Name: Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer intravitaal confocale microscopie om neutrofielen en monocyten in mesenteriale venen van muizen te volgen onder rust- en ontstekingsomstandigheden. Deze methode onthult de dynamiek van immuuncellen in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door EMBO (voor Y.E.), Foundation Machaon (voor Y.E.) en SNSF (voor B.A.I.). We danken de Bioimaging Core Facility voor de beschikbaarheid van de Nikon A1r microscoop en de technische assistentie. We danken mevrouw Clarissa Bartley voor de Engelse correctie.

OPMERKING: Animal procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele Ethische Commissie van de Animal Care in Genève, Zwitserland en de kantonrechter Veterinair Bureau. Toelatingsnummer GE / 63/14. 1. Voorbereiding van een enkele celsuspensie van Bone Marrow <ol><li> Offer muis (8-12 weken oud) door cervicale dislocatie. Steriliseren achterpoten met 70% ethanol. Verwijder het vel van de achterpoten. </li><li> Ontleden muis scheen- en dij- en verwijder weefsel van benen met een scalpel. Spoel de benen met 90% ethanol en plaats in een cultuur schotel gevuld met PBS. </li><li> Onder de cultuur kap, schone tissue van dijbenen en scheenbeen met een scalpel en apart op kniegewricht. Snijd de uiteinden van de botten. </li><li> Flush beenmerg van elk been met behulp van een 23G naald en een 1 ml injectiespuit gevuld met opstelling medium (fenolrood-vrij DMEM / F12, 1% serum rat) in een 50 ml buis schroef. Verstoren celaggregaten door subtiel passage door de 23G needle en een spuit 1 ml. Breng totale volume op 25 ml met de voorbereiding medium. </li><li> Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml Red Blood Cell Lysis RBLC buffer (8,3 g NH4Cl, 1 g NaHCO 3, 1 ml EDTA (100 mM), compleet 1 L met gedestilleerd water, filtreren 0,22 pm) in een 15 ml schroef buis. Incubeer 30 sec op ijs. </li><li> Voeg 10 ml van de voorbereiding middelgrote en centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. Gooi supernatant en resuspendeer in 2 ml voorbereiding medium. </li></ol> 2. neutrofielen Verrijking door negatieve selectie <ol><li> Voeg 150 ul van Mouse neutrofielen verrijking cocktail (celisolatie platform kit zoals EasySep). Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Voeg 10 ml van fenolrood vrij DMEM. Inverteer eens en centrifugeer 250 xg, 3 min, 4 ° C. </li><li> Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1,75 ml voorbereiding medium in 5 ml polystyreen ronde bodem buizen. Voeg 250 ul BiotIn de selectie van de cocktail. Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Vortex de magnetische deeltjes (van het celisolatie platform kit) gedurende 30 sec deeltjes mengen. Voeg 500 ul van magnetische deeltjes celsuspensie. Meng en incubeer op ijs gedurende 10 minuten. </li><li> Plaats de buis in de magneet. Wacht 3 min. </li><li> Inverteer de magneet op een nieuwe 5 ml polystyreen rondbodem pijpen naar de gewenste ongelabelde cellen te verzamelen. Heeft de laatste druppel opknoping in de buis niet te nemen. Ongewenste cellen in de buis in de magneet blijven. Gooi deze buis in een biologisch gevaarlijk afval. </li><li> Plaats de nieuwe buis in de magneet. Wacht 3 min. </li><li> Inverteer de magneet op een nieuwe 15 ml schroef buis naar de gewenste ongelabelde cellen te verzamelen. Heeft de laatste druppel opknoping in de buis niet te nemen. </li><li> Volledige volume op 5 ml met fenolrood vrij DMEM. </li></ol> 3. Etikettering van neutrofielen <ol><li> Voeg 0,5 gl van een oranje kleurstof zoals Cell Tracker Orange (werkconcentratie1 uM, CMRA - chloormethyl-RODOL-acetaat, voorraad 10 mM in DMSO). Incubeer 2 min bij 37 ° C. </li><li> Voeg 2,5 ml preparaat medium. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml voorbereiding medium in een 1,5 ml buis. </li><li> Neem een ​​monster te tellen met hematocytometer. </li><li> Incubeer 5 minuten bij 37 ° C. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C. </li><li> Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet in 1 ml PBS. Centrifuge 250 xg, 5 min, 4 ° C te wassen. </li><li> Teruggooi supernatant. Resuspendeer pellet als 10x10 6 cellen per 100 ul PBS. Houd op ijs tot iv injectie. Opmerking cellen worden iv geïnjecteerd zo snel mogelijk. 6-12x10 6 neutrofielen / muis worden gewoonlijk verkregen. </li></ol> 4. Muis Voorbereiding voor intravitale Microscopie OPMERKING:.. Stap 4,1) en 4,2) dienen aan het begin van de proef worden uitgevoerd om langere wachttijd van gemerkte neutrofielen aan ic voorkomene. <ol><li> Weeg de CX 3 CR1 GFP muis (8-12 weken oud). </li><li> Bereid 800 pi anesthesie (ketamine 60 mg / kg xylazine 4,5 mg / kg, acepromazone 1,75 mg / kg in PBS). </li><li> Verdoven muis. Ip injectie met 200 gl / 20 g muis. Controle verdoving door teen knijpen en door het controleren van de ademhaling. </li><li> Injecteren neutrofielen (10x10 6 cellen in 100 ul PBS) intraveneus gebruik van de laterale staart aderen of de retro-orbitale sinus, op het gemak van de experimentator. </li><li> Zet de muis op verwarming pad en de bescherming van de ogen met oculaire gel. </li><li> Een glas dekglaasje (35 mm diameter) wordt in een 10 cm weefselkweek schotel, die een diameter van 30 mm gat. Gebruik olie is de weefselkweekplaat in contact met het dekglaasje te handhaven. </li><li> Incise buikhuid met een schaar om het buikvlies bloot. Incise buikvlies met een schaar om darm bloot. </li><li> Voeg 200 gl PBS (voorverwarmd bij 37 ° C) in de peritoneal holte. Neem de muis in je hand en zet het gezicht naar beneden, zodat de darm komt uit de buikholte met een zachte druk. Plaats de muis in de weefselkweekplaat. </li><li> Zachtjes deroll de darm met gesteriliseerd wattenstaafjes op de dekglaasje om de mesenteriale vaten bloot. </li><li> Snijd papieren zakdoekjes in bands en bevochtig ze met 37 ° C verwarmd PBS. Immobiliseer de darm met stukjes papier weefsels naar de mutaties als gevolg van peristaltiek verminderen. </li><li> Zet de weefselkweek schotel en de muis in de 37 ° C thermostaat is ruimte op de op maat gemaakte tray stadium van het omgekeerde microscoop. Invoering van een spuit met anesthetica sc in de achterpoot. OPMERKING: Bovendien kan de muis zuurstof (0,5 l / min) met een masker te ontvangen. </li><li> Controle muis voor anesthesie door teen knijpen en het controleren van de ademhaling elke 30 min. Indien nodig, zorgen voor een boost van anesthetica (20 ul) om verdoving goed te onderhouden. NIETE: Het drogen van het vaatstelsel moet worden vermeden. Derhalve wordt de vochtigheid gehandhaafd door regelmatig bevochtigen van het papier gebruikte weefsels naar de darm immobiliseren bij 37 ° C verwarmde PBS. </li></ol> 5. Het meten van neutrofielen en monocyten Gedrag in Ontstoken Schepen In Vivo met Intravitale Microscopie <ol><li> Set lasers om 488- en 561- op het laagste nodige macht om laser-geïnduceerde fototoxiciteit voorkomen. In onze experimenten, het lager is dan 0,5%. Intensiteit van GFP in monocyten en oranje kleurstof in neutrofielen is zo helder dat meestal 0,3% is genoeg. NB: Dit is een laservermogen van 0,15-0,25 mW met ons systeem. </li><li> Acquire beelden van 512 x 512 pixels (dwz 635 micrometer) in 2,2 sec met een open pinhole met de 20X droge doelstelling van de omgekeerde microscoop. Gebruik een z-diepte van 10 tot 20 urn, die voldoende signaal met het laservermogen laag zorgt. OPMERKING: We meestal experimenten uit te voeren met een z-diepte tussen de 12 tot 1656, m. Bij gepresenteerde figuren en films, de z-diepte 20 urn. Fasecontrast maakt de identificatie van endotheliale wanden en de beeldvorming wordt uitgevoerd op mesenterische aderen. Sinds patrouilleren cellen bewegen heel langzaam met een snelheid van 5-10 um / min 6, het opnemen van een veld van belang om de 20 sec is bevredigend. Met de beschreven instellingen, de gemotoriseerde fase maakt de opname van maximaal 7 interessegebieden tegelijk. </li><li> Plaats de muis en de mesenteriale vaten in de thermostaat kamer van de microscoop zijn hen in staat stellen om te herstellen van de voorbereiding voor de 30 minuten vóór de overname van de eerste film. Gedurende deze tijd kiest verschillende interessegebieden. Focus op het luminale oppervlak van het vat dichtst bij het doel. Indien nodig, gebruik maken van de lichte auto-fluorescentie van endotheel om scherp te stellen. OPMERKING: Chirurgie tijdens muis voorbereiding iets benadrukt het endotheel. Bijgevolg rollen van neutrofielen en/ of monocyten kan worden waargenomen in de eerste 15 min na bereiding muis. </li><li> Het opnemen van een film voor het ene beeld elke 20 seconden 30 min onder stabiele omstandigheden. OPMERKING: De software krijgt elk veld van interesse in 2,2 seconden en de gemotoriseerde podium beweegt automatisch van het ene gebied naar het andere. Het gaat terug naar de eerste positie binnen 20 seconden gedurende de 30 min van de opname film. </li><li> Om bloed ontsteking initiëren vat, voeg een druppel van 20 ui PBS dat 100 ug TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12 direct op de afgebeelde vaten. </li><li> Controle van de focus voor elk veld van belang. OPMERKING: Bij wording, er altijd kleine veranderingen van focus op z-as. Ondanks de 10-20 urn Z-diepte kan dit resulteren in een afname van de fluorescentie-intensiteit. Daarom handmatig elk aandachtsgebied heroriënteren aan het einde van elke film, indien nodig. Record Films voor 30 minuten periodes tot 3 uur aanTal na aanvang van de ontsteking. </li><li> Aan het einde van het experiment, offeren verdoofde muizen door cervicale dislocatie. </li></ol> 6. Generatie van filmbestanden en Tracking leukocyten LET OP: De Nikon acquisitie software genereert .nd2 bestanden, maar de volgende procedure zou vergelijkbaar met andere software en merken zijn. <ol><li> Bestanden te exporteren als tiff-serie. </li><li> Ga naar ImageJ software <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> Importeer de tiff-serie. Elk kanaal als een ander bestand. </li><li> Breng een mediaan filter met een straal van 2,0 pixel voor de groene en rode kanalen om ruis te verminderen (Proces&gt; Filters&gt; Median ...). </li><li> Bestanden converteren naar binaire (Proces&gt; Binary&gt; Maak Binary). De software in staat stellen de drempelwaarde voor elk beeld berekenen. </li><li> Kanalen in een reeks beelden (Afbeelding&gt; Kleur&gt; Kanalen samenvoegen ...) samen te voegen. Selecteer de monocyten in de green-kanaal, de neutrofielen in het rode kanaal en het uitgezonden licht in de grijze kanaal. </li><li> Omzetten gestapelde beelden in RGB kleuren (Afbeelding&gt; Kleur&gt; stapel RGB). </li><li> Bestand opslaan als .avi </li><li> De gegevens worden ingevoerd en gebundeld in Imaris software (Bitplane). Bewegingen van monocyten en neutrofielen worden dan gevolgd met behulp van de Tracking Wizard Spot. </li></ol>

<ol><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li>
<li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaching+multiple+barriers%3A+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li>
<li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li>
<li>Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLey%2C+K+%22Methods+Enzymol%22">Methods Enzymol</a>. 445, 255-279 (2008).</li>
<li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li>
<li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li>
<li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+NR4A1+%28Nur77%29+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li>
<li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li>
<li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li>
<li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li>
<li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li>
<li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nr4a1-dependent+Ly6C%28low%29+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li>
<li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li>
<li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De in dit manuscript beschreven methoden zorgen voor een consistente aanpak om efficiënt studeren monocyten en neutrofielen gedrag in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire aandoeningen. De cruciale stap van het preparaat is de immobilisatie van de darm met PBS bevochtigde weefsels. Als dit goed wordt uitgevoerd, worden mesenteriale vaten mooi bloot op het dekglaasje voor het overname. Dit maakt de selectie van verscheidene gebieden van belang leukocyten gedrag mesenterische ade...

<html> Neutrofielen en monocyten zijn cellen van het aangeboren immuunsysteem die continu circuleren in het bloed. Bij verwonding of infectie, inflammatoire signalen veroorzaken leukocyten diapedesis in beschadigde en geïnfecteerde weefsels, hierin het initiëren van een cellulaire immuunrespons 1-3. De snelheid van leukocyten mobilisatie bepaalt de positieve uitkomst van de immuunrespons. Deze ingewikkelde processen zich op specifieke moleculen (bv selectines, endotheel-gebonden chemokinen) aanwezig op het ontstoken endotheel waarmee de instelling van hechtmiddel contacten tussen circulerende leukocyten en het endotheel 1-3 .Om inzichten over de moleculen betrokken bij het ​​leukocyt krijgen recruitment cascade, is het belangrijk om de kinetiek van celrecrutering visualiseren en het gedrag van elke cel / populatie volgen. Een effectieve methode houdt intravitale microscopie op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in cellen van belang. content &quot;&gt; Tot op heden verschillende manieren gebruikt intravitale microscopie ontwikkeld om beeld het vaatstelsel 4,5. Bijvoorbeeld, beeldvorming van het oor dermis vasculatuur of mesenterische aderen door intravitale confocale microscopie werd gebruikt om het gedrag van muizen patrouilleren Ly6C lage monocyten en menselijke identificeren CD14 dim CD16 + monocyten aan de luminale zijde van bloedvaten onder stabiele omstandigheden 6-8. De muis cremaster vasculatuur model wordt vaak gebruikt om het gedrag van neutrofielen of inflammatoire Ly6C hoge monocyten onder ontstekings- of ischemische aandoeningen in transgene muizen te volgen. In dat geval wordt cremaster gestimuleerd via scrotum injectie van IL1β, CCL2, TNFP of fMLP. Na 2-4 uur, weefsels worden vervolgens chirurgisch exteriorized en intravitale confocale microscopie 11/09 geanalyseerd. Het volgende protocol beschrijft een werkwijze voor monocyten en neutrofielen tegelijk met elke monitoromgekeerde fluorescentie confocale microscoop. Verder Home onze methode hoe het hetzelfde schip vóór (steady state conditie) en na ontsteking en hoe de kinetiek van leukocyten werving volgen. Hiervoor maken we gebruik van de CX 3 CR1 GFP / wt muis, wiens monocyten uiten eGFP, iv geïnjecteerd met een oranje kleurstof gelabelde muizen neutrofielen. Met behulp van een omgekeerde confocale microscoop, is het mogelijk (1) op te sporen en te analyseren het patrouilleren Ly6C laag monocyten onder stabiele omstandigheden en (2) voor de aanwerving van zowel monocyten en neutrofielen in hetzelfde vat na lokale ontsteking te volgen. Hier maken we de inflammatoire aandoeningen met behulp van de TLR2 / TLR1 agonist Pam3CSK4 12. Bovendien kunnen dergelijke beeldvorming bijdragen tot de rol van specifieke moleculen van interesse in de verschillende stappen van de rekrutering van leukocyten cascade bepalen of uitgevoerd op bepaalde knock-out muizen of in aanwezigheid van blokkerende antilichamen 6,9,13.

<table><tbody><tr><td>5 ml polystyreen ronde bodembuizen&nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&nbsp;&nbsp; DT:4mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA Kleurstof</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magneet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Muis Neutrofiel Verrijkingskit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Immersiesmeer Type A</td><td>Nikon</td><td></td><td>elke viskeuze olie&nbsp;</td></tr><tr><td>Life Box Temperatuur Controle Systeem</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocale microscoop</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>geïnverteerde microscoop, gemotoriseerde x/y/z-standaard, NIS elementen software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>fenolroodvrij DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>elke phenolroodvrije medium is geschikt</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstitueer in PBS</td></tr><tr><td>Rattenserum</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td>inbegrepen in EasySep Muis Neutrofiel Verrijkingskit</td></tr><tr><td>Weefselkweekschotel 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

beeldvorming van neutrofielen en monocyten in mesenteriale veins door intravitale microscopie op verdoofd muizen in real time

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficiënte immuunrespons afhangt van snelle mobilisatie bloed leukocyten naar de plaats van infectie of letsel. Onderzoeken leukocytenmigratie in vivo is cruciaal voor het begrijpen van de moleculaire basis van de migratie van leukocyten en interactie met vasculaire endothelium. Een krachtige aanpak omvat opklaren op transgene muizen die fluorescerende eiwitten in de cellen van belang. Hier presenteren we een protocol voor imaging monocyten en neutrofielen in de CX 3 CR1 GFP / wt muis iv geïnjecteerd met oranje kleurstof gelabelde neutrofielen met een omgekeerde confocale microscoop. Time-lapse films verzameld van 30 min tot enkele uren beeldvorming kan de analyse van leukocyten gedrag mesenterische aderen onder zowel statische en ontstekingsaandoeningen. We beschrijven ook de stappen om lokaal opwekken bloedvat ontsteking met TLR2 / TLR1 agonist Pam3SK4 en bewaken van de subsequent rekrutering van neutrofielen en monocyten. De gepresenteerde techniek kan ook worden gebruikt om andere populaties van leukocyten controleren en onderzoeken moleculen betrokken bij leukocyt rekrutering handel of op andere stimuli of transgene muizen.

Het manuscript beschrijft een geoptimaliseerd protocol om het gedrag van monocyten en neutrofielen in het mesenterische aderen van verdoofde muizen in real time gemakkelijk volgen. Het gebruik van een 37 ° C-thermostaatregeling kamer is verplicht om de temperatuur van de muis te behouden en ook door temperatuursafhankelijke beweging van leukocyten. Bereiding van de muis is weergegeven in figuur 1. Figuur 2 toont de stippellijn gezien onder de microscoop. Doorgelaten licht maakt de ident...

We beschrijven een protocol om het gedrag van neutrofielen en monocyten in mesenteriale aderen onder stabiele en inflammatoire omstandigheden te monitoren met behulp van intravitale confocale microscopie op geanesthetiseerde muizen.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Het algemene doel van deze intravitale confocale microscopieprocedure is het monitoren van de dynamiek van neutrofielen en monocyten in mesenteriale venen onder steady-state en inflammatoire condities bij muizen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals wat de moleculaire basis is van leukocytenmigratie, rekrutering en interactie met het vasculaire endotheel. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de mogelijkheid om het patrouilleren van LY 60 low monocyten onder steady-state condities te volgen en te analyseren, en om de rekrutering van zowel monocyten als neutrofielen naar hetzelfde bloedvat na lokale inflammatoire stimuli te volgen. De procedure wordt gedemonstreerd door Stefan ler, de technicus van het laboratorium. Om een enkelcelpreparaat van beenmerg te maken, steriliseert u de achterpoten van een acht tot 12 weken oude muis met 70% ethanol en gebruikt u vervolgens een scalpel om de femurs en tibia's te oogsten zodra alle botten zijn losgemaakt.Spoel de poten af met 90% ethanol en breng de botten over naar een kweekschaal gevuld met PBS. Maak vervolgens in een zuurkast met het scalpel de femura en tibia schoon en scheid deze bij het kniegewricht. Snijd daarna de uiteinden van de botten af en gebruik een spuit van 1 ml gevuld met preparatiemedium en voorzien van een naald van 23 gauge om het merg uit elk bot in een conische buis van 50 ml te spoelen.Breek de celaggregaten op door ze opnieuw door de naaldpunt te leiden, en vul het totale volume van de celsuspensie vervolgens aan tot 25 milliliters met vers kweekmedium; centrifugeer de cellen en resuspendeer ze. Suspendeer het pellet in één milliliter lysebuffer voor rode bloedcellen en breng de cellen over naar een conische buis van 15 milliliter op ijs. Stop na 30 seconden de lyse met 10 milliliters kweekmedium.Centrifugeer de cellen opnieuw en resuspendeer het pellet in nog twee milliliter preparatiemedium om de neutrofielen door negatieve selectie te verrijken. Incubeer de beenmergcellen vervolgens gedurende 10 minuten op ijs met 150 µL mouse neutrophil enrichment cocktail.Aan het einde van de incubatie voegt u 10 milliliters fenolroodvrij DMEM toe. Keer de buis één keer om en centrifugeer de cellen. Resuspendeer het pellet in 1,75 milliliters preparatiemedium en breng de cellen over naar een polystyreen ronde bodem buis van vijf milliliter.Incubeer de cellen vervolgens gedurende 10 minuten op ijs met 250 microliters biotin selectiecocktail. Aan het einde van de incubatie suspenderen we de magnetische deeltjes uit de celisolatiekit door 30 seconden te vortexen. Incubeer de cellen daarna gedurende 10 minuten op ijs met 500 microliters van de deeltjes.Plaats de buis aan het einde van de incubatie in de magneet. Keer de magneet na drie minuten om in een nieuwe polystyreen ronde bodem buis van vijf milliliter. Om de niet-gelabelde cellen te verzamelen, plaatst u de buis met niet-gelabelde cellen in de magneet.Keer de magneet na drie minuten om in een conische buis van 15 milliliter om de ongelabelde cellen over te brengen, waarbij de laatste druppel in de buis achterblijft. Vul het volume vervolgens aan tot vijf milliliter met vers fenolroodvrij dm. Voeg nu een halve microliter van de geschikte cytoplasmatische kleurstof, zoals de hier gebruikte cell tracker orange, toe aan de cellen bij 37 graden Celsius.Na twee minuten bij 37 °C worden de cellen gewassen met 2,5 mL preparatiemedium en wordt het pellet resuspendeerd in 1 mL preparatiemedium in een 1,5 mL buis; tel de cellen en incubeer deze vervolgens gedurende vijf minuten bij 37 °C. Na het centrifugeren van de cellen suspenderen we het pellet in 1 mL PBS, gevolgd door een tweede centrifugatie. Gebruik olie om een glazen dekglas van 35 mm te bevestigen aan een weefkweekschaaltje van 10 cm met een gat van 30 mm diameter.Resuspendeer vervolgens de pellet op een concentratie van 1 × 10⁷ cellen per 100 µL PBS en plaats de cellen zo kort mogelijk na de labeling op ijs. Injecteer de gelabelde neutrofiele cellen intraveneus in een geanestheseerde CX3CR1-GFP-muis van 8 tot 12 weken oud en plaats de muis op een warmtematte. Breng vervolgens onmiddellijk zalf aan op de ogen van het dier en gebruik een schaar om de abdominale huid te openen, zodat het peritoneum zichtbaar wordt; incideer het peritoneum met de schaar om de darm bloot te leggen.Dien vervolgens 200 µL PBS van 37 °C toe in de peritoneale holte en draai de muis met de buik naar beneden over de weefkweekschaal om de darmen met zachte druk uit de peritoneale holte te verwijderen. Rol de darmen vervolgens voorzichtig met steriele wattenstaafjes op het dekglas om de mesenteriale vaten bloot te leggen en immobiliseer het weefsel met stukjes weefselpapier bevochtigd met PBS van 37 °C om bewegingen als gevolg van peristaltiek te verminderen. Het is zeer belangrijk om de tijd te nemen om de darm zorgvuldig te immobiliseren met met PBS verzadigde weefsels.Anders zullen bewegingen als gevolg van peristaltiek tijdens de beeldacquisitie het experiment verpesten. Plaats vervolgens de weefkweekschaal en de muis in een thermostaatkamer van 37 degree Celsius op een op maat gemaakte trace-stage van een omgekeerde microscoop en dien een tweede ronde anesthetica intramusculair toe in het achterpootje. Stel nu de betreffende lasers in op het laagste vermogen dat nodig is om door laser geïnduceerde fototoxiciteit te voorkomen en laat de muis 30 minuten rusten.Zodra het dier is hersteld, wordt de eerste film gedurende 30 minuten opgenomen onder steady-state condities. Om vervolgens de ontsteking van de bloedvaten te initiëren, wordt een druppel van 20 µL PBS met 100 µg van de TLR2/TLR1-agonist PAM3CSK4 direct op de gefotografeerde vaten aangebracht. Neem tot slot een tweede film op, waarbij nauwkeurig op de focus wordt gelet na toevoeging van de agonist, aangezien de ontsteking veranderingen in de breedte van het endotheel veroorzaakt, wat de focus op de Z-as beïnvloedt; hier worden de verschillende stappen van de beeldverwerking voor het eerste tijdspunt van een film opgenomen onder steady-state condities, zoals zojuist gedemonstreerd, in deze film getoond.Het patrouilleren van groene LASIK cilo monocyten onder steady-state condities kan worden gevisualiseerd met rode neutrofielen die in de bloedstroom circueren. Hier wordt hetzelfde interessegebied getoond 90 minuten na de toevoeging van PAM drie CSK vier, wat resulteert in een massale rekrutering van neutrofielen en monocyten naar de endotheelwand, die de monocyten nauwgezet scannen. Met behulp van de geschikte software kunnen de exacte paden van de monocyten en neutrofielen die het endotheel patrouilleren, worden gevolgd vóór en na het begin van de ontsteking.Het is belangrijk om op te merken dat een verlies van focus op de Z-as of een XY-verschuiving kan optreden als gevolg van darmbewegingen, wat het experiment kan verstoren. Deze techniek kan verder worden aangepast door gebruik te maken van verschillende genetisch gemodificeerde muismodellen of door blokerende antilichamen of farmaceutische geneesmiddelen te injecteren om de rol van specifieke moleculen van belang in het gedrag van leukocyten te bepalen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe de dynamiek van verzadigende leukocyten in mesenteriale venen kan worden gemonitord.

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Beschrijven we een protocol van helderveld intravitale microscopie voor het meten van dynamische neutrofiel-endotheliale cel interacties tijdens neutrofielen werving in reactie op de bron van een neutrofiel chemoattractant in vivo. Neutrofiele intraluminale kruipen, transendotheliale migratie en chemotaxis in de muis cremaster spierweefsel worden gevisualiseerd met een time-vervallen video fotografie en gevolgd met ImageJ.

Tracking neutrofielen intraluminale Crawling, transendotheliale migratie en chemotaxis in weefsel door intravitale Video Microscopie

In this video, we demonstrate the real-time visualization of blood cell-endothelial interactions in the mesenterial veins of a mouse model injected intraperitoneally with lipopolysaccharide.

Intravital Microscopy to Analyze Blood Cell-Endothelial Interactions in an Inflammation Mouse Model

Hier beschrijven we een experimentele techniek van fluorescentie intravitale microscopie heterotypische bloedplaatjes interacties op de neutrofiel geactiveerd endotheel visualiseren tijdens vasculaire inflammatie en trombose in levende muizen. Deze microscopische techniek waardevol zal zijn voor het moleculaire mechanisme van vasculaire ziekte te bestuderen en farmacologische middelen testen onder pathofysiologische omstandigheden.

Real-time beeldvorming van heterotypische Bloedplaatjes-neutrofiele Interacties op het geactiveerd endotheel tijdens vasculaire ontsteking en trombose in Live Muizen

Deze vereenvoudigde toepassing van intravitale microscopie van mesenterische aderen bij muizen kan worden gebruikt in verschillende ontstekingsmodellen om leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukemie-interacties te observeren.

Intravitale Microscopie van leukocyten-endotheel en bloedplaatjes-leukocyten Interactions in mesenteriale Veins in Muizen

Dit huidige protocol maakt gebruik van fluorescente reporters, in vivo labeling en intravitale beeldvormingstechnieken om het dynamische proces van neutrofiel priming in levende dieren te kunnen monitoren.

Intravitale Imaging van neutrofielen Priming gebruik van IL-1β-Promoter gedreven DsRed Reporter Muizen

Het protocol beschrijft een nieuw model voor een muis dijbeenraamkamer dat kan worden gebruikt om de beweging van cellen in het beenmerg in vivo te volgen. Intravitale multifotonfluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om drie componenten van het dijbeenmerg (vaatstelsel, collageenmatrix en neutrofielen) in de tijd te beeldvormen.

Dijbeen Window Chamber Model voor<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Tracking in het Muizen Bone Marrow

Monocyten zijn belangrijke bemiddelaars/mediators van arteriogenesis in het kader van perifere arteriële ziekte. Met behulp van een kelder membraan-achtige matrix en intravital microscopie, onderzoekt dit protocol monocyt homing en tumor-gerelateerde angiogenese na monocyt injectie in de femorale slagader afbinding lymfkliertest model.

Intravital microscopie van monocyt Homing en Tumor-gerelateerde angiogenese in een lymfkliertest Model van perifere arteriële ziekte

We beschrijven een methode om GFP-gelabeld γδ IELs met behulp van intravital Imaging van muizen dunne darm te visualiseren door omgekeerde spinnen schijf confocale microscopie. Deze techniek maakt het bijhouden van levende cellen in het slijmvlies voor maximaal 4 uur en kan worden gebruikt om een verscheidenheid van intestinale immuun-epitheel interacties te onderzoeken.

Intravital beeldvorming van epitheliale lymfocyten in muizen dunne darm

De rekrutering van leukocyten en bloedplaatjes vormt een essentieel onderdeel dat nodig is voor de effectieve groei van collaterale slagaders tijdens arteriogenese. Multifotonenmicroscopie is een efficiënt hulpmiddel voor het volgen van celdynamica met een hoge spatio-temporele resolutie in vivo en minder fototoxiciteit om leukocytenrekrutering en extravasatie tijdens arteriogenese te bestuderen.

Multifoton intravitale beeldvorming voor het monitoren van leukocytenrekrutering tijdens arteriogenese in een Murine Hindlimb-model

De migratie van neutrofielen is gebaseerd op de snelle en continue hermodellering van het plasmamembraan als reactie op chemoattractant en zijn interacties met de extracellulaire micro-omgeving. Hierin wordt een procedure beschreven op basis van intravitale subcellulaire microscopie om de dynamiek van membraanremodellering te onderzoeken bij neutrofielen die in het oor van verdoofde muizen worden geïnjecteerd.

Beeldvorming van neutrofielenmigratie in de huid van muizen om subcellulaire membraanremodellering onder fysiologische omstandigheden te onderzoeken

Dit protocol presenteert een methode voor het induceren van mesenteriale ischemie-reperfusieschade en het visualiseren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) in mesenteriale venulen met behulp van intravitale microscopie. De bloedstroom in de superieure mesenteriale slagader werd gedurende 1 uur beperkt, gevolgd door reperfusie, waardoor directe kwantificering van leukocytenadhesie en NETosis mogelijk was.

Visualisatie van extracellulaire neutrofiele vallen in mesenteriale venulen na mesenteriale ischemie-reperfusieschade via intravitale microscopie

Leer intravitaal confocale microscopie om neutrofielen en monocyten in mesenteriale venen van muizen te volgen onder rust- en ontstekingsomstandigheden. Deze methode onthult de dynamiek van immuuncellen in vivo.

Beeldvorming van neutrofielen en monocyten in Mesenteriale Veins door Intravitale Microscopie op verdoofd muizen in Real Time

Meer video's verkennen