Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Het algemene doel van dit experiment is om de bruikbaarheid van een transgenisch muismodel te illustreren, waardoor de induceerbare en gerichte expressie van een fluorescentie-gelabelde EGFP-cache, twee peptide in vivo mogelijk is, en de resulterende verstoring van endogene link-complexen. In dit experiment zal de expressie van fluorescentie-gelabelde cache twee worden gericht op cerebelleuze Perkin-cellen. Deze genetische aanpak kan sleutelvragen beantwoorden over de rol van link-complexen bij nucleaire positionering in verschillende weefsels.

De induceerbare en gerichte expressie van E-G-F-P-K twee heeft verschillende voordelen. Ten eerste vereist het een enkele kweekregeling van cay-muizen met een bestaande cruise-stam. Ten tweede omzeilt deze aanpak de perinatale ality die wordt waargenomen in muismodellen van germline mutaties van linkcomplexcomponenten.

Ten slotte maakt deze methode het mogelijk om de fysiologie van link-complexen binnen specifieke cellen of weefsels te bestuderen. In vivo. Chloe Potter, een lid van het lab, zal u de verschillende stappen laten zien die nodig zijn om E-G-F-P-K twee in cerebelleuze Burkin G-cellen te visualiseren.

Om te beginnen fokt u clac Z-muizen met PCP twee CRE-muizen om PCP twee CAG C twee-muizen te produceren, zoals beschreven in eerdere publicaties. Wanneer de resulterende pups zijn geboren, voert u genotypering uit. Om diegenen te identificeren die zowel EGFP als Cree-transgenen bevatten zoals eerder beschreven, bereidt u 50 milliliter van een 30%-sucroseoplossing in PBS voor en bewaart deze op min 20 graden Celsius tot de dag van weefseloogst op de juiste leeftijd, voert u een trans cardio-perfusie van de muizen onder anesthesie uit om de hersenweefsels voor dissectie voor te bereiden zoals beschreven in het schriftelijke protocol, plaatst u de gedissecteerde hersenen in een 10 centimeter weefselkweekplaat met 10 milliliter PBS en scheidt u het cerebellum van de cerebra.

Gebruik vervolgens een scalpel om het cerebellum in het sagittale vlak te dissecteren en breng de secties over in een 30%-sucroseoplossing en bewaar deze een nacht bij vier graden Celsius. Bereid een slurry van droog ijs en twee methylbutaan voor. Laat de temperatuur van het bad vijf minuten gelijkmatig worden.

Vul vervolgens een cryo-vorm met OCT-compound en plaats de ene helft van het gedissecteerde cerebellum in de mal met behulp van een dissectiemicroscoop en een paar pincetten. Positioneer het cerebellum zodat het bi-gedisseceerde oppervlak dat zich dicht bij de middenlijn van het cerebellum bevindt, naar boven in de mal gericht is. Breng vervolgens de cryo-mal gedurende vijf minuten in de droog ijs slurry totdat het OCT-compound een vaste witte matrix rond het weefselspecimen heeft gevormd.

Bewaar het ingebedde specimen op min 20 graden Celsius tot het nodig is. Label voorbehandelde polylysine-slides voor het verzamelen van weefselsecties en monteer het blok cerebelleus weefsel op de weefselhouder met vers OCT. Zodra het blok stevig is bevestigd, monteer de weefselhouder en scheer 40 micrometer plakken om overtollig OCT te verwijderen totdat het weefsel is bereikt.

Stel de dikte in op 15 micrometer en verzamel de secties door voorzichtig contact te maken met de OCT-sectie met De polylysine gecoate kant van de slide. Bewaar de weefselsecties op min 20 graden Celsius tot u verder gaat met kleuring en beeldvorming. Wanneer u klaar bent om door te gaan, ontdooit u de cerebelleuze secties in het donker om vervaging van de fluorescente eiwitten te voorkomen.

Gebruik een hydrofobe barrièrepen om een rechthoek te tekenen rond de omtrek van de weefselsecties. Voeg ongeveer 500 microliter 4% paraform aldehyde toe aan de secties gedurende vijf minuten om het weefsel te postfixeren. Gebruik vervolgens een vacuüm om het fixeermiddel te aspireren, wees vooral voorzichtig om de weefselsecties niet te verstoren met een pipette.

Breng voorzichtig PBS op de slide zonder de weefselsecties te verstoren. Na vijf minuten gebruikt u de vacuüm meer pipette om het vloeibaar voorzichtig te verwijderen, herhaal de PBS-spoeling in totaal drie keer. Voeg vervolgens ongeveer 500 microliter blokkeringsoplossing toe aan de slides en incubeer ze gedurende 10 minuten.

Verwijder en vervang vervolgens de blokkeringsoplossing met dezelfde oplossing die een tot 300 verdunning bevat van cal-bindende of nesin twee antilichamen. Verwijder vervolgens de antilichaamoplossing en spoel de slides drie keer met PB S. Incubeer de slides gedurende één uur op kamertemperatuur in het donker.

Bereid vervolgens een tot 1000 verdunning van anti-US Alexa vloer 5 94 voor de cow binding gelabelde slides en anti Alexa Fluor 5 94 voor de Nesprin twee gelabelde slides in de blokkeringsoplossing en bewaar de oplossingen in het donker tot ze nodig zijn. Verwijder voorzichtig de laatste PBS-spoeling en bedek de secties gedurende één uur in het donker met de verdunde secundaire antilichamen. Verwijder vervolgens de secundaire antilichaamoplossing.

Breng vervolgens een nucleaire kleurstof aan zoals DPI bij 300 nanomolar in PBS gedurende vijf minuten. Spoel de secties daarna nog twee keer in PBS. Verwijder zoveel mogelijk PBS-oplossing en bedek de weefselsectie met één druppel montagemedium.

Plaats een glazen dekglas boven de weefselsectie en vermijd luchtbellen en laat het 15 tot 30 minuten op kamertemperatuur in het donker staan. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop om de antilichaamkleuring en fluorescente eiwitten te visualiseren. Gebruik voor cerebelleuze plakken een 20 x of 40 x objectief.

Om de E-G-F-P-C twee nucleaire randen te bekijken zoals hier getoond, kan E-G-F-P-C twee direct worden gevisualiseerd in cerebelleuze plakken in het Fitzy-kanaal. Bovendien bevestigt de colocalisatie van EGFP met cow-binding, die specifiek Perkin-cellen labelt, dat E-G-F-P-C twee-expressie beperkt is tot perkin-cellen binnen Perkin-cellen. EGFP cache twee is gericht op de nucleaire envelop