Intracerebroventriculaire Injectie van amyloid-β peptiden in normale muizen om acuut induceren Alzheimer-achtige cognitieve tekorten
16 maart 2016
De amyloid-β (Aß) -injected diermodel kan de toediening van een bepaalde hoeveelheid en de soort van Ap-fragmenten en vermindert de individuele verschillen binnen elke studiegroep. Dit protocol beschrijft de intracerebroventriculaire (ICV) injectie van Ap zonder stereotactische instrumenten, waardoor de productie van Alzheimer-achtige gedragsafwijkingen bij normale muizen.
Het algemene doel van deze chirurgische procedure is om de intracerebroventriculaire injectie van Amyloid beta uit te voeren zonder stereotactische instrumenten, en om acuut Alzheimer-achtig gedragsaandoeningen te induceren bij normale muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van neurobiologie, zoals medicijnontdekking voor de ziekte van Alzheimer. Het grootste voordeel van deze techniek is dat we de directe injectie van A beta in de intracerebroventrikelregio van de muizen kunnen uitvoeren zonder de hulp van stereotactische instrumenten, en het stelt ons in staat om Alzheimer-achtig gedragsaandoeningen bij muizen na te bootsen zonder te wachten op het verouderingsproces.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar therapie of diagnose van de ziekte van Alzheimer, omdat het kan worden gebruikt om de downstream pathologie van Amyloid beta te bestuderen en om medicijnkandidaten te screenen. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn bij deze methode worstelen, omdat het moeilijk kan zijn om de precieze locatie van bregma op de dierenschedel te vinden. Om met deze procedure te beginnen, maak een millimolaire A-beta met DMSO.
Verdun het vervolgens tienvoudig in PBS. Bereid vervolgens een PBS-oplossing met 10% DMSO voor als voertuig voor ICV-injectie. Daarna, wikkel de microsyringe met een 26-gauge roestvrijstalen naald met behulp van Parafilm strips om de naaldlengte voor diepte-gecontroleerde injectie aan te passen.
Wickel de spuit meerdere keren dicht in, zodat de Parafilm niet zal worden samengedrukt tijdens de naaldaansluiting, en de naaldlengte constant blijft. Snijd vervolgens de lagen van de Parafilm strips om de naaldlengte aan te passen tot 3,8 millimeter tussen de naaldtip en de Parafilm. Was vervolgens de spuit twee keer met 70% ethanol.
Spoel vervolgens de spuit met gedistilleerd water. Droog het volledig in een afzuigkap gedurende ten minste 30 minuten en laat de schone spuit nog eens 20 minuten onder een UV-lamp liggen voordat u injecteert. Plaats in deze stap een zeven weken oude verdoofde muis op een warme mat.
Breng vervolgens steriele PBS-druppels of zalf aan op beide ogen om droge ogen tijdens de procedure te voorkomen. Bevestig vervolgens adequate anesthesie door de toe-pincherextensor reflex te beoordelen. Bereid vervolgens twee spiegels voor met meerdere verticale lijnen die op de oppervlakken zijn getekend om referenties te bieden voor de loodrechte injectie van de spuit.
Plaats een spiegel direct naast het lichaam van de muis en de andere voor het hoofd. Houd M1 parallel aan de denkbeeldige middellijn tussen de twee ogen van de muis en rangschik M2 loodrecht op M1, zodat de twee vlakken een hoek van 90 graden vormen. Spuit vervolgens 70% ethanol op de voorkant van de muis en wrijf het met droge wattenstaafjes.
Om de bregma te lokaliseren, plaats de duim en wijsvinger direct boven de ogen en druk lichtjes op het voorhoofd totdat beide ogen uitsteken. Trek tegelijkertijd de huid van het voorhoofd naar achteren om de beweging van de schedel eronder te minimaliseren. Lokaliseer de injectieplaats met een kleermakerslint op 2,4 millimeter diepte onder de schedel.
Vul de spuit met 10 microliter A-beta oplossing of voertuig. Plaats de spuit zodat deze loodrecht staat op het vlak van de injectieplaats. Richt vervolgens de gereflecteerde beelden van de spuit in beide spiegels uit op de getekende lijnen op de spiegels.
Begin met het inbrengen van de naald totdat de Parafilm-wikkeling de huid raakt. Houd de spuit met één hand vast en injecteer vijf microliter van de A-beta oplossing of het voertuig met de andere hand, langzaam gedurende vijf seconden zonder te pauzeren, en zorg ervoor dat de spuit gedurende de hele tijd loodrecht blijft. Wacht na voltooiing van de injectie drie tot vijf seconden voordat u de spuit verwijdert.
Plaats de duim en wijsvinger weer op het hoofd en houd het vast om te voorkomen dat de schedel onnodig beweegt. Verwijder vervolgens de spuit zonder te kantelen. Plaats vervolgens de muis op een warme pad voor herstel.
Om te bevestigen of A-beta in het doel-ICV-gebied is geïnjecteerd, controleert u het spoor van de naaldaansluiting in het hersenweefsel om te zien of het een van de ventrikels heeft bereikt. Als de injectie niet succesvol was, sluit dan de gegevens van dat subject uit bij de analyse van de experimentele resultaten. In dit experiment werd het A-beta-peptide van 42 aminozuren in volledige lengte gebruikt om een mengsel van A beta monomeren, oligomeren en fibrillen te produceren.
Door de HFIP-geïnduceerde monomerisatie stap werden relatief homogene monomeren verkregen. Na de incubatie van zeven dagen werden diverse maten A-beta aggregaten ontwikkeld, waarbij trimeren en tetrameren de dominante soorten waren onder de oligomere vormen van A-beta. In deze studie werd ruimtelijk werkgeheugen beoordeeld in de A-beta geïnjecteerde muizen in de Y-labyrinttest, waarbij de volgorde van armkeuzes en het aantal totale armtoegangen werden geregistreerd terwijl elke muis vrij door het labyrint mocht gaan.
De A-beta geïnjecteerde muisgroep vertoonde significant lagere wisselingpercentages, wat wijst op de ontwikkeling van cognitieve stoornissen. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 20 minuten worden uitgevoerd, inclusief anesthesieprocedures, als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedures is het belangrijk om te onthouden de naald loodrecht op het injectievlak te maken.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van medicijnontdekking van de ziekte van Alzheimer om in vivo screening van medicijnkandidaten in deze gemakkelijk toegankelijke Alzheimer-knaagdiermodellen te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een intracerebroventriculaire injectie kunt uitvoeren zonder stereotactische instrumenten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de intracerebroventriculaire injectie van Amyloïde bèta (Aβ) in normale muizen zonder het gebruik van stereotactische instrumenten. Deze methode maakt de acute inductie van Alzheimer-achtige gedragsafwijkingen mogelijk, wat onderzoek in de neurobiologie en medicijnontwikkeling voor de ziekte van Alzheimer faciliteert.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Neurobiologie
- Onderzoek naar de ziekte van Alzheimer
Achtergrond
- Het Aβ-geïnjecteerde diermodel vermindert individuele verschillen binnen de studiegroepen.
- Deze techniek maakt directe injectie in de intracerebroventriculaire regio mogelijk.
- Het bootst Alzheimer-achtig gedrag na zonder dat er op veroudering gewacht hoeft te worden.
- Het vinden van de precieze locatie van het bregma kan uitdagend zijn voor beginners.
Doel van de studie
- Om Alzheimer-achtige gedragsafwijkingen bij normale muizen op te wekken.
- Om de downstream pathologie van Amyloïde bèta te bestuderen.
- Om te screenen op potentiële kandidaat-geneesmiddelen voor de ziekte van Alzheimer.
Gebruikte methoden
- Intracerebroventriculaire injectie van Aβ.
- Bereiding van één millimolaire Aβ met DMSO.
- Gedragsbeoordeling van geïnduceerde abnormaliteiten.
- Evaluatie van de implicaties voor geneesmiddelenontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle inductie van Alzheimer-achtig gedrag bij muizen.
- Aangetoonde haalbaarheid van de methode zonder stereotactische instrumenten.
- Inzichten verschaft in de pathologie van Amyloid bèta.
- De screening van kandidaat-geneesmiddelen gefaciliteerd.
Conclusies
- Deze methode is een waardevol instrument voor onderzoek naar de ziekte van Alzheimer.
- Het maakt een snelle beoordeling van gedragsveranderingen mogelijk.
- Het kan processen voor de ontdekking van geneesmiddelen versnellen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Acute intracerebroventriculaire injectie van amyloid-β bij normale muizen maakt een snelle modellering van Alzheimer-achtige cognitieve tekorten mogelijk, waardoor de noodzaak voor modellen op basis van veroudering wordt omzeild. Deze benadering biedt een gecontroleerd systeem voor het onderzoeken van amyloid-gedreven pathologie en het evalueren van kandidaat-therapeutica in vivo. De methode ondersteunt targetvalidatie in een vroeg stadium en versnelt de preconklinische besluitvorming voor portfolio's met betrekking tot de ziekte van Alzheimer.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt direct testen van de pathogeniciteit van amyloïd-β en de daaropvolgende effecten mogelijk in een gecontroleerde in vivo context.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door amyloïd-β te isoleren als de onafhankelijke variabele die cognitieve tekortkomingen veroorzaakt.
- Ondersteunt functionele validatie van targets voor therapiehypotheses die gericht zijn op amyloïd.
Screening & assay-ontwikkeling
- Biedt een reproduceerbaar diermodel voor gedragsscreening van kandidaatverbindingen die gericht zijn op amyloïde pathologie.
- Standaardiseert de inductie van cognitieve tekorten, wat de ontwikkeling van kwantitatieve gedragsassays ondersteunt.
- Maakt een snelle, schaalbare evaluatie van de effectiviteit van verbindingen in een ziekterelevant systeem mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij translationele biomarkerstrategieën door acute cognitieve beperkingen gekoppeld aan amyloïdebelasting te modelleren.
- Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie door een platform te bieden voor in vivo effectiviteitsbeoordelingen.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van kandidaten op basis van kwantitatieve gedragsresultaten.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit model past binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waardoor hypothese-gestuurde tests en lead-identificatie voor programma's tegen de ziekte van Alzheimer mogelijk worden.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing met betrekking tot amyloid-β-mechanismen en downstream cognitieve effecten.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare gedragsmatige resultaten voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van cognitieve prestaties voor comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Biedt continuïteit van mechanistische studies naar de selectie van preklinische kandidaten.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar in vivo platform voor lopend Alzheimer-onderzoek en screening.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in interventies gericht op amyloïde en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de modelopzet, verbetert de reproduceerbaarheid en ondersteunt schaalbare screening-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go beslissingen en de kapitaalallocatie door het leveren van snelle in vivo werkzaamheidsgegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten voor de ziekte van Alzheimer mogelijk op basis van functionele uitkomsten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in nauwkeurige intracerebroventriculaire injectie en gedragsbeoordeling.
- Toegang tot dierfaciliteiten, injectieapparatuur en infrastructuur voor gedragstests is noodzakelijk.
- Strenge standaardisatie tussen teams is vereist voor de injectiediepte en de gedragsprotocollen.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende muizenstammen of amyloid-β preparaten.
- Potentiële beperkingen omvatten technische variabiliteit in de nauwkeurigheid van de injectie en de gevoeligheid van de gedragstests.
