Name: Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer een methode voor hersenspecifieke knockdown van microRNA's in muizen met behulp van een neuropeptide en antagomir. Deze techniek omzeilt de bloed-hersenbarrière en maakt onderzoek naar neurodegeneratie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We bedanken Souvik Maiti voor de hulp bij het ontwerpen van de antagomirs. We danken ook Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey en Bijay Pattnaik voor hun hulp met experimentele methoden. Dit werk werd gefinancierd door de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek (BSC0123). HS, MV en RR danken een beurs van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek, India. MAS bedankt een beurs van de University Grants Commission, India.

Let op: Al de procedure met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn door Institutional Dieren Ethische Commissie (IAEC) aan het Institute of Genomics en Integrative Biology, New Delhi goedgekeurd (IGIB / AEC / 10/2013). Dit protocol is specifiek aangepast voor gerichte afgifte van Antagomir-29 in de hersenen en knockdown van miR-29. 1. Antagomir Design Strategy <ol><li> Haal de volwassen miRNA sequentie uit miRBase 11 <a href="http://www.mirbase.org/">(http://www.mirbase.org/).</a> </li><li> Haal de sequenties van verwante miRNA familieleden via de link &quot;Gene familie&quot; in de miRBase opnemen <a href="http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009">(Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).</a> </li><li> Omgekeerde complement van de sequentie: <a href="http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html">http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html</a> biedt een handig hulpmiddel omreverse complement sequenties. </li><li> Markeren de posities door LNA worden aangepast met behulp van de volgende richtlijnen: <ol><li> Kies Thymine resten geplaatst 3-4 basen apart voor de LNA modificatie, omdat LNA pyrimidinen zijn stabieler dan 12 purines. </li><li> Kies cytosineresten gescheiden door 3-4 resten als vorige stap produceert minder dan vijf wijzigingen. </li><li> Prioriteren van de vijf wijzigingen einde van de antagomir de 5 &#39;, aangezien dit voorkomt het zaad sequentie. </li></ol></li></ol> 2. Antagomir-neuropeptide Complex Voorbereiding Opmerking: Dit is de meest kritische fase in het protocol en standaardisatie nodig. Het protocol elke fluorescerend gemerkte oligonucleotide (FLO) kan worden gebruikt in plaats van de antagomir 9 standaardiseren. De peptiden moet zeer zuiver zijn (HPLC kwaliteit, 98% zuiver) .Sequences en belast peptide en antagomir zijn in tabel 1. <ol><li> Bepaal het aantal moles van antagomir te injecteren op basis van molaire lading op antagomir, de toxiciteit en het gewicht van de muis. Bereken het aantal mol peptide worden geïnjecteerd gebaseerd op molaire ladingsverhouding van antagomir tot: peptide. OPMERKING: Standaardiseren molaire lading verhouding van antagomir: peptide voor toxiciteit en effectieve levering in de hersenen van muizen. Gebruik verschillende molaire lading verhoudingen van fluorescent gelabelde oligonucleotide: peptide voor standaardisatie. We vonden dat Antagomir-29 en de controle waren allebei giftig bij 4microgram / gram lichaamsgewicht van de muis. Antagomir-29 en de controle werden gebruikt 2microgram / gram lichaamsgewicht, maar deze effectieve concentratie kan variëren voor elke microRNA. </li><li> Verdun het peptide en antagomir in afzonderlijke microfugebuizen van voorraadoplossingen met steriele 10% D-glucose om de gewenste eindconcentratie zoals berekend in stap 1. </li><li> Houd de microcentrifugebuis met het peptide-oplossing op een vortex bij matige snelheid vortexen. </li><li> Voeg 1/3 van de antagomir oplossing voor de peptide oplossing buis, langzaam, druppelsgewijs, terwijl het grondig wordt gemengd op een vortex mixer. </li><li> Zet mengen van oplossingen op de vortex gedurende 1 minuut volgende en laat vervolgens het mengsel gedurende 1 min staan. </li><li> Herhaal stap 4 en 5 twee keer om de resterende antagomir oplossing met de peptide-oplossing in dezelfde microcentrifugebuis mengen. De langzame toevoeging is essentieel voor de vorming van mono-disperse complexen die effectief transfectie zijn. Snelle toevoeging kan leiden tot aggregatie van de complexen en de neerslag. </li><li> Incubeer het complex 30 min bij kamertemperatuur zonder te vortexen. Gedurende deze incubatietijd, acclimatiseren de muizen naar het laboratorium waar de injectie zal worden uitgevoerd. </li></ol> 3. staartader Injectie van Antagomir-neuropeptide Complex <ol><li> Om het dier te beperken, plaatst u de muis in een restrainer of decapicone van de juiste grootte. </li><li> Reinig het oppervlak van de staart met behulp van wattenstaafje pre-geweekt in warm water (ongeveer 40 ° C). Dit zal vaatverwijding bevorderen en de zichtbaarheid van de ader. </li><li> Benader de staart met een klein volume (0,5-1,0 cc) insulinespuit in een 15-20 ° hoek. Wees voorzichtig eventuele lucht niet in te voeren in de spuit. Begin bij de distale deel van de staart. Injecteren van het complex. Verwijder de naald en een antiseptische wattenstaafje direct op de plaats van injectie (ongeveer 5-10 sec) om het bloeden te stoppen. </li><li> Vervang de muis in een afzonderlijk geventileerde kooi in de groep 3-5, met maïskolf en tissuepapier als verrijking. Heeft geïnjecteerde en geïnjecteerde muizen niet te houden in dezelfde kooi. </li></ol> 4. Behavioural Testen Opmerking: Bewaar het tijdsinterval van 3-4 uur tussen injectie en gedragsmatige testen om het herstel na de injectie toe te staan. Breng de muis om een ​​rustige kamer. Hebben de dieren niet storen tijdens deze periode van acclimatisatie. <ol><li> Acclimatiseren de muis om denieuwe kamer gedurende 30 minuten en dan beginnen de volgende gedrags-assays. Dient een ruimte van 10 minuten tussen elke gedrags assay. </li><li> Achterbeen clasping: OPMERKING: Deze test geeft motorische stoornissen en neurologische stoornissen. <ol><li> Til de muis voorzichtig door het houden van de buurt basis van de staart in de heldere achtergrond. </li><li> Controleer het achterbeen positie voor 10-15 sec. Wildtype muis splays achterpoten vanaf buik, terwijl een atactisch muis neiging om één of beide achterpoten trekken naar het abdomen meer dan 50% van de tijd gesuspendeerd 13. </li><li> Breng de muis naar de kooi </li></ol></li><li> Ledge-test: <ol><li> Til de muis voorzichtig door het houden van de staart en houd het op de rand van een kooi. </li><li> Let op de muis die specifiek op de hoek van de kooi. Wild-type muis kan de hoeken gemakkelijk zonder angst en verlies van de balans. Ataxic muis verliest zijn evenwicht, bevriezen of schudt tijdens een wandeling langs de kooi richel en op de hoeken. </li></ol></li><li&gt; Mouse foot print-test: OPMERKING: Bij deze test houdt het absorberende laag klaar, op de vloer van een smalle baan (~ 70 cm lange, ~ 5-cm brede met ~ 5-cm hoge wanden.) <ol><li> Houd de muis voorzichtig met de ene hand en opbrengen van inkt op de achterpoten met een borstel. </li><li> Plaats de absorberende laag op de vloer van een smalle baan. </li><li> Laat de muis om te wandelen of lopen over een absorberende blad in een rechte lijn in een start-en landingsbaan van de ene naar de andere. </li><li> Herhaal dit proces nog twee keer bij elke muis met verse absorberende laag. </li><li> Meet de afstand tussen twee opeenvolgende stappen in de voorwaartse beweging. Do eerste en de laatste paar voetafdrukken omvatten niet waar het dier is gewoon het initiëren en afwerking zijn looppas, respectievelijk. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+novel+therapeutic+targets+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery+today%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases.</a> Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).</li>
<li>Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA%3A+Implications+for+Alzheimer+Disease+and+other+Human+CNS+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders.</a> Current Genomics. 10, 154-168 (2009).</li>
<li>Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+Disease+and+Potential+Therapeutic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications.</a> Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).</li>
<li>Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Promise+of+MicroRNA+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">The Promise of MicroRNA Replacement Therapy.</a> Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).</li>
<li>Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+microRNA+function+by+antimiR+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Silence%22%5BJournal%5D)">Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides.</a> Silence. 3, 1-17 (2012).</li>
<li>Trang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Delivery+of+Tumor+Suppressor+microRNA+Mimics+Using+a+Neutral+Lipid+Emulsion+Inhibits+Lung+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice.</a> Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).</li>
<li>Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotactic+Injection+of+MicroRNA-expressing+Lentiviruses+to+the+Mouse+Hippocampus+CA1+Region+and+Assessment+of+the+Behavioral+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome.</a> J Vis Exp. (76), e50170(2013).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvascular+delivery+of+small+interfering+RNA+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system.</a> Nature. 448, 39-43 (2007).</li>
<li>Roshan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-specific+knockdown+of+miR-29+results+in+neuronal+cell+death+and+ataxia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice.</a> RNA. 20, 1287-1297 (2014).</li>
<li>Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+DNA%E2%88%92RNA+Heteroduplex+Formation%3A+Effects+of+Locked+Nucleic+Acid+Nucleotides+Incorporated+into+the+DNA+Strand%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand.</a> Biochemistry. 47, 1218-1227 (2008).</li>
<li>Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRBase%3A+microRNA+sequences%2C+targets+and+gene+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.</a> Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).</li>
<li>Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+Chemistry+and+Therapeutic+Applications+of+Locked+Nucleic+Acid+%28LNA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA).</a> Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).</li>
<li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Composite+Phenotype+Scoring+System+for+Evaluating+Mouse+Models+of+Cerebellar+Ataxia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia.</a> J. Vis. Exp. (39), (2010).</li>
<li>Bergen, J. M., Park, I. -K., Horner, P. J., Pun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Approaches+for+Neuronal+Delivery+of+Nucleic+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids.</a> Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).</li>
<li>Zou, L. -L., Ma, J. -L., Wang, T., Yang, T. -B., Liu, C. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Penetrating+Peptide-Mediated+Therapeutic+Molecule+Delivery+into+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System.</a> Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).</li>
<li>Hwang, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brain-targeted+rabies+virus+glycoprotein-disulfide+linked+PEI+nanocarrier+for+delivery+of+neurogenic+microRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA.</a> Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier demonstreren we een wijd toegankelijke methodologie om de effecten van miRNA-modulatie te bestuderen. Momenteel omvatten de meeste pogingen tot in vivo karakterisering van miRNA-functies het creëren van knockout-muizen of een transgeen dat een miRNA-sprong tot expressie brengt. De meeste miRNA's, zelfs die welke specifiek zijn voor het celtype, worden in meer dan één orgaan tot expressie gebracht. miRNA's die aanvankelijk werden geacht specifiek te zijn voor het hematopoietische systeem, worden bijvoorbeeld...

MicroRNAs zijn ontstaan ​​als nieuwe therapeutische targets te wijten aan hun universele rol in de regulering van genexpressie en direct bewijs voor de betrokkenheid bij de ziekte. MiRNAs worden actief onderzocht voor hun potentieel als drug targets 1,2. Verder, veranderingen in miRNA expressie zijn geassocieerd met verschillende aandoeningen 3 en simulatie van deze veranderingen door kunstmatige verstoring van miRNA expressie kan worden gebruikt om de cellulaire routes betrokken bij de ziekte manifestatie bestuderen. Weefsel specifieke aflevering van miRNA targeting drugs is momenteel een grote uitdaging voor miRNA gebaseerde ontwikkeling van geneesmiddelen. Antagomirs en miRNA bootst zijn veelbelovend agenten voor verstoren miRNA niveaus 4-6. Echter, speciale functies die hun specificiteit en doeltreffendheid te verbeteren hebben in het ontwerp van antagomirs op te nemen voordat ze kunnen worden toegepast voor in vivo verstoring van miRNA expressie. MicroRNAs zijn vooral relevant<html> als doelen in momenteel ongeneeslijke neurodegeneratieve en neuro-ontwikkelingsstoornissen ziekten. De bloed-hersenbarrière vormt een beperking voor de levering van antagomirs de hersenen. Stereotactische injecties worden veel gebruikt in diermodellen om moleculen op specifieke locaties te leveren in de hersenen 7. Het vereist vaardigheid, omvangrijke investeringen in instrumentatie en tijd. Stereotactische injecties zijn invasief, betrekken chirurgie, veroorzaken ten minste lichte verwondingen en zijn beperkt tot lokale levering. Het gebruik van mobiele penetrerende peptiden met een voorkeur voor het richten neuronen kunnen deze beperkingen tegengaan aangezien zij door de trans-vasculaire route kan worden geleverd, maar schenden de bloed-hersenbarrière. Een dergelijk peptide afgeleid van het rabiësvirus glycoproteïne (RVG), is eerder gebruikt om siRNA leveren tegen Japanse encefalitis virus bij muizen 8. We vonden dat het gebruik van het peptide voor antagomir levering, miRNAs effectief kan worden neergehaald in muizenhersenen 9. NHOUD &quot;&gt; De tweede grote uitdaging van miRNA neerhalen komt voort uit de geringe omvang van miRNAs en de aanwezigheid van nauw verwante sequentie isovormen. We nemen het voorbeeld van de MMU-miR-29 familie die bestaat uit drie nauw verwante isovormen, miR-29a , b en c. antagomirs zijn meestal ook gewijzigd langs de ruggengraat om hun stabiliteit te verhogen en ze bestand zijn tegen aantasting door nucleasen render. Locked Nucleic Acids (LNA) bieden een verder voordeel dat de thermische stabiliteit en zelfs leiden tot afbraak over en voorbij richten sterische hindering 10. Invoering wijzigingen langs de hoofdketen effectief maar duur kunnen zijn. Wij hebben eerder gezien dat modificaties voorbij een optimaal aantal niet verder verbeteren van de werkzaamheid. Het ontwerp van de antagomir gaat dus om optimale aanpassing van de antagomir. Om de complexe antagomir niet-covalente wijze met de neurotrope peptide, een geladen hepta- tot nona-arginine extensie wordt gebruikt. D-Arginineresiduen worden gebruikt omdat daarmee een hogere stabiliteit zij niet gevoelig zijn voor splitsing door proteasen. Hepta- tot nona-arginine trajecten dienen als efficiënte cel penetrerende middelen, hoewel ze verleent celtype specificiteit. Door covalente koppeling van het peptide aan het RVG nona-arginine linker, een neurotrope celpenetrerende peptide werd gegenereerd. De positief geladen resten van het peptide interactie met de negatief geladen nucleïnezuur backbone, tot complexen. Deze complexen kunnen worden gebruikt om effectief te transfecteren DNA of RNA in gekweekte cellen en in vivo in weefsels.

<table><tbody><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Restrainer of Decapicone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smal luchtvaartbaan</td><td></td><td></td><td>~70 cm lang, ~5 cm breed met ~5 cm hoge muren.</td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent gelabelde oligonucleotiden (siGLO)</td><td>GE Healthcare Dharmacon INC</td><td>D0016300120</td><td></td></tr><tr><td>10% steriele D-glucose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-29</td><td>Exiqon</td><td>op maat gemaakte synthese</td><td></td></tr><tr><td>Antagomir-controle</td><td>Exiqon</td><td>op maat gemaakte synthese</td><td></td></tr><tr><td>Neuropeptide RVG</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>op maat gemaakte synthese</td><td>>98% zuiverheid</td></tr><tr><td>Neuropeptide RVM</td><td>G.L.Biochem (Shanghai) Ltd.</td><td>op maat gemaakte synthese</td><td>>98% zuiverheid</td></tr><tr><td>Anders</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Katoen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warm water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulinspuitjes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Absorptieve lakens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borstel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antisepticum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een eenvoudig alternatief voor stereotactische injectie voor brain specifieke knockdown van mirna

A Simple Alternative to Stereotactic Injection for Brain Specific Knockdown of miRNA

MicroRNAs (miRNAs) zijn belangrijke regulerende factoren van genexpressie. In de hersenen zijn essentiële processen zoals neuro-ontwikkeling en neuronale functies afhankelijk van de juiste expressie van microRNAs. Verstoring van microRNAs in de hersenen kan worden gebruikt om neurodegeneratieve ziekten te modelleren door neuronale celdood te moduleren. Momenteel wordt stereotactische injectie gebruikt om miRNA knockdown-agentia naar specifieke locaties in de hersenen te brengen. Hier bespreken we strategieën om antagomirs te ontwerpen tegen miRNA met locked nucleotide modificaties (LNA). Vervolgens beschrijven we een methode voor hersenspecifieke levering van antagomirs, gelijkmatig over verschillende hersengebieden. Deze methode is eenvoudig en breed toepasbaar omdat het de chirurgie, geassocieerde schade en beperkingen van lokale levering bij stereotactische injecties omzeilt. We bereidden een complex van neurotroop, cel-penetrerend peptide Rabies Virus Glycoproteïne (RVG) met antagomir tegen miRNA-29 en injecteerden het via de staartader, om specifiek in de hersenen te leveren. Het antagomir-ontwerp bevatte kenmerken die specifieke targeting van de miRNA en vorming van niet-covalente complexen met het peptide mogelijk maakten. Het knock-down van de miRNA in neuronale cellen resulteerde in apoptotische celdood en geassocieerde gedragsstoornissen. Dus, de methode kan worden gebruikt voor acute modellen van neuro-degeneratie door de verstoring van miRNAs.

Met behulp van de hier gepresenteerde procedure, complexen van 50microgram fluorescent gelabelde oligonucleotide (FLO) en ~ 850microgram RVG peptide van 1:15 molaire lading ratio: waren (FLO peptide) bereid en geïnjecteerd slechts eenmaal door staartader. Complex van niet-neurotropic rabiësvirus Matrix (RVM) peptide en FLO werd gebruikt als een afgiftesysteem control. De volgende dag muizen hersenen en de lever werden geïsoleerd en enkele cel suspensies werden bereid. De cellen werden waargenomen onder microscoop groene...

MicroRNA's spelen een cruciale rol in de hersenen en zijn potentiële doelen voor het modelleren van neurodegeneratie. Het verstoren van miRNA-niveaus is echter een uitdaging vanwege de korte lengte van miRNA en de ontoegankelijkheid van hersenweefsel. Deze video presenteert een methode voor het ontwerpen van antagomir en specifieke levering aan de hersenen met behulp van een neuropeptide bij muizen.

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression.  In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the ...

Hier demonstreerden we het gebruik van een celpenetrerend peptide met een gemodificeerd antisense-oligonucleotide om specifiek micro RNA in de hersenen van muizen neer te reguleren. Dit werd bereikt door een antigo tegen May 29 te ontwerpen. In deze studie hebben we antigo-mannen gebruikt om microRNA's met lock-nucleïnezuurmodificaties te targeten.LNA-modificaties werden op vijf verschillende posities geïncorporeerd. Hierbij verhoogt de incorporatie van LNA-modificaties de bindingsaffiniteit aan het microRNA. Daarnaast biedt het nucleasebestendigheid en verhoogt het daarmee de efficiëntie van het microRNA-targeten.Complexen van ANTIGO MAR met het peptide werden in vitro geprepareerd en via de staartader in de muizen geïnjecteerd. De knockdown van het microRNA resulteerde in gedragsveranderingen die wijzen op de betrokkenheid van dit microRNA bij ataxia; drie opeenvolgende injecties waren voldoende om een merkbare verandering in de gang na behandeling te induceren. Brainweefsel werd verzameld en de knockdown van het microRNA werd bevestigd. CPP's of zelfpenetrerende peptiden zijn onlangs opgekomen als aantrekkelijke dragers voor de aflevering van nucleïnezuren.Hier hebben we gebruikgemaakt van een dergelijk arginine-rijk neurotropisch peptide dat ladingsgebaseerde complexvorming met de LNA kan ondergaan, waardoor het na toediening in de systemische circulatie de beoogde doelplaats bereikt — in dit geval neurale cellen — en de juiste afgifte van de LNA in deze cellen waarborgt. De sequenties van de leden van de ME 29-familie zijn opgehaald uit mease en de 16 MER antisense zijn gesynthetiseerd met lock nucleic acid-modificaties op vijf gelijkmatig verdeelde posities om complexen te bereiden. De peptide- en antigo-oplossingen van passende concentraties werden afzonderlijk bereid in steriele 10% glucose.Onder aseptische omstandigheden. De Antigo-oplossing werd langzaam druppelsgewijs toegevoegd aan de peptide-oplossing onder voorzichtig roeren. Langzame toevoeging en voorzichtig roeren zijn cruciaal voor de vorming van monodisperse complexen waarvan de grootte in de tric-schaal ligt.De antigo werd telkens in drie gelijke delen toegevoegd, waarbij telkens een minuut werd toegestaan voor het mengen, gevolgd door een minuut incubatie zonder menging. Snelle toevoeging kan leiden tot aggregatie van de complexen en precipitatie. Het antigo-complex is nu klaar voor injectie.Het complex werd toegediend via een injectie in de staartvene. De muizen werden teruggeplaatst in dezelfde kooi. Gedragsassays voor ataxie werden dagelijks uitgevoerd, drie uur na de injectie.De muis werd bij de staart vastgehouden, zodat deze geen omringende objecten kon aanraken. Let op de manier waarop de achterpoten 10 seconden lang gespreid zijn. Bij de ledge-test moesten de muizen langs de smalle rand van de kooi lopen.De muizen lopen door een smal kanaal en laten met inkt op de voeten voetstappen achter op een strook dik absorberend papier; hierbij worden alleen de achterpoten geïnkt. Om verwarrende gegevens van vier ledematen te voorkomen, bekijken we het effect van de antigene behandeling. We hebben de hersenen en andere weefsels geïsoleerd van de behandelde en controlemuizen.We stelden vast dat het R VG-peptide een fluorescent gelabeld siRNA specifiek naar de hersenen transporteerde, maar niet naar andere weefsels zoals de lever. Een niet-neurotropisch controlepeptide, RVM, transporteerde het siRNA naar de lever. Muizen die behandeld waren met ANTIER 29 vertoonden defecten aan de achterpoten.Mice met een grijpreflex die behandeld waren met een scrambled anme konden de rand overbruggen, maar na behandeling met anme tegen MARE 29 vertoonden de muizen milde defecten bij deze assay. In de footprint-assay was er een opvallende verkorting van de staplengte bij de behandelde muizen. Daarnaast hebben we via QR-tpcr bevestigd dat de niveaus van mid 29 A en mid 29 B waren gedownreguleerd voor de ontwikkeling van micro-NNA-gebaseerde therapieën.Hersenspecifieke toediening van anti-microRNA's is een uitdaging vanwege de bloed-hersenbarrière. Met de hier gepresenteerde techniek kunnen we de conventionele toedieningsmethode van anti-microRNA's aan de hersenen vermijden. Deze methode maakt de knockdown van microRNA's technisch haalbaar en verhoogt de weefselspecificiteit.

a-simple-alternative-to-stereotactic-injection-for-brain-specific

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een methode waarmee genexpressie in de neurale buis downgereguleerd in een celtype-specifieke, traceerbare wijze beschreven. We laten zien...

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Source: Ullah, I., et.al. A Positioning Device for the Placement of Mice During Intranasal siRNA Delivery to the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates a precise intranasal administration technique for delivering neuron-targeting peptide-siRNA complexes to the mouse brain using a specialized positioning device. Anesthetized mice are secured in a head-down-and-forward position to optimize siRNA inhalation while preventing lung drainage. The targeting peptide...

Intranasal Delivery of siRNA to the Mouse Brain Using a Positioning Device

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

In dit artikel tonen we een werkwijze voor het manipuleren van genexpressie in het ventriculaire cellen van het volwassen zebravissen telencephalon met morfolino antisense oligonucleotiden. Wij stellen deze werkwijze efficiënt en snel protocol dat kan worden gebruikt voor functionele studies in de volwassen gewervelde hersenen.

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Hier beschrijven we de levering van microRNA met behulp van een recombinant adeno-associated virus serotype 9 in een muismodel van een neuromusculaire ziekte. Eenmalige perifere toediening in muizen geleid tot aanhoudende miRNA overexpressie in spieren en motorische neuronen, bieden een kans om studie miRNA functie en therapeutisch potentieel in vivo.

Systemische levering van MicroRNA met behulp van Recombinant Adeno-associated Virus Serotype 9 voor de behandeling van neuromusculaire ziekten bij knaagdieren

Dit protocol biedt een workflow op hoe te combineren met kunstmatige microRNA-gemedieerde RNA-interferentie met optogenetics te stimuleren specifiek presynaptische los met verminderde expressie van selectieve gene(s) binnen intact neuronale circuits.

Optogenetics combineren met kunstmatige microRNAs te karakteriseren van de effecten van Gene Knockdown op presynaptische functie binnen Intact neuronale Circuits

Weefsel-specifieke microRNA remming is een technologie die in het veld microRNA onderontwikkeld is. Hierin beschrijven we een protocol om met succes het remmen van de familie van de miR-181 microRNA in myoblast cellen uit het hart. Nanovector technologie wordt gebruikt voor het leveren van een microRNA spons die significante in vivo cardio-specifieke miR-181 familie remming toont.

In Vivo Nanovector levering van een hart-specifieke MicroRNA-spons

Hier presenteren we een protocol met behulp van een muis positionerings apparaat dat de juiste plaatsing van muizen mogelijk maakt voor de intranasale toediening van een hersen gerichte peptide-siRNA-formulering die effectieve gen-uitschakeling in het centrale zenuwstelsel toelaat.

Een positionerings apparaat voor de plaatsing van muizen tijdens intranasale siRNA levering aan het centrale zenuwstelsel

Hier beschreven is een protocol voor het karakteriseren van modules van biologisch synergetische miRNAs en hun assemblage in korte transgenen, waardoor gelijktijdige overexpressie voor gentherapie toepassingen mogelijk is.

Karakterisatie van functioneel geassocieerde Mirna's in glioblastoma en hun engineering in kunstmatige clusters voor gentherapie

We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo's omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.

Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's

Dit protocol beschrijft een high-throughput clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genbewerkingsworkflow voor microRNA-clusternetwerkanalyse die de snelle generatie van een panel van genetisch gemodificeerde cellijnen met unieke miRNA-clusterliddeletiecombinaties zo groot als 35 kb binnen een enkel experiment mogelijk maakt.

CRISPR Gene Editing Tool voor MicroRNA Cluster Network Analyse

Leer een methode voor hersenspecifieke knockdown van microRNA's in muizen met behulp van een neuropeptide en antagomir. Deze techniek omzeilt de bloed-hersenbarrière en maakt onderzoek naar neurodegeneratie mogelijk.

Een eenvoudig alternatief voor stereotactische Injectie voor Brain Specifieke Knockdown van miRNA

Meer video's verkennen