hoewel lagere niveaus, en deelnemen vetafzetting 6, 7. PEMT rol in kanker ontwikkeling 8, 9 apoptose en celgroei 10 zijn ook aangetoond. In bacteriën zijn PEMT enzymen getoond belangrijk voor normale celgroei 2, virulentie 2 en symbiose met de gastplant 11 zijn. Het doel en de reden van het huidige protocol is het PEMT activiteit van volledige celextracten te meten zonder de noodzaak om het enzym te zuiveren. Twee verschillende protocollen ontwikkeld om PEMT te meten. De eerste en meest voorkomende meet de overdracht van getritieerd methylgroep van radioactieve SAM op PE, dat is het onderwerp van dit artikel. Dit protocol werd oorspronkelijk ontwikkeld om PEMT activiteit meet van gist 12 en zoogdiercellen (lever) 13 om een underst winnenanding PC biosynthese in deze cellen en de specificiteit van deze enzymen te bepalen. Later is deze techniek toegepast op andere celtypen zoals bacteriën 2 (met een basische pH-waarde voor de test hoewel 15) en protozoa parasieten 14. Deze techniek kan worden gebruikt met gehele celextracten en gezuiverd enzym, en kan mogelijk worden toegepast op elk celextract systeem. Een niet radioactieve assay is ook ontworpen dat steunt op de enzymatische kwantificering van S -adenosylhomocysteine ​​het transmethylatie product van SAM 16. Laatstgenoemde bepaling kan handiger omdat het geen betrekking radioactiviteit maar het is alleen geschikt voor gezuiverde enzymen.

<table><tbody><tr><td>S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine (specific activity of 5-15 Ci/mMole)</td><td>Perkin Elmer</td><td>NET155050UC</td><td>Deel het reagens in aliquoten en bevries het bij -20 &deg;C; volg de richtlijnen voor stralingsveiligheid tijdens het gebruik van dit reagens</td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Roche Life Sciences</td><td>11836170001</td><td>verdun het vers&nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskralen, zuur gewassen, 425-600 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchonidinezuur oplossing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9643</td><td></td></tr><tr><td>Koper (II) sulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2284</td><td></td></tr><tr><td>Scintillatieteller MicroBeta2 met 1-detector</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>2450-0010</td><td></td></tr><tr><td>Spectrofotometer Biomate 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>840208300</td><td></td></tr><tr><td>BSA stock oplossing (10 mg/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>Scintillatievloeistof&nbsp;</td><td>Research Product International Corp</td><td>111198</td><td></td></tr><tr><td>S-(5'-Adenosyl)-L-methionine chloride (hydrochloride)&nbsp;</td><td>Cayman Chemicals</td><td>13956</td><td>verdun het reagens in 20 mM HCl en bevries aliquots bij -80 &deg;C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

in vitro test te meten fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

Fosfatidylethanolamine-methyltransferases zijn biosynthetische enzymen die de overdracht katalyseren van een of meer methylgroep(en) vanaf S-adenosyl-L-methionine naar fosfatidylethanolamine, monomethyl-fosfatidylethanolamine of dimethyl-fosfatidylethanolamine om monomethyl-fosfatidylethanolamine, dimethyl-fosfatidylethanolamine of fosfatidylcholine te geven. Deze enzymen zijn alomtegenwoordig in dierlijke cellen, schimmels en worden ook gevonden in ongeveer 10% van de bacteriën. Ze vervullen verschillende belangrijke functies in de celfysiologie buiten hun directe rol in lipidemetabolisme zoals bij insulineresistentie, diabetes, atherosclerose, celgroei of virulentie. Het huidige manuscript rapporteert over een eenvoudige enzymatisch celvrij assay die de overdracht van getritieerd methylgroep(en) vanaf S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar fosfatidylethanolamine meet, met gebruik van hele celextracten als enzymbron. De resulterende gemethyleerde vormen van fosfatidylethanolamine zijn hydrofoob en kunnen dus worden gescheiden van wateroplosbaar S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine door organische extractie. Deze assay kan potentieel worden toegepast op elk ander celtype en worden gebruikt om remmers/medicijnen specifiek voor een fosfatidylethanolamine-methyltransferase van belang te testen zonder de noodzaak om het enzym te zuiveren.

Figuur 1 toont een tijdsafhankelijke PEMT test, die met Leishmania gehele celextract werd uitgevoerd als een enzym bron met endogene PE als substraat. De hoeveelheid radioactiviteit in de organische fase werd gekwantificeerd door scintillatietelling. De verkregen getallen werden gebruikt om de hoeveelheid getritieerd methylgroepen overgebracht naar PE te berekenen. De PEMT activiteit was lineair gedurende ongeveer 20 min. Vervolgens bereikte een plateau bij onge...

Het huidige rapport beschrijft een in vitro enzymatische test om fosfatidylethaanolaminmethyltransferase-activiteit te meten met behulp van Leishmania-celextracten. Deze test is gebaseerd op de overdracht van een radioactieve methylgroep van S-[Methyl-3H]adenosyl-L-methionine naar endogeen fosfatidylethaanolamine.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...

Het algemene doel van deze methodologie is het kwantificeren van de fosfatidylethanolamine-methyltransferase- of PEMT-activiteit uit hele cel-extracten. Met deze methode kunnen we belangrijke vragen binnen het vakgebied van het lipidemetabolisme beantwoorden, zoals het belang van de fosfatidylethanolamine-methyltransferases bij de biosynthese van fosfatidylcholine. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat de meting kan worden uitgevoerd op een heel cel-extract en dat zuivering van het enzym niet vereist is.Dit protocol kan inzicht verschaffen in hoe de parasiet zijn meest abundante lipide, fosfatidylcholine, synthetiseert. Dit protocol kan ook worden toegepast op andere celtypen, zoals zoogdiercellen en bacteriën. Groei van Leishmania-cellen in een steriele plastic fles, afgesloten met een luchtdichte dop bij 26 °C in aangevuld M199-medium zonder schudden.Oogst de cellen door centrifugatie bij 1500G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius, zodra zij een celdichtheid van 10 tot 20 miljoen cellen per milliliter bereiken. Nadat het supernatant met een pipet is verwijderd, worden de cellen gewassen door de celpellet met een serologische pipet opnieuw te suspenderen in een volume koud fosfaatgebufferde zoutoplossing dat gelijk is aan de helft van het cultuurvolume.Centrifugeer de cellen opnieuw bij 1550G gedurende vijf minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant met een pipet. Ga over naar de volgende stap of vries de celpellet direct in met vloeibare stikstof voor langetermijnopslag bij -80 °C.Resuspendeer vervolgens de celpellet in een gelijk volume 2X lysisbuffer. Voeg een 1X volume glazen kraaltjes toe en vortex krachtig bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Voeg twee volumes 1X lysisbuffer toe en meng.Centrifugeer vervolgens de celextracten bij 1500G en vier graden Celsius gedurende 10 minuten om ongebroken cellen en kernen te pelletteren. Overbreng het supernatant met een pipet naar een nieuwe gekoelde centrifugebuis en bewaar de celextracten op ijs tot het experiment is voltooid. Voeg twee microliters celextracten toe aan één milliliter bicinchonininezuuroplossing en voer dit in duplo uit.Incubeer de standaarden en eiwitmonsters gedurende 10 minuten in een voorverwarmd waterbad van 60 °C. Plaats de monsters gedurende drie minuten op ijs. Meet de absorbentie van de standaarden en de eiwitmonsters met een spectrofotometer bij een golflengte van 562 nanometer.Bereken de eiwitconcentratie van de celextracten met behulp van de bovine serum albumine-standaard als referentie, zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Verdun de celextracten met 1X lysisbuffer tot een eiwitconcentratie van 10 mg/mL. Test in een zuurkast elk monster en duplicaat in een conische buis van 15 mL.Bereid per buis 20 µL 1 M TrisHCL pH 7.5 voor en bewaar dit op ijs. Bereid daarnaast voor elke buis twee milliliter chloroform-methanol stopoplossing bij kamertemperatuur. Pipetteer 20 µL van de 1 M TrisHCL in elke 15 ml conische buis op ijs.Volg vervolgens de richtlijnen voor stralingsveiligheid en voeg per buis het equivalent van 0,06 µM tritium-gemarkeerde SAM en 50 µM koud SAM toe, voor een totaal van 50,06 µM SAM. Voeg op dit punt per buis een volume koud water toe dat is berekend volgens het tekstprotocol. Plaats elke conische buis in een voorverwarmd waterbad van 30 °C.Voeg 20 µL celextracten toe aan elke buis om de reactie te starten. Incubeer de monsters gedurende de gewenste tijd. Stop de reactie door twee milliliter chloroform-methanol aan elke buis toe te voegen.Breng de conische buizen naar kamertemperatuur. Voeg in een zuurkast 700 µL water toe aan elke buis met het enzymatische reactiemonster. Vortex krachtig gedurende 30 seconden.Centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 1500g bij kamertemperatuur om de organische fase van de waterfase te scheiden. Het is van cruciaal belang om bij het overbrengen van de onderste fase geen deel van de waterfase mee te nemen, omdat dit de berekening van de assay zal beïnvloeden. Gebruik een pipet om de onderste organische fase over te brengen naar een nieuwe conische buis van 15 milliliter.Voeg één milliliter water toe aan elke buis met de onderste fase en vortex krachtig gedurende 30 seconden. Centrifugeer vervolgens opnieuw bij 1500G gedurende vijf minuten om de organische fase van de waterfase te scheiden. Overbreng de onderste organische fase met een pipet naar een scintillatiebuis.Droog de monsters onder een stroom nitrogengas. Verwijder de waterfasen die het niet-ingebouwde radioactieve SAM bevatten en de radioactieve conische buizen volgens de richtlijnen voor straling. Voeg vervolgens twee milliliters scintillatievloeistof per buis toe.Meet de ingebouwde radioactiviteit met een scintillatieteller volgens het protocol van de fabrikant en de gebruikte instrumenten. Bereken de enzymatische activiteit in nanomoles per milligram eiwit met behulp van de vergelijking die in het tekstprotocol wordt vermeld. Hier wordt een tijdsafhankelijke PEMT-assay getoond, die is uitgevoerd met Leishmania whole cell extract als enzymbron en endogene PE als substraat.De hoeveelheid radioactiviteit in de organische fase werd gekwantificeerd door middel van scintillatietelling en gebruikt om de hoeveelheid getritieerde methylgroepen die naar PE waren overgedragen te berekenen. De PEMT-activiteit was gedurende ongeveer 20 minuten lineair. Vervolgens werd rond 30 minuten een plateau bereikt, waarna deze nog 15 minuten constant bleef. Zoals verwacht werd er geen PEMT-activiteit gedetecteerd wanneer er geen celextracten werden toegevoegd, terwijl dit wel gebeurde wanneer celextracten aan de assay werden toegevoegd.Verder werd deze activiteit opgeheven in de aanwezigheid van 100 micromolar octadecyltrimethylammoniumbromide, wat een specifieke remmer is van leishmania major fosfatidylethanolamine-methyltransferases LMJ PEM One en LMJ PEM two. De PEMT-activiteit was ook afhankelijk van de eiwitconcentratie en deze activiteit was lineair proportioneel aan de hoeveelheid eiwit die werd gebruikt voor de enzymatische assay. Tot slot werd een SAM-concentratie-afhankelijke PEMT-assay uitgevoerd, waarbij toenemende concentraties SAM werden getest.De PEMT-activiteit bereikte een plateau bij een SAM-concentratie van ongeveer 0,5 mM. Een ervaren gebruiker kan dit protocol uitvoeren in drie tot vijf uur, afhankelijk van het aantal monsters. Bij het uitvoeren van dit protocol is het zeer belangrijk om onlangs aangeschafte SAM te gebruiken, aangezien deze verbinding onstabiel is.Vergeet niet dat werken met pathogenen en radioactiviteit extreem gevaarlijk kan zijn. Daarom is het belangrijk om de veiligheidsrichtlijnen te volgen en de juiste laboratoriumuitrusting te dragen.

in-vitro-assay-to-measure-phosphatidylethanolamine-methyltransferase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft de bereiding van een synthetisch tRNA substraat voor...

In vitro tRNA methylatie test met de Entamoeba histolytica DNA en tRNA methyltransferase Dnmt2 (Ehmeth) Enzym

This video demonstrates a thin-layer chromatography-based enzyme assay to determine pyrophosphokinase activity using radiolabeled nucleotides. The method provides insights into nucleotide synthesis and phosphotransfer reactions.

Thin Layer Chromatography Based Enzyme Activity Assay: A Technique to Determine In Vitro Pyrophosphokinase Activity Using Thin Layer Chromatography

Protein arginine methylatie, gekatalyseerd door een klasse van enzymen nl. Proteïne arginine methyl transferase (PRMTs), het proces van enzymatische additie van methylgroep (en) arginines in eiwitten. De in-vitro-methylatie test is de meest betrouwbare instrument voor de beoordeling van de methylatie status van bekende of nieuwe PRMT substraten.

In vitro Methylatietest Assay om Protein Arginine methylatie Bestudeer

We beschrijven een basisprotocol voor het kwantificeren van in vitro ATPase-activiteit. Dit protocol kan worden geoptimaliseerd op basis van het activiteitsniveau en de vereisten voor een bepaalde gezuiverde ATPase.

Meten<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase activiteit voor enzymatische Karakterisatie

Er is een vraag om preklinische testen voor een nieuwe klasse van "Wees" drugs genoemd farmacologische chaperones reproduceerbaar, snel en efficiënt. Voor patiënten die in aanmerking komen, alsmede nieuwe farmacologische chaperone drugs ontwikkelden we een eenvoudige, sterk gestandaardiseerde en veelzijdig cel cultuur gebaseerde bepaling naar het scherm.

In Vitro Enzym meting aan Test farmacologische Chaperone responsiviteit in Fabry en de ziekte van Pompe

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Palmitoylation houdt de integratie in van een 16-koolstof palmitaat moiety aan cysteïneresiduen van doelproteïnen op een omkeerbare manier. Hier beschrijven we een biochemische benadering, de acyl-PEGyl exchange gel shift (APEGS) test, om de palmitoylation toestand van een eiwit van belang in muis hersenen lysaten te onderzoeken.

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay voor kwantitatieve bepaling van palmitoylation van Brain Membrane Eiwitten

Hier wordt een gevoelige fluorescentietest gepresenteerd om de Apolipoproteïne N-acyltransferase-activiteit te volgen met behulp van diacylglycerylpeptide en alkynfolipiden als substraten met klikchemie.

Op klikchemie gebaseerde fluorometrische test voor Apolipoproteïne N-acyltransferase van enzymkarakterisering naar screening met hoge doorvoer

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Leer een in vitro methode om fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit te meten in Leishmania celextracten zonder enzymzuivering. Dit protocol biedt inzicht in lipidenmetabolisme en fosfatidylcholine biosynthese.

In vitro test te meten Fosfatidylethanolamine methyltransferase activiteit

Meer video's verkennen