Name: Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke In Utero Elektroporatie in de C57BL / 6 muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Leer in utero-elektroporatie voor specifieke hersengebieden zoals cortex, hippocampus en thalamus bij C57BL/6 muizen. Deze methode maakt snelle celmanipulatie mogelijk zonder genetisch gemodificeerde muizen te genereren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Technisch ondersteund door Melanie Pfeifer en Nikolai Schmarowski (Institut für Mikroskopische Anatomie und Neurobiologie, Universitätsmedizin Mainz).

Ethiek Verklaring: De behandeling van de muizen en de experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese, nationale en institutionele richtlijnen voor de verzorging van de dieren. 1. In Utero Elektroporatie Opmerking: In utero elektroporatie werd uitgevoerd zoals eerder gepubliceerd 12,14. Derhalve is de werkwijze slechts kort hieronder beschreven (figuur 1). <ol><li> Voorbereidingen <ol><li> Bereid snel groen gekleurde endotoxinevrij geavanceerde transfectie-grade plasmide-oplossing (met daarin 1,5 pCAGGS) zoals eerder beschreven 12. </li><li> Trek en grind (35 ° hoek) borosilicaatglas haarvaten (0,8-0,9 diameter) voor injecties. </li><li> Steriliseren instrumenten. </li></ol></li><li> Chirurgie <ol><li> Dien analgetica (carprofen, 4 mg / kg lichaamsgewicht, sc, 24 uur depot) ten minste 30 minuten voordat de operatie. </li><li> Houd de lengte vande anesthesie maximaal 35-45 min (Fase III - fase van chirurgische anesthesie volgens Guedel 15 - maximaal 25-30 min). </li><li> Verdoven getimede zwangere muizen met isofluraan (inductie in een kamer: 2,8%, een operatie via masker: 2,5%). Bevestig verdoving door ongevoeligheid tot teen-snuifje. </li><li> Gelden oogzalf om eye-droogheid tijdens anesthesie te voorkomen. </li><li> Steriliseren van de chirurgische gebied met 7,5% providon-Jodium-oplossing en hebben betrekking op de muis met een steriel gaasje (vochtig met 0,9% benzylalcohol zoutoplossing) met alleen de chirurgische gebied blootgelegd. </li><li> Opengesneden de buikholte met een scalpel (huidincisie: 1,5-2 cm, spier incisie: 1-1,5 cm). </li><li> Het behoud van de open buikholte uitdroogt door het bevochtigen met verwarmde 0,9% benzylalcohol zoutoplossing of andere steriele isotone oplossing zoals voorgeschreven door het veterinaire personeel of commissie. </li><li> Zorgvuldig te extraheren baarmoederhoorns (met ring tang, doen de baarmoeder met de vinger aanrakens). </li></ol></li><li> Injectie van DNA en elektroporatie. Opmerking: De exacte details voor het richten op specifieke regio&#39;s zijn vermeld in paragraaf 2. <ol><li> Injecteer langzaam de gekleurde DNA-oplossing in de ventrikel zoals in figuur 1 en punt 2 via de bereide borosilicaat capillairen. </li><li> Breng de juiste spanning voor de overeenkomstige embryonale fase (bijv., 36-38 V voor E14) via gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). Pulse de elektroporatie peddels tijdens het aanbrengen van de spanning op beschadiging van de baarmoederwand te minimaliseren. </li></ol></li><li> Bericht elektroporatie / post-operatieve zorg <ol><li> Plaats voorzichtig de uterine hoorns in de buikholte. </li><li> Hechtdraad de spieren en de huid incisie afzonderlijk. </li><li> Laat de muis rusten op een thermische ondersteuning apparaat voor het herstel. </li><li> Begeleiden de muis tijdens het herstel (gedrag, voer enwaterverbruik), 4 uur, 24 uur en 48 uur na de operatie. Eventueel toepassen aanvullende analgetica (carprofen, 4 mg / kg lichaamsgewicht, 24 uur depot) voor 2 dagen. </li></ol></li></ol> 2. Transfectie van specifieke Cerebral Gebieden Opmerking: De positie van de positieve pool wordt weergegeven als de hoek tussen de verticale middellijn door de ventrikel gevuld met de DNA-oplossing (rechts of derde ventrikel) en de positie van de positieve pool. Bij het vullen van de linker hartkamer posities zijn spiegelbeeld. In figuur 4 de posities van het oor primordiale getoond, die belangrijke referentiepunten verschaffen. <ol><li> Transfectie van corticale gebieden (figuur 2A, Tabel 1). <ol><li> Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van corticale gebieden gebruiken E14 embryo. </li><li> Injecteer 1,5-2 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikelvia de bereide borosilicaat capillairen. <ol><li> De positie van de embryo zorgvuldig met behulp van een tang de ring, zodat er geen zichtbare schepen boven de prikplaats. </li><li> Injecteer langzaam de DNA-oplossing ongeveer 0,75 mm van de coronale lambdoidal hechtdraad en 0,5 mm lateraal van de pijlnaad (figuur 3). Zorg ervoor dat de insteekdiepte is 1,2 mm (E14, gemeten vanaf de baarmoederwand). Controleer op een blauw-groene kleur met een scherpe afbakening. </li></ol></li><li> Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). <ol><li> Gebruik een 3 of 5 mm elektrode paddle. </li><li> Gebruik een spanning tussen 36-38 V. </li><li> Plaats het midden van de elektroden juist anterior van het oor primordia. </li><li> Om de retrospleniale cortex gebruik hoeken transfecteren 330-0 °, om de motorische cortex 0-40 ° transfecteren, aan de somatosensorische cortex 40-95 ° transfecteren, te transfecterende piriformis cortex 95-110 ° (Figuur 2A). </li></ol></li><li> Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo&#39;s 4 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3. </li></ol></li><li> Transfectie van de hippocampus (Figuur 2B, Tabel 1). <ol><li> Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van hippocampale formatie gebruikt E15 embryo. </li><li> Injecteer 2 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikel via de voorbereide borosilicaat capillairen. </li><li> Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). <ol><li> Gebruik een 3 of 5 mm elektrode paddle. </li><li> Gebruik een spanning tussen 38-40. </li><li> Plaats het midden van de negatieve pool net anterior van het oor primordium en het centrum of de positieve pool in het midden van het oor primordium. </li><li> Om transfecteren de dentate gyrus gebruiken hoeken 190-210 °, de cornu ammonis (CA) 3 210-230 ° transfecteren om transfecteren de CA2 230-250 °, het CA1 250-275 ° (figuur 2B) te transfecteren. </li></ol></li><li> Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Voeren analyse na volledige hippocampus formatie (na de geboorte, p21), zoals beschreven in paragraaf 3. </li></ol></li><li> Transfectie van het laterale septum kern en striatum (Figuur 2C, tabel 1) Opmerking: De hoeken overlappen met die van transfecteren van de hippocampus. Om effectief transfecteren de laterale septum kern en de striatum zonder ongewenste hippocampus transfectie eerder embryonale stadia (E12) te gebruiken. <ol><li> Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in utero elektroporatie van de laterale septum kern en striatum gebruikt E12 embryo. </li><li> Injecteer 1 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in de rechter laterale ventrikel via de voorbereide borosilicaat capillairen. </li><li> Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). <ol><li> Gebruik een 0,5 mm elektrode. </li><li> Gebruik 33 V. </li><li> Plaats het midden van de elektroden ter hoogte van het oor primordia. </li><li> Om de laterale septum nucleus gebruik hoeken transfecteren 100-170 °, het striatum 170-240 ° (figuur 2C) te transfecteren. </li></ol></li><li> Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg, zoals beschreven in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo&#39;s 6 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3. </li></ol></li><li> Transfectie van de thalamus en hypothalamus (figuur 2D, tabel 1) <ol><li> Voeren chirurgie zoals beschreven in paragraaf 1.2. Voor de in UTero elektroporatie van de thalamus en de hypothalamus gebruik E12-E13 embryo&#39;s. </li><li> Injecteer 1-1,5 pl DNA-oplossing bevattende 4 ug DNA in het laterale ventrikel (links of rechts) via de bereide borosilicaat capillairen. Wacht 2-3 min, totdat de oplossing wordt gediffundeerd in het derde ventrikel. U kunt ook rechtstreeks te injecteren in het derde ventrikel. Opmerking: Dit verhoogt de specificiteit, maar zou een verminderde overleving (hoog risico op schade) veroorzaken. </li><li> Solliciteer spanning via de gespecialiseerde tang-type platina-elektroden (interval cyclus lengte 50 msec, interval pauze 950 msec). <ol><li> Gebruik een 0,5 of 3 mm elektrode. </li><li> Gebruik een spanning tussen 33-35 V. </li><li> Plaats het midden van de elektroden juist achter het oor primordia. </li><li> Om de thalamus gebruik hoeken transfecteren 25-40 °, de hypothalamus 90-180 ° (figuur 2D) te transfecteren. </li></ol></li><li> Verrichten na elektroporatie / post-operatieve zorg als described in paragraaf 1.4. Offer de muizen en analyseren van de embryo&#39;s 6 dagen na elektroporatie (E18), zoals beschreven in paragraaf 3. </li></ol></li></ol> 3. Perfusie Fixatie <ol><li> Voorbereidingen <ol><li> Warm 4% paraformaldehyde (PFA) tot 37 ° C. </li><li> Vul een 50 ml spuit met PBS (4 ° C) en een tweede spuit met verwarmd PFA. Vermijd bubbels. </li><li> Sluit de spuiten om een ​​drie-weg kraan. Sluit de derde einde aan een gevleugelde infusieset (vlinder). </li><li> Spoel de gevleugelde infusieset met PBS. </li></ol></li><li> Perfusie <ol><li> Diep verdoven de muizen (zwanger of postnatale getransfecteerd) met subcutane toepassing van ketamine hydrochloride (60 mg / kg) en xylazine (7,5 mg / kg). </li><li> Bevestig de chirurgische tolerantie stadium door ongevoeligheid tot teen-snuifje. </li><li> Open de buikholte net onder de ribbenkast. </li><li> Knip voorzichtig het middenrif. </li><li> Open de ribbenkast zorgvuldig via een snee in each website tot het sleutelbeen. </li><li> Steek de punt van de vlinder in de linker hartkamer (vanaf de apex van het hart). </li><li> Snijd de linker hartoor. </li><li> Langzaam perfuseren de muis met PBS (ongeveer 10 ml). </li><li> Zet de drie-weg kraan. </li><li> Perfuseren de muis met 5-10 ml 4% PFA. </li><li> Onthoofden de muis met een schaar en ontleden van de hersenen te beginnen bij het foramen magnum. Voer de dissectie reeds vroeger 16. </li><li> Postfixate de hersenen voor 2 dagen in 4% PFA. Houd de hersenen bij 4 ° C in het donker. </li></ol></li></ol> 4. Immunohistochemie <ol><li> Genereer 70 urn secties (bijvoorbeeld een vibratome). </li><li> Optioneel: Verbeter fluorescentie met antilichaamkleuring. <ol><li> Blokkeer de secties 1 uur bij RT (0,1-0,2% Triton X-100, 5% normaal geit serum) </li><li> Incubeer O / N met het geschikte antilichaam (anti-GFP, 1: 1000) </li><li> Was 3-5 Malen met 0,1 M fosfaatbuffer. </li><li> Incubeer 3-5 uur met de geschikte fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam (Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-konijnen IgG, 1: 1000). </li><li> Optioneel: tegenkleuring met 4-6-diaminodino-2-fenylindol (DAPI, 0,2 g / ml in 0,1 M fosfaatbuffer) gedurende 1 min. </li><li> Analyseer fluorescentie met een passende fluorescentiemicroscoop. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 Suppl 1. (July), i120-i125 (1991).</li>
<li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+generation%2C+migration%2C+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li>
<li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term%2C+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22FNMOL%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37(2011).</li>
<li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted-in-schizophrenia-1+%28Disc1%29+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Hu+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li>
<li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li>
<li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li>
<li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+utero+electroporation%3A+controlled+spatiotemporal+gene+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li>
<li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuedel%2C+AE+%22Inhalation+anesthesia%3A+a+fundamental+guide%22">Inhalation anesthesia: a fundamental guide</a>. , Macmillan. New York. (1937).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%2C+Growth+%26+Differ%22%5BJournal%5D)">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth & Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft in detail hoe de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriforme cortex, de cornu ammonis 1-3, de dentate gyrus, het striatum, de laterale septale kern, de thalamus en de hypothalamus van C75BL/6 muizen worden getransfecteerd. Met alle verstrekte informatie is dit het eerste protocol dat alle noodzakelijke informatie levert om transfecties van deze hersengebieden in de C57BL/6-muis gemakkelijk te recreëren. Eerdere publicaties zijn meestal alleen gericht op e...

Sinds de eerste beschrijving in 2001 door drie onafhankelijke groepen 1-3 i n utero elektroporatie is een veel gebruikte standaard voor de analyse van genexpressie bij knaagdieren centrale zenuwstelsel. Vergeleken met het genereren van knockout muizen, die ondanks continue verbetering van de technieken, nog tijd en geld kost, de in utero elektroporatie beroep vanwege zijn eenvoud. Dus, in de baarmoeder elektroporatie maakt snel en efficiënt gain en verlies-van-functie studies 4. Om de cerebrale gebieden transfecteren, wordt de oplossing die de negatief geladen plasmide geïnjecteerd in een hartkamer. Tijdens de elektrische puls, de negatief geladen DNA migreert naar de positieve pool en derhalve de getransfecteerde gebied kan eenvoudig worden geselecteerd door het veranderen van de positie van de positieve pool. Het is herhaaldelijk aangetoond dat talrijke gebieden van het centrale zenuwstelsel kan worden targeted 3,5-8. Bijvoorbeeld, recente studies tonen specifieke transfecties van de hippocampus, de piriformis cortex of het striatum 9-11. De informatie over de geschikte posities zijn vaak slechts nauwelijks gestandaardiseerd en zijn niet altijd eenvoudig tussen verschillende muizenstammen. Transfectie van bepaalde embryonale stadia verre van triviaal. Vele invloedsfactoren moet rekening worden gehouden bij de keuze van de set-up voor de specifieke in de baarmoeder elektroporatie. Eerst optimaal transfecteren de respectievelijke embryonale stadia, is kennis over de juiste voltages vereist. Hoge spanningen verminderen de overlevingskans, terwijl lage spanningen verminderen van de transfectie-efficiëntie 2,3,12. Ook de grootte van de elektrode peddel speelt een cruciale rol, omdat het gebruik van elektrode peddels te grote uitslagen in gereduceerde specificiteit of kan de dood veroorzaken door aantasting van het hartritme 4,12,13. De toegepastespanning en de grootte en de positie van de elektrode schoep zijn de belangrijkste kenmerken te overwegen, maar er zijn ook andere factoren die de uitkomst van de elektroporatie, zoals de toegepaste hoeveelheid DNA-oplossing. We hebben een gedetailleerd protocol dat snelle en efficiënte transfectie van diverse cerebrale gebieden van de C57BL / 6 muis 12 maakt ontwikkeld. In dit protocol gedetailleerde informatie over de spanningen worden gebruikt en de afmeting van de elektrode peddel voor verbeterde specificiteit verschaft. Verdere informatie over het ventrikel te vullen met aanbevelingen voor de hoeveelheid plasmide-oplossing en de positie van de elektrode wordt geleverd. De aanduiding van de gedetailleerde positie-informatie in de kaart en de verdere visualisatie van deze posities mogelijk maakt eenvoudige specifiek en efficiënt in utero elektroporatie van de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex t,Hij cornu ammonis 1-3, de dentate gyrus, de striatum, de laterale septum nucleus, de thalamus en hypothalamus.

<table><tbody><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Roth</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)</td><td>Wold Precision Instrument Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane (Forene)</td><td>Abbott</td><td>PZN 4831850</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl)</td><td>Pfizer GmbH</td><td>goedkeuringsnummer: 400684.00.00</td><td></td></tr><tr><td>eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td><td>Bayer&nbsp;</td><td>PZN 01578681</td><td></td></tr><tr><td>0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution</td><td>Apotheek van het Universitair Medisch Centrum Mainz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gauze (ES-Kompressen)</td><td>Hartmann</td><td>407835</td><td></td></tr><tr><td>steriele 5-0 Perma-Hand zijdedraad</td><td>Ethicon Johnson &amp; Johnson</td><td>K890H</td><td></td></tr><tr><td>ringtang 1/ 1.5 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11101-09</td><td></td></tr><tr><td>ringtang 4.8/ 6 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>ringtang 2.2/ 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Adson Tang-gekarteld recht 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>1106-12</td><td></td></tr><tr><td>Irisschaar-Fijn recht-Scherp/Blunt 10 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14028-10</td><td></td></tr><tr><td>Mayo-Stille Schaar-Recht 15 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14012-15</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Tang-Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Naaldhouder-met vergrendeling-wolfraamcarbide 14 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator CUY21 SC&nbsp;</td><td>Nepa Gene Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FST 250 Hot Bead Sterielisatietoestel</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Microgrinder EG-44</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-97 Micropette Puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Platinum elektroden 650P 0.5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P0.5</td><td></td></tr><tr><td>Platinum elektroden 650P 3 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P3</td><td></td></tr><tr><td>Platinum elektroden 650P 5 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P5</td><td></td></tr><tr><td>Platinum elektroden 650P 10 mm</td><td>Nepagene</td><td>CUY650P10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiesysteem</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingsplaat</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurregelaar 220V AC</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr></tbody></table>

cortex-, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus-, laterale septal nucleus- en striatum-specifieke<em&gt; in utero</em&gt; elektroporatie in de c57bl / 6 muis

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero elektroporatie is een veel gebruikte techniek voor snelle en efficiënte ruimte-tijdelijke manipulatie van verschillende genen in het centrale zenuwstelsel van knaagdieren. Overexpressie van gewenste genen is net zo mogelijk als shRNA-gemedieerde verlies-van-functie studies. Daarom biedt het een breed scala aan toepassingen. De haalbaarheid om specifieke cellen in een bepaald gebied te targeten, vergroot verder het scala aan mogelijke toepassingen van deze zeer nuttige methode. Voor efficiënt targeten van specifieke regio's is kennis over de subtiliteiten, zoals het embryonale stadium, de aan te brengen spanning en het belangrijkste de positie van de elektroden, onmisbaar.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat specifiek en efficiënt in utero elektroporeren van verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel van de C57BL/6 muis mogelijk maakt. In het bijzonder wordt getoond hoe regio's te transfecteren die zich ontwikkelen tot de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriforme cortex, de cornu ammonis 1-3, de dentate gyrus, het striatum, de laterale septumkern, de thalamus en de hypothalamus. Voor dit worden informatie over het geschikte embryonale stadium en de geschikte spanning voor het corresponderende embryonale stadium verstrekt. Het belangrijkste is een hoeken-kaart, die de geschikte positie van de positieve pool aangeeft, die wordt afgebeeld. Dit gestandaardiseerde protocol helpt om efficiënte in utero elektroporatie te vergemakkelijken, wat ook kan leiden tot een verminderd aantal dieren.

Figuur 2 toont voorbeelden van de specifieke in de baarmoeder elektroporatie van de regio te ontwikkelen in de retrospleniale cortex, de motorische cortex, de somatosensorische cortex, de piriformis cortex, de Cornu Ammonis 1-3, de dentate gyrus, het striatum, de laterale septum nucleus , de thalamus en hypothalamus. De resultaten van de transfecties wordt getoond naast de aanbevolen hoek (figuur 2). Voor een betere visualisatie van de hoeken in vivo de positi...

Dit protocol beschrijft in detail hoe specifiek te transfecteren verschillende regio's in het centrale zenuwstelsel van C57BL/6 via in utero elektroporatie. Inbegrepen in dit protocol zijn gedetailleerde instructies voor transfecties van regio's die zich ontwikkelen tot de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, laterale septumkern en striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporatie in de C57BL / 6 muis

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Het algemene doel van deze in vivo celmanipulatie is om specifiek cellen in bepaalde regio's van het centrale zenuwstelsel van de muis te modificeren, zoals de cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, nucleus septalis lateralis en het striatum. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de ontwikkeling en functie van de hersenen, bijvoorbeeld door de identificatie van verschillende signaleringscascades en het bepalen van het niveau van celdifferentiatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een snelle en efficiënte manipulatie van diverse celtypen in het centrale zenuwstelsel mogelijk maakt, zonder dat er tijdrovende genetisch gemodificeerde muizen gegenereerd hoeven te worden.Over het algemeen is de demonstratie van deze methode nuttig, omdat personen die nieuw zijn met deze methode vaak moeite hebben met het vinden van de juiste elektrodepositie, wat cruciaal is voor specifieke elektroporatie. Om deze procedure te starten, snijdt u met een scalpel de buikholte van een geanestheseerde zwangere muis open. Voorkom dat de geopende buikholte uitdroogt door deze te bevochtigen met een warme 0.9% methylalcohol zoutoplossing.Extraheer vervolgens voorzichtig de uterine hoorns met een ringforceps. Positioneer daarna een E14-embryo zodanig dat er geen zichtbare vaten boven de punctieplaats aanwezig zijn. Voor een betere visualisatie kan een 5-millimeter electrode worden gebruikt om de hoek en positie van het gewenste hersengebied voor transfectie te bepalen.Voor de in utero electroporatie van het corticale gebied injecteert u langzaam 1,5 tot 2 µL van de DNA-oplossing in het linker laterale ventrikel. Zorg ervoor dat de insertiediepte één tot twee millimeter is, gemeten vanaf de baarmoederwand. Controleer vervolgens op een blauwgroene kleuring met een scherpe begrenzing.Gebruik voor een betere visualisatie een elektrode van 5 millimeter om de hoek en positie van de gewenste locatie in de hersenen voor transfectie te bepalen. Plaats daarna het midden van de platina elektrodepaddles van drie millimeter net anterior van de oorprimordia, en zorg ervoor dat deze niet boven de vaten of de placenta zijn geplaatst. Breng vervolgens een spanning aan om de transfectie te starten.Injecteer voor de in utero electroporatie van de hippocampusformatie twee µL DNA-oplossing in het rechter laterale ventrikel van een E15-embryo. Plaats vervolgens de negatieve pool van de drie tot vijf millimeter platina elektrodepaddles vlak anterieur van het oorprimordium, en de positieve pool in het midden van het oorprimordium. Breng daarna spanning aan om de transfectie te starten.Voor de in utero electroporatie van de nucleus septalis lateralis en het striatum injecteert u één µL DNA-oplossing in het rechter laterale ventrikel van een E12-embryo. Plaats vervolgens de 5-millimeter elektroden op het niveau van de oorprimordia. Pas daarna spanning toe om de transfectie te starten.Voor de in utero electroporatie van de thalamus en hypothalamus injecteert u 1 tot 1,5 µL DNA-oplossing in het laterale ventrikel van een embryo in stadium E12 tot E13. Wacht vervolgens twee tot drie minuten zodat de oplossing kan diffunderen naar het derde ventrikel. Plaats daarna de 5 of 3 mm elektroden net posterieur van de oorprimordia.Breng daarna spanning aan om de transfectie te starten. Dit schema toont de juiste posities van de positieve en negatieve polen voor het transfecteren van corticale gebieden. En dit schema toont de posities van de positieve en negatieve pool voor het transfecteren van de hippocampusformaties.De posities van de positieve en negatieve pool voor transfectie van het striatum en de laterale septale nucleus worden hier getoond. En de juiste posities van de elektroden voor transfectie van de thalamus en de hypothalamus worden hier getoond. De specificiteit van de transfectie is afhankelijk van de grootte van de elektrode.Het vergroten van de afmetingen van de elektrodepedel vermindert de specificiteit van de transfectie. Dit is vooral duidelijk in vroege embryonale stadia, maar is ook zichtbaar in late embryonale stadia. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 15 minuten worden uitgevoerd mits deze correct wordt toegepast.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om uiterst voorzichtig om te gaan met de embryo's en de moederdieren. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe specifieke regio's in het centrale zenuwstelsel van de Black 6-muis getransfecteerd kunnen worden.

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E15 muizenembryo&#39;s

In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.

Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie

Een genoverdracht methode in de zich ontwikkelende hersenen van muizen wordt beschreven door middel van een unieke chirurgische methode en de speciale vorm van de elektroden. Deze unieke techniek maakt het mogelijk transfectie van plasmide DNA tijdelijk en ruimtelijk, die veel neurowetenschappers zullen helpen bij het bestuderen van ontwikkeling van de hersenen.

Muis In Utero Elektroporatie: Gecontroleerde spatiotemporele Gene Transfectie

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt...

Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Ondanks de functionele en medische belang van de...

Genetische Manipulatie van de muis Ontwikkelen Hypothalamus via<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

De combinatie van transmissie-elektronenmicroscopie en in de baarmoeder transductie is een krachtige aanpak voor het bestuderen van morfologische veranderingen in de fijne ultrastructuur van het zenuwstelsel in ontwikkeling. Deze gecombineerde methode kunt diep inzicht in veranderingen in structurele bijzonderheden Neuroplasticiteit met betrekking tot hun topografische vertegenwoordiging.

Beoordeling van ultrastructurele Neuroplasticiteit Parameters na In Utero transductie van de ontwikkelingslanden muis hersenen en ruggenmerg

Dubbel in utero elektroporatie maakt het richten van celpopulaties die ruimtelijk en tijdelijk gescheiden. Deze techniek is nuttig om interacties tussen die celpopulaties te visualiseren met behulp van fluorescerende eiwitten in normale omstandigheden, maar ook na functionele experimenten om genen van belang te verstoren.

Dubbel in utero-elektroporatie om tijdelijk en ruimtelijk gescheiden celpopulaties te targeten

Leer in utero-elektroporatie voor specifieke hersengebieden zoals cortex, hippocampus en thalamus bij C57BL/6 muizen. Deze methode maakt snelle celmanipulatie mogelijk zonder genetisch gemodificeerde muizen te genereren.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke In Utero Elektroporatie in de C57BL / 6 muis (Video) | JoVE Journal

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Laterale Septal Nucleus- en Striatum-specifieke

Meer video's verkennen