Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Het algemene doel van dit experiment is om de relatieve tumorbelasting van intra-peritoneale ovariumkankermetastase in een syngene oorthotoop xenograft muismodel te bepalen. Deze nieuwe methode om relatieve tumorbelasting te beeldvormen en kwantificeren, kan ons helpen om belangrijke vragen te beantwoorden over de regulatie van ovariumkankermetastase. Het fundamentele voordeel van deze techniek is dat door het scheiden van fluorescente spectra, weefselautofluorescentie uit de beelden wordt verwijderd, waardoor de meting van gestandaardiseerde, relatieve tumorbelasting mogelijk wordt.

Deze techniek geeft inzichten in de humane ovariumkankermetastase met implicaties voor het monitoren van de effectiviteit van therapeutische behandelingen. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat we een robuuste beeldvormingstechniek koppelen aan een analytische procedure om kwantitatieve gegevens uit de beelden te extraheren. De procedure wordt vandaag gedemonstreerd door Yueying Liu, de laboratoriumprogrammamanager voor het Stack Lab.

Na 10 weken van tumorcelgroei, plaats het lichaam van elke geanesthetiseerde muis, een voor een, in een klein dier optisch beeldvormingssysteem. Scan alle muizen in de cohort bij elke tijdstip. Om fluorescent gelabelde tumorcellen te observeren, voer een multi-spectrale acquisitie uit om een totaal van vijf beelden te verzamelen.

Selecteer een standaardexpositie van 15 seconden, twee bij twee binning, een gezichtsveld van 16 centimeter, en een F-stop van 1.1. Vervolgens, verwerf een reflectiebeeld van het hele dier met behulp van wit licht van een open excitatiefilter, een open emissiefilter, een standaardexpositie van 0,2 seconden met twee bij twee binning, en een gezichtsveld van 16 centimeter, met een F-stop van 2.8. Na euthanasie, gebruik puntige dissectiescharen om de huid anterieure langs de ventrale middenlijn van de muis te snijden, van de bovenkant van de dijen tot de onderkant van het borstbeen.

Separeer voorzichtig de huid van het peritoneale weefsel, zorg ervoor de peritoneale wand niet te puncteren. Snijd vervolgens lateraal, zowel langs de onderkant van het borstbeen als de bovenkant van de dijen, om twee flapjes huid te creëren. Plaats de muis op zijn ventrale kant in de scanner, zodat de peritoneale holte naar beneden gericht is met de huidflapjes opengetrokken.

Scan de muis met zijn organen in situ, met behulp van dezelfde parameters die eerder voor de levende muis zijn gebruikt. Ga nu door met het dissekeren van de muis door de lever, het oment, de pancreas, de maag, het diafragma, en de kleine en grote darmen te extraheren met behulp van standaardtechnieken. Verwijder ook het linker en rechter peritoneum, de eierstokken, de nieren, het mesenterium en ten slotte, de vetlaag.

Observeer, tel en noteer elk van de zichtbare tumoren op de organen. Gebruik een calliper om de diameter van elke tumor te meten. Bestem tumoren die minder dan twee millimeter in diameter zijn als klein, tussen de twee en vijf millimeter als medium, en groter dan vijf millimeter als groot.

Plaats vervolgens de organen op de orgaanscansjabloon, te vinden in Figuur Vier van het bijbehorende tekstprotocol, en gebruik deze om de locatie van elk orgaan te organiseren tijdens de volgende scan. Gebruik PBS om de organen vochtig te houden. Scan elk vel orgaan met behulp van het kleine dier optische beeldvormingssysteem en de parameters die eerder zijn gebruikt.

Na het scannen, plaats de organen in 10% formaldehyde, en verwerk ze voor histologie met behulp van standaardtechnieken. Om de hoeveelheid autofluorescentie in elke multi-spectrale scan te verminderen, laad eerst het rode fluorescente eiwit in vivo spectrale bestand gevolgd door het auto floor in vivo rode bestand in het ongemengde beeldenvenster, en selecteer ontmenging. Exporteer vervolgens de dot bip bestanden in een 16 bit ongeschaalde dot tif-indeling, en laad ze in Image J, door naar bestand, openen te gaan, en vervolgens het juiste 16 bit dot tif-bestand te selecteren.

Ga vervolgens naar het beeldmenu, en selecteer aanpassen, dan helderheid contrast, en stel de minimale weergegeven waarde op nul, en de maximale weergegeven waarde op plus 35353. Vervolgens ga je weer onder het beeldmenu naar lookup tables, en selecteer rood heet. Verschillende diermodellen zullen verschillende helderheidsniveaus vereisen, maar het is belangrijk om de helderheid consistent te houden gedurende een bepaald onderzoek.

Gebruik het vrije handselectie-gereedschap om een vrije vorm gebied van interesse selectie rond elk orgaan te tekenen. De vrije vorm gebied van interesse moet dicht bij de orgaangrenzen worden getekend. Typ vervolgens control en M om het meetgereedschap te gebruiken om de oppervlakte van elk orgaan te berekenen.

Noteer deze gegevens in een spreadsheet. Met het gebied van interesse dat rond elk orgaan is getekend, klik met de rechtermuisknop en selecteer dupliceren om alleen het orgaan op te nemen. Ga vervolgens onder afbeelding naar aanpassen, dan drempel, en stel de onderste drempelwaarde in op plus 1.200 en de bovenste drempelwaarde op plus 1.700.

Controleer ook de donkere achtergrond, en selecteer dan oké. Dit zal alleen de meest fel fluorescerende gebieden selecteren. De afbeeldingen kunnen handmatige manipulatie van de drempelregelaars in Image J vereisen zodat de eerder felste gebieden worden geselecteerd voor de analyse stap, zoals hierboven getoond.

Verschillende ziektemodellen zullen verschillende drempelbeperkingen vereisen, maar het is belangrijk om de drempelniveaus consistent te houden gedurende een bepaald onderzoek. Onder analyseer, selecteer analyseer deeltjes, en verander de grootte van het pixelkwadraat naar 10 tot oneindig. Kies om omtrekken weer te geven, en selecteer alleen resultaat weergeven, en klik dan op oké.

Dit zal zowel de gebieden als de ruwe geïntegreerde dichtheden van de felle gebieden die als tumoren worden beschouwd meten. Noteer de waarden van de oppervlakte en de ruwe geïntegreerde dichtheid van elke tumorselectie samen in dezelfde spreadsheet die de orgaanoppervlaktes bevat. Ga vervolgens onder analyseer, selecteer gereedschappen, en ga naar kalibratiebalk.

Voeg een kalibratieschaalbalk toe aan de afbeeldingen van de organen. Montages kunnen