Identificatie van Metal Oxide Nanodeeltjes in histologische monsters door Enhanced Darkfield Microscopie en hyperspectrale Mapping

Het algemene doel van deze procedure is om metaaloxide-nanodeeltjes in histologische monsters te identificeren door middel van donkerveldmicroscopie en hyperspectrale mapping. Dit wordt bereikt door eerst een gebied van belang in een positieve controlemonster dat nanodeeltjes bevat te identificeren en een donkerveldbeeld vast te leggen. De tweede stap is om een hyperspectrale afbeelding of datacube van het gebied van belang te maken met behulp van de hyperspectrale camera.

Vervolgens wordt een referentiespectrumbibliotheek gemaakt vanuit de datacube van de positieve controle, die wordt gefilterd tegen een negatieve controle om eventuele valse positieven te verwijderen. De laatste stap is om de referentiespectrumbibliotheek te gebruiken om te vergelijken met experimentele monsters om nanodeeltjes van dezelfde samenstelling te identificeren en te lokaliseren. Uiteindelijk worden verbeterde donkerveldmicroscopie en hyperspectrale mapping gebruikt om metaaloxide-nanodeeltjes in histologische monsters te identificeren op een snellere en minder middelenverslindende manier dan andere technieken zoals elektronenmicroscopie.

Deze methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van conventionele nanomateriaalbeeldvorming en karakteriseringstechnieken zoals elektronenmicroscopie. Het monstervoorbereidingsproces is typisch minimaal en niet-destructief. Beeldvorming en analyse zijn minder tijd- en kostenintensief, en het kan worden toegepast voor nanodeeltjesbeeldvorming in een verscheidenheid van matrices.

Personen die de methodologie kennen, weten soms dat het lastig kan zijn omdat het maken van de juiste positieve controlemonsters en referentiespectrumbibliotheken zowel uitdagend als tijdrovend is. Maar zodra die eerste stappen zijn voltooid, kunnen experimentele monsters vrij snel worden beoordeeld. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de cutane penetratie van nanodeeltjes, kan deze ook worden toegepast op andere biologische monsters zoals bronchoalveolaire lavage en bloeduitstrijkjes, evenals niet-biologische monsters, zoals filters die worden gebruikt bij beroepsmatige blootstellingsbeoordelingen.

Het demonstreren van deze techniek zal Plar Sosa zijn, een medische student uit mijn laboratorium Begin door de lichtbron, de stagesturing, de optische camera, de hyperspectrale camera en het computersysteem aan te sluiten en in te schakelen. Vervolgens wordt de stage en de condensor naar de werkpositie gebracht en worden zorgvuldig drie tot vijf druppels Type A-immersieolie op de condensorlens aangebracht. Als er luchtbellen ontstaan, veegt u de olie weg en brengt u deze opnieuw aan op de lens.

Vervolgens wordt het monster op de stage geplaatst en wordt de condensor langzaam verhoogd totdat het immersieolie contact maakt met de onderkant van de dia. Dit zal merkbaar zijn door de snel oplichtende verlichtingsring waar het olie contact maakt met de dia. Met de condensor op zijn plaats, schakelt u over naar de 10 x objectief en focust en richt u de condensor vervolgens uit om de helderheid te maximaliseren indien nodig, stelt u de condensoruitlijningsknoppen in om het heldere punt te centreren.

Open de optische beeldvormingssoftware. Focus het monster met behulp van de fijne objectieffocusknop. Zoek vervolgens een gebied van belang.

Stel de condensorfocus indien nodig aan om de verlichting in evenwicht te brengen. Klik op het instellingentabblad in de menubalk en klik op de knop afbeelding vastleggen. Voor het vastleggen van een gebeurtenis.

Selecteer het gewenste afbeeldingsformaat en wijs een bestandsnaam toe aan de afbeelding. Selecteer bovendien de standaard time lapse-waarde en klik ten slotte op OK. Ga vervolgens naar het expositiemenu en selecteer de expositie-instellingen die het hoogste contrastafbeelding creëren.

Hier is het niveau ingesteld op 0,0% De versterking is ingesteld op 2,8 decibel en de sluitertijd is ingesteld op 56 milliseconden. Leg de afbeelding vast door op de afbeeldingsknop in de menubalk te klikken. Verander het objectief naar 40 x en 100 x.

Bij het vastleggen van afbeeldingen op hogere vergroting, zorg ervoor dat de lichtgeleider is gericht op de hyperspectrale camera en open vervolgens de hyperspectrale beeldvormingssoftware voor het verkrijgen van de HSI-datacubes in de software open hyperspectrale microscoop in de menubalk en selecteer HSI microscoopbediening. Hier stelt u de objectiefvergroting en de veilige pad in. Verander vervolgens de gebiedsopname in de instellingen en verander het aantal lijnen.

In deze studie hebben we 720 ingesteld voor de belichtingstijd. Hier hebben we 0,25 seconden gebruikt. Laat alles anders standaard en klik op HSI-voorbeeld om de afbeelding te bekijken.

Bekijk de resulterende intensiteitsgrafiek die de intensiteit van de hoogste golflengte vertegenwoordigt terwijl de gebruiker over de x-as van het centrum van het veld van de camera beweegt. Beweeg de cursor om een ​​nauwkeurige omtrek van de grafiek te genereren. Dit zal ervoor zorgen dat een numerieke intensiteitsindicator aan de linkerkant verschijnt.

Focus de afbeelding op basis van deze voorbeeldweergave door de fijne objectieffocus aan te passen om de pieken in deze afbeelding te verscherpen. Optimaliseer vervolgens de lichtintensiteit door de bronhelderheid te veranderen, de condensorfocus aan te passen of de voorbeeldweergave te annuleren en de belichtingstijd in de software aan te passen. Klik op vastleggen en observeer terwijl er vier nieuwe vensters met de beschikbare namen verschijnen.

Bandenlijst. Nummer een zoom. Nummer een, scroll en nummer een RGB-band verschijnen.

Maximeer het nummer een RGB-bandvenster omdat dit de datacube is die voor alle toekomstige verwijzingen zal worden gebruikt. Rechts? Klik op deze datacube, sla deze op als een tiff-bestand en klik op OK. Klik met de rechtermuisknop in het datacube-afbeeldingsvenster en klik met de linkermuisknop op Z-profielspectrum.

Wanneer het pop-upvenster met het spectrale profiel verschijnt, klik dan op de pixels van belang op de datacube-doel. De helderste zijn degenen die met vertrouwen kunnen worden geïdentificeerd als het materiaal van belang. Selecteer onder het deeltje-analysemenu de deeltje-filtertool om de deeltjes die aanwezig zijn in de datacube te identificeren.

In het nieuwe pop-upvenster set, moet de spectrale max de waarde overschrijden, zodat deze hog