Name: Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Leer hoe je een transgen muismodel gebruikt voor inductieve expressie van EGFP-KASH2 in cerebellaire Purkinje-cellen. Deze methode verstoort LINC-complexen en onderzoekt nucleaire positionering in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs danken het personeel van de morfologie en Imaging kern van de Moleculaire Genetica kern (afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences) en van de Muis Genetica Core aan de Washington University in St. Louis School of Medicine. De auteurs worden ondersteund door de kleine subsidieprogramma van de McDonnell Centrum voor Cellulaire en Moleculaire Neurobiologie, de Hoop Centrum voor Neurologische Aandoeningen, de National Eye Institute (# R01EY022632 naar DH), een Nationaal Instituut Eye Center Core Grant (# P30EY002687) en een onbeperkte subsidie ​​van Onderzoek naar blindheid te voorkomen dat de afdeling Oogheelkunde en Visual Sciences.

Ethiek Verklaring: Procedure waarbij proefdieren werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Washington University in St. Louis. 1. Mouse Fokkerij en Genotyping <ol><li> Broeden Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muizen met Tg (PCP2-Cre) muizen om Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20 produceren. Opmerking: Terwijl de rest van dit protocol is gericht op het gebruik van de Tg (PCP2-Cre) muizenlijn binnen het cerebellum EGFP-KASH2 expressie Purkinje cellen te beperken, kan een soortgelijke procedure gevolgd met andere Tg (Cre) muis ( Figuur 2A). </li><li> Voeren genotypering om pups herbergen zowel EGFP en Cre transgenen zoals eerder beschreven 19 te identificeren. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Materialen voor Dissection en Tissue Collection <ol><li> Bereid 100 ml 30% sucrose in PBS (30 g sucrose / 100 ml 1x PBS) en bewaar bij -20 ° C. De dag van weefsel harvesting, ontdooien en load ~ 30-35 ml van sucrose oplossing in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies. </li><li> Maak 40 ml van 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldehyde en 30 ml PBS). Load ~ 30-35 ml van 4% PFA in een 35 ml spuit voor transcardial perfusies. </li><li> Vul een 10 cm weefsel kweekplaat met 10 ml PBS weefseldissectie. </li><li> Bereid een ketamine / xylazine cocktail bestaande uit 16 mg / ml ketamine en 3 mg / ml xylazine. </li><li> Bereid een oplossing van 70% ethanol voor de dissectie. </li></ol> 3. Dissection en Tissue Collection <ol><li> Met behulp van een injectiespuit 1 ml, injecteer 500 ul van ketamine / xylazine cocktail per 25 gram lichaamsgewicht en wacht ~ 15 min. U kunt ook gebruik maken van een ander institutioneel goedgekeurd sedatie methode die geschikt is voor het biologische systeem van belang is. </li><li> Bij sedatie, zacht knijpen de achterpoot van het ontbreken van pijnreactie bevestigen pin alle poten op piepschuim lade met de dorsale zijde van demuis naar beneden. </li><li> Spuit de buik met 70% ethanol en een insnijding van de onderbuik naar de top van de ribbenkast voor de toegang tot het hart te krijgen. </li><li> Maak een kleine incisie in het rechter atrium van het hart en plaats de spuit met de 30% sucrose oplossing in het linkerventrikel van het hart. </li><li> Perfuseren de oplossing bij een snelheid van ~ 2-5 ml per minuut. Wanneer leeg, verwijder de spuit en herhaal met de 4% PFA-oplossing. </li><li> Losmaken van de muis van het piepschuim lade en onthoofden toegang tot de hersenen. </li><li> Verwijder de huid rond de kop van het dier met behulp van pincet en een schaar. Porren een gat in het achterste deel van de schedel met een naald en verwijder voorzichtig de schedel met een schaar en ontleden tang. </li><li> Zodra de hersenen duidelijk toegankelijk, een tang om het cerebellum te verwijderen en deze in PBS. Bisect het cerebellum in het sagittale vlak met een scalpel en overbrengen naar de 30% sucrose oplossing overnacht bij 4 ° C. Opmerking: Om prepzijn paraffinecoupes, bevestig het cerebellum overnacht bij 4 ° C in 4% PFA vóór tissue inbedding en snijden. </li></ol> 4. Tissue Verwerking en Sectioning <ol><li> Bereid een suspensie van droog ijs en 2-methyl- butaan. Laat de temperatuur van het bad equilibreren 5 min. </li><li> Vul een cryomold met oktober verbinding en zet de helft van de doorgesneden cerebellum in de mal. </li><li> Met behulp van een dissectiemicroscoop en een pincet standpunt van de kleine hersenen zodat de doorgesneden oppervlak (nabij de middellijn van het cerebellum) naar boven. </li><li> Breng de cryomold om het droogijs slurry gedurende 5 minuten tot de verbinding oktober een stevige witte matrix rond het weefsel specimen heeft gevormd. Opmerking: Het bevroren monster kan nu worden opgeslagen bij -20 ° C indien nodig. </li><li> Label voorbehandeld poly-lysine dia&#39;s voor het verzamelen van weefsel secties en de voorbereiding van de cryostaat volgens de instructies van de fabrikant om 15 micrometer secties van de cere verzamelenbellum. Om de secties verzamelen, voorzichtig contact opnemen met de afdeling oktober met de poly-lysine gecoate zijde van de dia. Om de oriëntatie van de punt te bewaren, moet de schuif tijdens deze stap niet roteren. </li><li> WINKEL weefselcoupes bij -20 ° C tot verder gaat met kleuring en beeldvorming. </li></ol> 5. kleuring en beeldvorming van kleine hersenen secties <ol><li> Bereid de volgende oplossingen vóór weefselkleuring: ~ 50 ml PBS ~ 5-10 ml van 4% PFA in PBS ~ 10-20 ml 0,5% Triton X-100, 10% donkey serum in PBS </li><li> Dooi cerebellaire secties. Belangrijker nog, het minimaliseren van hun blootstelling aan een bron van voortdurende en intens licht te vervagen van EGFP voorkomen. </li><li> Met behulp van een hydrofobe barrière pen, trek een rechthoek rond het weefsel secties. </li><li> Post-fix de secties met 4% PFA gedurende 5 min. Gebruik voldoende vloeistof om het hele gebied afgebakend door de hydrofobe barrière (meestal ~ 500 pi) te dekken. Met behulp van een vacuüm of pipet, reBeweeg de fixerende is bijzonder voorzichtig het weefsel secties niet te verstoren. </li><li> Met een pipet voorzichtig toepassing PBS op de dia zonder verstoring van het weefsel secties. Na 5 min met de stofzuiger of pipet om de vloeistof voorzichtig verwijderen. Herhaal de PBS spoelen in totaal drie keer. </li><li> Met behulp van een pipet voorzichtig toepassing van de juiste verdunning van primaire antilichamen (3 ul Calbindin en / of Nesprin2 antilichaam per 900 ul oplossing) in 0,5% Triton X-100, 10% ezel serum in PBS. Incubeer gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker. Opmerking: EGFP-KASH2 zichtbaar door directe fluorescentie microscopie op bevroren secties, en het is niet nodig om een ​​anti-EGFP-antilichaam te gebruiken. Indien paraffine secties zijn opgesteld, beeldvorming van EGFP-KASH2 vereist immunodetectie met een anti-EGFP-antilichaam. </li><li> Verwijder de antilichaam-oplossing en spoelen met PBS driemaal. </li><li> Bereid 1: 1000 verdunningen van Alexa-Fluor secundaire antilichamen in 0,5% Triton X-100,10% ezel serum in PBS en op te slaan in het donker. </li><li> Verwijder voorzichtig de laatste PBS spoelen en toepassen van de secundaire antilichaam verdunning gedurende een uur in het donker. </li><li> Verwijder de tweede antilichaam oplossing, spoelen en wassen de sectie drie keer. Indien nodig, breng dan een nucleaire vlek, zoals DAPI (~ 300 nM) gedurende de eerste PBS toepassing. </li><li> Volledig te verwijderen van de PBS-oplossing uit de hele weefsel en plaats ~ 5-7 ul van montage media op de sectie weefsel. Plaats een glazen dekglaasje bovenop de weefselsectie en gereserveerd voor ~ 15-30 min bij kamertemperatuur in het donker. </li><li> Gebruik een fluorescentiemicroscoop uitgerust met de juiste filters voor EGFP en andere golflengten geschikt voor het secundaire antilichamen die in stappen 5,8 / 5,9 visualiseren. In cerebellaire plakjes, gebruik dan een 20X doelstelling EGFP-KASH2 nucleaire velgen bekijken. </li></ol>

<ol><li>Hutchison, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamins%3A+building+blocks+or+regulators+of+gene+expression%3F+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).</li>
<li>Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+lamins%3A+their+structure%2C+assembly%2C+and+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions.</a> Journal of structural biology. 122, 42-66 (1998).</li>
<li>Crisp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+the+nucleus+and+cytoplasm%3A+role+of+the+LINC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex.</a> The Journal of cell biology. 172, 41-53 (2006).</li>
<li>Haque, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1+interacts+with+nuclear+lamin+A+and+cytoplasmic+nesprins+to+provide+a+physical+connection+between+the+nuclear+lamina+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">SUN1 interacts with nuclear lamin A and cytoplasmic nesprins to provide a physical connection between the nuclear lamina and the cytoskeleton.</a> Molecular and cellular biology. 26, 3738-3751 (2006).</li>
<li>Hodzic, D. M., Yeater, D. B., Bengtsson, L., Otto, H., Stahl, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sun2+is+a+novel+mammalian+inner+nuclear+membrane+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Sun2 is a novel mammalian inner nuclear membrane protein.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 25805-25812 (2004).</li>
<li>Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+and+SUN+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology+%3A+CB%22%5BJournal%5D)">KASH and SUN proteins.</a> Current biology : CB. 21, R414-R415 (2011).</li>
<li>Mellad, J. A., Warren, D. T., Shanahan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+LINC+the+nucleus+and+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Nesprins LINC the nucleus and cytoskeleton.</a> Current opinion in cell biology. 23, 47-54 (2011).</li>
<li>Fridolfsson, H. N., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+and+dynein+at+the+nuclear+envelope+mediate+the+bidirectional+migrations+of+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 and dynein at the nuclear envelope mediate the bidirectional migrations of nuclei.</a> The Journal of cell biology. 191, 115-128 (2010).</li>
<li>Meyerzon, M., Fridolfsson, H. N., Ly, N., McNally, F. J., Starr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-83+is+a+nuclear-specific+cargo+adaptor+for+kinesin-1-mediated+nuclear+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">UNC-83 is a nuclear-specific cargo adaptor for kinesin-1-mediated nuclear migration.</a> Development. 136, 2725-2733 (2009).</li>
<li>Padmakumar, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enaptin%2C+a+giant+actin-binding+protein%2C+is+an+element+of+the+nuclear+membrane+and+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Enaptin, a giant actin-binding protein, is an element of the nuclear membrane and the actin cytoskeleton.</a> Experimental cell research. 295, 330-339 (2004).</li>
<li>Roux, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+4+is+an+outer+nuclear+membrane+protein+that+can+induce+kinesin-mediated+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nesprin 4 is an outer nuclear membrane protein that can induce kinesin-mediated cell polarization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 2194-2199 (2009).</li>
<li>Wilhelmsen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+outer+nuclear+membrane+protein%2C+associates+with+the+cytoskeletal+linker+protein+plectin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">a novel outer nuclear membrane protein, associates with the cytoskeletal linker protein plectin.</a> The Journal of cell biology. 171, 799-810 (2005).</li>
<li>Wilson, M. H., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprins+anchor+kinesin-1+motors+to+the+nucleus+to+drive+nuclear+distribution+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nesprins anchor kinesin-1 motors to the nucleus to drive nuclear distribution in muscle cells.</a> Development. 142, 218-228 (2015).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KASH+protein+Syne-2%2FNesprin-2+and+SUN+proteins+SUN1%2F2+mediate+nuclear+migration+during+mammalian+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">KASH protein Syne-2/Nesprin-2 and SUN proteins SUN1/2 mediate nuclear migration during mammalian retinal development.</a> Human molecular genetics. 20, 1061-1073 (2011).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syne-1+and+Syne-2+play+crucial+roles+in+myonuclear+anchorage+and+motor+neuron+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Syne-1 and Syne-2 play crucial roles in myonuclear anchorage and motor neuron innervation.</a> Development. 134, 901-908 (2007).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nesprin+1+is+critical+for+nuclear+positioning+and+anchorage%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Nesprin 1 is critical for nuclear positioning and anchorage.</a> Human molecular genetics. 19, 329-341 (2010).</li>
<li>Stewart-Hutchinson, P. J., Hale, C. M., Wirtz, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+assembly+of+LINC+complexes+and+their+function+in+cellular+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the assembly of LINC complexes and their function in cellular mechanical stiffness.</a> Experimental cell research. 314, 1892-1905 (2008).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUN1%2F2+and+Syne%2FNesprin-1%2F2+complexes+connect+centrosome+to+the+nucleus+during+neurogenesis+and+neuronal+migration+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SUN1/2 and Syne/Nesprin-1/2 complexes connect centrosome to the nucleus during neurogenesis and neuronal migration in mice.</a> Neuron. 64, 173-187 (2009).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+tissue-specific+disruption+of+LINC+complexes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Temporal and tissue-specific disruption of LINC complexes in vivo.</a> Genesis. 52, 359-365 (2014).</li>
<li>Razafsky, D., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+Nesprin1+giant+devoid+of+KASH+domain+underlies+the+molecular+etiology+of+autosomal+recessive+cerebellar+ataxia+type+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">A variant of Nesprin1 giant devoid of KASH domain underlies the molecular etiology of autosomal recessive cerebellar ataxia type I.</a> Neurobiology of disease. 78, 57-67 (2015).</li>
<li>Razafsky, D., Blecher, N., Markov, A., Stewart-Hutchinson, P. J., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINC+complexes+mediate+the+positioning+of+cone+photoreceptor+nuclei+in+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">LINC complexes mediate the positioning of cone photoreceptor nuclei in mouse retina.</a> PloS one. 7, e47180(2012).</li>
<li>Razafsky, D. S., Ward, C. L., Kolb, T., Hodzic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+linkers+of+the+nucleoskeleton+to+the+cytoskeleton+during+mouse+postnatal+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of linkers of the nucleoskeleton to the cytoskeleton during mouse postnatal retinogenesis.</a> Nucleus. 4, 399-409 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De meest kritische stap om met succes de studie van de rol van LINC complexen in vivo met behulp van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) model is om een geschikte Cre muis regel (s) te identificeren. Inderdaad, als Cre actief in andere celtypes zijn betrokken bij soortgelijke trajecten, kan de interpretatie van de resultaten bemoeilijkt. Daarom is het belangrijk om nabijgelegen cellen te onderzoeken, zoals hier in de moleculaire en granulaat cellagen van het cerebellum (Figuur 2B). Ook elke fysiologi...

De nucleaire enveloppe (NE) scheidt de nucleoplasma van het cytoplasma. Het bestaat uit een binnenste en buitenste kernmembraan (INM en ONM, respectievelijk) die aansluiten op kernporiën. De lumen afgebakend door beide membranen heet de perinucleaire ruimte (PNS). De ONM is een uitbreiding van het ruwe endoplasmatisch reticulum (ER) en de INM hecht aan de nucleaire lamina, een maaswerk van nucleaire type V intermediaire filamenten vertegenwoordigers A- en B-type lamins 1,2. Linkers van het Nucleoskeleton cytoskelet (LINC) complexen macromoleculaire samenstellingen die de gehele kern envelop overspannen fysiek het inwendige van de kern verbinden met cytoskelet filamenten en moleculaire motoren (figuur 1A). Ze bestaan ​​uit interacties tussen evolutionair geconserveerde motieven die twee families van integrale transmembraaneiwitten van de NE karakteriseren: Zon (Sad1 / Unc84) eiwitten en Nesprins (Nuclear Envelope SPectRINS). Bij zoogdieren, sun1 en Sun2 are transmembraaneiwitten van de INM waarvan N-terminale gebied nucleoplasmatische interageert direct met A- en B-type lamins 3-5. Aan de andere kant van de INM binnen de PNS, Zon eiwitten haven een evolutionair geconserveerde gedeelte van ~ 150 C-terminale aminozuren genoemd SUN domein. SUN domeinen interactie rechtstreeks met de evolutionaire-geconserveerde KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne homologie) domein, de moleculaire ondertekening van Nesprins. KASH domeinen bestaan ​​uit een stuk ~ 30 C-terminale aminozuren die uitsteekt in het PZS, gevolgd door een transmembraandomein 6. Ten minste vier verschillende Nesprin genen (Nesprin1-4) coderen KASH bevattende eiwitten die lokaliseren op de NE 7. De cytoplasmatische regio Nesprins, waarvan de afmetingen variëren van ~ 50 kDa (Nesprin4) een verbazingwekkende 1000 kDa (Nesprin1 reus), bevatten meerdere spectrin herhaald en specifieke motieven waarmee de interactie met cytoskelet componenten zoals actine, plectine en moleculaire motoren 8- 13. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Studies bij gewervelde en ongewervelde dieren hebben aangetoond dat Lamin / Zon / Nesprin / moleculaire motoren vormen een evolutionair geconserveerd &quot;as&quot; beheersen van nucleaire migratie en verankering. Verschillende knock-out (KO) muismodellen van LINC complexe componenten zijn beschreven en waren instrumentaal in een kader om de rol van de Zon en Nesprin eiwitten in het NE begrijpen tijdens zoogdieren ontwikkeling 9,14,15. Echter, deze modellen huidige aantal belangrijke nadelen, met name: 1) moeilijkheden bij de interpretatie fenotypes als gevolg van niet-autonome effecten, 2) moeilijkheden cel onderscheiden de fenotypische bijdragen van KASH bevattende vs. KASH-less Nesprin isovormen 16, 3) het functionele redundantie van Sun en Nesprin eiwitten in het NE in talrijke celtypen vereist complexe fokprogramma&#39;s om alle SUN-KASH interacties in muizen 17 en 4) van de perinatale sterfte van muizen deficiënt voor de KASH-domein van zowel inactiverenNesprins1 en 2 zich verzet tegen de analyse van de volwassen fenotypen 18. Dit protocol beschrijft een nieuw muismodel ontworpen om alle SUN-KASH interacties in vivo te verstoren, in een cel autonome ontwikkeling gereguleerde wijze, zonder daarbij veel van de bovengenoemde nadelen. Dit Cre /-lox gebaseerde muismodel voert twee begrippen: 1) de KASH domein van elke bekende Nesprin eiwit is voldoende om EGFP richten op NO in celkweeksystemen en 2) SUN domeinen wisselwerking promiscuously met KASH domeinen, waardoor overexpressie van elke KASH domein alle endogene SUN domeinen verzadigen en inactiveren LINC complexen in een dominant-negatieve manier 17 (Figuur 1B). Dit protocol beschrijft weefsel oogsten en verwerken stappen gebruikt om de verstoring van SUN-KASH interacties in cerebellaire Purkinje cellen bevestigen.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde-oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Adhesieglazen</td><td>StatLab</td><td>M1000W</td><td></td></tr><tr><td>Ezelserum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>ImmuEdge Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Calbindin Antilichaam</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9848</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EGFP Antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Nesprin2 Antilichaam</td><td></td><td></td><td>Voorgaf in Ref. 21</td></tr><tr><td>Fluorescente Montage Media</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>2-methyl butaan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O3551</td><td></td></tr></tbody></table>

validatie van een muismodel voor linc complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Kernmigratie en verankering in zich ontwikkelende en volwassen weefsels is sterk afhankelijk van grote macromoleculaire eiwitassemblages die LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexen) worden genoemd. Deze eiwitschalen overspannen de kernmembraan en verbinden het binnenste van de kern met componenten van het omringende cytoplasmatische cytoskelet. LINC complexen bestaan uit twee evolutionair geconserveerde eiwitfamilies, Sun eiwitten en Nesprins die C-terminale moleculaire signaalsequenties hebben die de SUN en KASH domeinen worden genoemd, respectievelijk. Sun eiwitten zijn transmembraan eiwitten van de binnenste kernmembraan waarvan het N-terminale nucleoplasmatische domein interactie heeft met de kernlamina terwijl hun C-terminale SUN domeinen uitsteken in de perinucleaire ruimte en interactie hebben met het KASH domein van Nesprins. Canonieke Nesprin isoformen hebben een variabel gedimensioneerde N-terminus die zich in het cytoplasma projecteert en interactie heeft met componenten van het cytoskelet. Dit protocol beschrijft de validatie van een dominant-negatieve transgene muisstrategie die endogene SUN/KASH interacties verstoort op een celtype-specifieke manier. Onze aanpak is gebaseerd op het Cre/Lox systeem dat veel nadelen omzeilt zoals perinatale letaliteit en cel niet-autonome fenomenen die geassocieerd zijn met germinale modellen van LINC complex inactivatie. Om deze reden biedt dit model een nuttig hulpmiddel om de rol van LINC complexen te begrijpen tijdens ontwikkeling en homeostase in een breed scala aan weefsels.

Dit protocol illustreert de bruikbaarheid van de Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) muismodel voor EGFP-expressie KASH2 cerebellaire Purkinje-cellen middels Tg (PCP2-Cre) muizen beperken. In Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) nakomelingen, het LacZ / V5 open leeskader wordt uitgesneden op P6 door het Cre recombinase hetgeen leidt tot de expressie van EGFP-KASH2 specifiek gericht op Purkinje cellen (Figuur 2A). Zoals verwacht, wordt EGFP-KASH2 gericht op de nucleaire enveloppe aangegeven door de EGFP-posit...

Kernmembraaneiwitten spelen een centrale rol in veel fundamentele biologische processen en zijn betrokken geweest bij een verscheidenheid aan menselijke ziekten. Dit protocol beschrijft een nieuw Cre/Lox-gebaseerd muismodel dat de ruimtelijk-tijdelijke controle van LINC-complexen-verstoring mogelijk maakt.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Het algemene doel van dit experiment is om het nut van een transgeen muismodel te illustreren, waarmee de induceerbare en gerichte expressie van een fluorescentie-gelabelde EGFP cache, two peptide in vivo, en de daaruit voortvloeiende verstoring van endogene link-complexen mogelijk is. In dit experiment zal de expressie van fluorescentie-gelabelde cache two gericht worden op cerebellaire Purkinje-cellen. Deze genetische benadering kan cruciale vragen beantwoorden over de rol van link-complexen bij de nucleaire positionering binnen verschillende weefsels van de muis.De induceerbare en gerichte expressie van E-G-F-P-K twee biedt verschillende voordelen. Ten eerste is er slechts één kruidingsschema met elke bestaande muizenstam nodig. Ten tweede omzeilt deze benadering de perinatale letaliteit die wordt waargenomen in muismodellen met kiembaanmutaties van componenten van het linkcomplex.Ten slotte maakt deze methode het mogelijk om de fysiologie van linkcomplexen binnen specifieke cellen of weefsels in vivo te bestuderen. Chloe Potter, een lid van het lab, zal u de verschillende stappen laten zien die nodig zijn om E-G-F-P-K twee te visualiseren in Purkinje-cellen van het cerebellum.Kruis clac Z-muizen met PCP twee CRE-muizen om PCP twee CAG C twee-muizen te produceren, zoals beschreven in eerdere publicaties. Voer genotypering uit zodra de resulterende pups zijn geboren. Om diegenen te identificeren die zowel de EGFP- als de Cree-transgenen dragen zoals eerder beschreven, bereid 50 milliliters van een 30% sucrose-oplossing in PBS voor en bewaar deze bij -20 °C tot de dag van weefselwinning op de juiste leeftijd. Voer een transcardiale perfusie van de muizen onder anesthesie uit om het hersenweefsel voor dissectie voor te bereiden zoals beschreven in het schriftelijke protocol. Plaats de gedissecteerde hersenen in een 10 centimeter weefselkweekplaat met 10 milliliters PBS en scheid het cerebellum van de cerebra.Gebruik vervolgens een scalpel om het cerebellum in het sagittale vlak te ontleden, breng de secties over naar een 30% sucrose-oplossing en bewaar deze gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Bereid een mengsel van droogijs en 2-methylbutaan voor. Laat de temperatuur van het bad vijf minuten lang equilibreren.Vul vervolgens een cryovorm met OCT-compound en plaats een helft van het gedissecteerde cerebellum in de vorm met behulp van een dissectiemicroscoop en een pincet. Positioneer het cerebellum zodanig dat het bisectieoppervlak dat zich dicht bij de middellijn van het cerebellum bevindt, in de vorm naar boven is gericht. Plaats de cryovorm vervolgens gedurende vijf minuten in de droge oog-slurry totdat het OCT-compound een solide witte matrix rond het weefselmonster heeft gevormd.Bewaar het ingebedde preparaat bij -20 °C tot gebruik. Label de voorbehandelde polylysine-dia's voor het verzamelen van weefselcoupes en monteer het blok cerebellair weefsel op de weefselhouder met verse OCT. Zodra het blok stevig is bevestigd, monteert u de weefselhouder en schaaft u plakjes van 40 µm af om overtollig OCT te verwijderen totdat het weefsel is bereikt.Stel de dikte in op 15 µm en verzamel de coupes door de OCT-sectie voorzichtig in contact te brengen met de met polylysine gecoate zijde van de objectglas. Bewaar de weefselcoupes bij -20 °C tot aan het kleuren en imageren. Wanneer u wilt doorgaan, ontdooi dan de cerebellaire coupes in het donker om vervaging van de fluorescerende eiwitten te voorkomen.Teken met een hydrofobe barrièrepen een rechthoek rondom de rand van de weefselcoupes. Voeg ongeveer 500 microliters 4% paraformaldehyde toe aan de coupes gedurende vijf minuten om het weefsel na te fixeren. Gebruik vervolgens een vacuümsysteem om het fixatief weg te zuigen, waarbij u er bijzonder goed op let dat de weefselcoupes niet met een pipette worden verstoord.Breng voorzichtig PBS aan op het objectglas zonder de weefselcoupes te verstoren. Gebruik na vijf minuten een vacuümpipet om de vloeistof zorgvuldig te verwijderen en herhaal het spoelen met PBS in totaal drie keer. Voeg vervolgens ongeveer 500 microliter blokkeersolutie toe aan de objectglazen en incubeer deze gedurende 10 minuten.Verwijder de blokkeringsoplossing en vervang deze door dezelfde oplossing die een verdunning van 1:300 bevat van ofwel cal binding- of nesin two-antilichamen. Verwijder vervolgens de antilichaamoplossing en spoel de coupes 3 keer af met PBS. Incubeer de coupes gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker.Bereid vervolgens een verdunning van 1:1000 van anti-US Alexa Fluor 594 voor de slides gelabeld voor cow-binding en anti-Alexa Fluor 594 voor de slides gelabeld voor Nesprin 2 in de blokkeringsoplossing, en bewaar de oplossingen in het donker tot ze nodig zijn. Verwijder voorzichtig de laatste PBS-spoeling en bedek de secties met de verdunde secundaire antilichamen gedurende één uur in het donker. Verwijder na de incubatie de oplossing van het secundaire antilichaam.Breng vervolgens een kernkleuring aan, zoals DPI in een concentratie van 300 nanomolar in PBS gedurende vijf minuten. Spoel de coupes daarna nog tweemaal met PBS. Verwijder zoveel mogelijk PBS-oplossing en bedek de weefselcoupe met één druppel monteermedium.Plaats een glazen dekglas op de weefselcoupe, vermijd luchtbellen en laat dit 15 tot 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker staan. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om de antilichaamkleuring en fluorescerende eiwitten te visualiseren. Gebruik voor cerebellaire coupes een 20 x of 40 x objectief.Om de twee nucleaire randen van E-G-F-P-C twee te bekijken zoals hier getoond, kan E-G-F-P-C twee direct worden gevisualiseerd in cerebellaire coupes in het Fitzy-kanaal. Bovendien bevestigt de colokalisatie van EGFP met cow-binding, dat specifiek Purkinje-cellen labelt, dat de expressie van E-G-F-P-C twee beperkt is tot Purkinje-cellen binnen Purkinje-cellen. EGFP cache twee is gericht op de kernenvelop, zoals aangegeven door de EGFP-positieve randachtige patronen die rond de nucleus worden waargenomen.In dit voorbeeld werd de expressie van EGFP-KASH2 gedetecteerd in meer dan 70% van de cow-binding positieve Perkin-cellen. EGFP-KASH2 verdringt endogene nesprine van de kernenvelop door verzadiging van de beschikbare SUN-domeinen. Bijgevolg wordt endogene NESPRIN-2 verdrongen van de kernenvelop van Perkin-cellen die EGFP-KASH2 tot expressie brengen.Terwijl Perkin-cellen die geen E-G-F-P-C twee tot expressie brengen, endogene nesin twee behouden aan de kernenveloppe zoals verwacht bij de controlegroep, vertonen cellen die geen CRE-recombinase tot expressie brengen NESIN twee aan de kernenveloppe van de gehele bikini-celpopulatie één. Daarom zijn CT-blokken van weefsels beschikbaar. E-G-F-P-K twee kan in ongeveer vier uur worden gevisualiseerd.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de mate van PFF-fixatie en/of de insluitingscondities de antigeniciteit van uw epitoop drastisch kunnen beïnvloeden. Het is daarom zeer belangrijk om de optimale fixatiecondities te bepalen die uw specifieke epitoop behouden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe het CK two transgene muismodel kan worden gebruikt om de expressie van VGFP cashew op specifieke weefsels te richten.

validation-mouse-model-to-disrupt-linc-complexes-cell-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

This video describes a procedure for target gene knockout using a tamoxifen-inducible Cre-recombinase system following intraperitoneal injection of tamoxifen in a mouse model.

CreER-LoxP System-Based Target Gene Inactivation: A Tamoxifen-Inducible Cre Recombinase System for Target Gene Knockout in a Mouse Model

This video demonstrates the generation of a focal demyelination mouse model using a two-point Lysophosphatidylcholine (LPC) injection. The skull of an anesthetized mouse is exposed. The injection coordinates are determined, and a hole is drilled to enable LPC injections at targeted sites. LPC induces focal demyelination of neurons via inflammation, while a two-point injection ensures its sustainability.

Establishing a Focal Demyelination Mouse Model via a Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine

MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te...

Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Designer nucleasen zoals zinkvinger nucleasen (ZFNs) en transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) kan worden gebruikt om het genoom van de muis implantatie embryo's wijzigt activeren zowel de homologe eind mee (NHEJ) en homologe recombinatie (HR) wegen. Deze voorschotten in staat de snelle generatie van muizen met precieze genetische modificaties.

Mouse Genome engineering behulp Designer Nucleasen

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Cel-autonome functies van genen in de hersenen kunnen worden bestudeerd door het induceren van verlies of winst van functie in dunbevolkte van cellen. Hier beschrijven we in utero electroporation om te Cre recombinase leveren in dunbevolkte corticale neuronen met floxed genen te ontwikkelen om te leiden tot verlies van functie in vivo.

Cre-lox recombinatie bij muis hersenschors via In Utero Electroporation inducerende

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van een levensvatbare vrouwelijke muizenmodel met niet-Random X-chromosoom inactivatie, dat wil zeggen, de moederlijke erfelijke X-chromosoom is inactief in 100% van de cellen. We beschrijven ook een protocol om de haalbaarheid, tolerantie, en de veiligheid van farmacologische reactivering van het inactieve X-chromosoom in vivo te testen.

Een niet-willekeurig muis model voor farmacologische reactivering van Mecp2 op het inactieve X-chromosoom

Dit protocol beschrijft micro-injectie en in vivo elektroporatie voor regionaal beperkte CRISPR-gemedieerde genoombewerking in de eileider van de muis.

Somatische genoom-engineered muismodellen met behulp van in vivo micro-injectie en elektroporatie

Leer hoe je een transgen muismodel gebruikt voor inductieve expressie van EGFP-KASH2 in cerebellaire Purkinje-cellen. Deze methode verstoort LINC-complexen en onderzoekt nucleaire positionering in vivo.

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Meer video's verkennen