Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

Hier demonstreren we het gebruik van een cel-penetraterend peptide met een gemodificeerd antisense-oligonucleïde om specifiek micro RNA in de hersenen van muizen neer te slaan. Dit werd bereikt door een antigo te ontwerpen tegen May 29. In deze studie hebben we antigo-mannetjes gebruikt om microRNAs met lock-nucleïnezuurmodificaties te targeten.

Dat wil zeggen dat LNA-modificaties op vijf verschillende posities zijn ingebouwd. Hierbij verbetert een incorporering van LNA-modificaties de bindingsaffiniteit met het micro RNA. Het geeft ook kernweerstand en verbetert daardoor de efficiëntie van het targeten van microRNA.

Complexen van de ANTIGO MAR met het peptide werden in vitro bereid en via de staarsafvoerende ader in de muizen geïnjecteerd. Het neerslaan van het micro RNA resulteerde in gedragsveranderingen die suggereren dat deze microRNA betrokken is bij ataxie. Drie opeenvolgende injecties waren voldoende om een merkbare verandering in de gang na de behandeling te induceren, hersenweefsel werd verzameld en het neerslaan van de microRNA werd bevestigd. CPP's of zelf-penetraterende peptiden zijn recentelijk opgedoken als aantrekkelijke dragers voor nucleic acid-bezorging.

Hier hebben we een van die argininerijke neurotrope peptiden gebruikt dat ladingsgebaseerde complexvorming kan ondergaan met de LNA, die bij toediening in de systemische circulatie de aangewezen doelplaats bereikt, namelijk neuronale cellen in dit geval, en zorgt voor een juiste afgifte van de LNA in deze cellen. De sequenties van de ME 29-familieleden werden opgehaald uit mease en de 16 MER antisense werden gesynthetiseerd met lock-nucleïnezuurmodificaties op vijf gelijkmatig verdeelde posities om complexen te bereiden. De peptide- en antigo-oplossingen met geschikte concentraties werden afzonderlijk bereid in steriele 10% glucose.

Onder aseptische omstandigheden. De Antigo-oplossing werd langzaam druppelsgewijs toegevoegd aan de peptide-oplossing met zacht roeren. Langzame toevoeging en zacht roeren zijn cruciaal voor de vorming van monodisperse complexen waarvan de grootte in de tric-schaal is.

De antigo werd in drie gelijke delen toegevoegd, elke keer een minuut laten mixen, gevolgd door een minuut incuberen zonder te mengen. Snelle toevoeging kan leiden tot aggregatie van de complexen en precipitatie. Het antigo-complex is nu klaar voor injectie.

Het complex werd toegediend via een injectie in de staarsafvoerende ader. De muizen werden teruggeplaatst in dezelfde kooi. Gedragstests voor ataxie werden dagelijks uitgevoerd, drie uur na injectie.

De muis werd vastgehouden aan zijn staart, waarbij het niet werd toegestaan om omringende objecten aan te raken. Let op de manier waarop de achterpoten gedurende 10 seconden uitgespreid zijn. In de randtest moesten de muizen langs de dunne rand van de kooi lopen.

De muizen lopen door een dunne kanaal en laten voetafdrukken achter met inktvoeten op een strook dik absorberend papier, alleen de achterpoten. Om verwarrende gegevens van de vier ledematen te voorkomen, laten we het effect van de antigo-behandeling zien. We hebben de hersenen en andere weefsels geïsoleerd van de behandelde en gecontroleerde muizen.

We ontdekten dat het R VG-peptide een fluorescerend gelabelde siRNA specifiek naar de hersenen leverde, maar niet naar andere weefsels zoals de lever. Een niet-neurotroop controlepeptide RVM leverde de siRNA aan de lever. Muizen behandeld met ANTIER 29 vertoonden defecten in de achterpoot.

Gecontroleerde muizen die met een door elkaar gehaapte anme werden behandeld, konden de rand overwinnen, maar na behandeling met anme tegen MARE 29 vertoonden de muizen milde defecten in deze test. In de voetafdruktest was er een opvallende verkorting van de staplengte bij de behandelde muizen. Bovendien bevestigden we via QR tpcr dat de niveaus van mid 29 A en mid 29 B werden gereguleerd voor de ontwikkeling van micro NNA-gebaseerde therapeutischa.

Hersenspecifieke bezorging van anti-microRNA's is een uitdaging vanwege de bloed-hersenbarrière. Met behulp van de hier gepresenteerde techniek kunnen we de conventionele bezorgmethode van anti-microRNA's naar de hersenen vermijden. Deze methode maakt het neerslaan van microRNA's technisch haalbaar en verhoogt de weefselspecificiteit.